Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения

Северо-американский вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs) и его применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области здоровья животных и направлено на инфекционные клоны кДНК вирусов с РНК положительной полярности, на новые РНК-вирусы и их модифицированные живые формы и на конструирование вакцин, в частности свиных вакцин, с использованием таких клонов кДНК.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS) характеризуется выкидышами, мертворождениями и другими репродуктивными проблемами у свиноматок и подсвинков, а также респираторным заболеванием у молодых свиней. Возбудителем является вирус PRRS (PRRSV), представитель семейства Arteriviridae и порядка Nidovirales. Нидовирусы представляют собой оболочечные вирусы, имеющие геномы, состоящие из одной цепи РНК положительной полярности. Геномная РНК вирусов с РНК положительной полярности выполняет двойную роль: и в хранении, и в экспрессии генетической информации. У нидовирусов в репликации или транскрипции не участвует ДНК. Неструктурные белки транслируются непосредственно от геномной РНК нидовирусов в виде больших полипротеинов и впоследствии расщепляются вирусными протеазами на дискретные функциональные белки. От генома синтезируется 3′-котерминальный гнездовой набор субгеномных РНК (сгРНК), и они используются в качестве матричных РНК для трансляции структурных белков. Таким образом, репродукция нидовирусной геномной РНК представляет собой комбинированный процесс репликации генома и синтеза сгРНК.

В конце 1980-х гг. почти одновременно возникли два отличных генотипа вируса: один в Северной Америке, а другой в Европе. Вирус PRRS в настоящее время является эндемичным почти во всех свиноводческих странах, и считается одним из самых экономически важных заболеваний, влияющих на мировое свиноводство. Кроме того, высоковирулентные генотипы были выделены в Китае и окружающих странах, и такие генотипы в основном являются родственными северо-американским генотипам.

Несмотря на значительные успехи в понимании биологии PRRSV, контроль над вирусом остается сложным. Вакцинация животных в полевых условиях оказалась главным образом неэффективной. PRRS обычно вновь появляется в иммунизированных стадах, и большинство кампаний по вакцинации против PRRSV на фермах в конечном счете не позволили контролировать заболевание.

Без какого-либо ограничения теорией, инфекция свиней PRRSV дикого типа или их вакцинация живой аттенуированной формой этого патогена, к сожалению, вызывает лишь обильную продукцию ненейтрализующих антител. На протяжении данного интервала времени, например, образуются лишь ограниченные количества клеток, секретирующих интерферон (IFN)-γ. Таким образом, PRRSV, по-видимому, по своей природе стимулирует несбалансированный иммунный ответ, отличающийся стабильно высоким гуморальным (основанным на антителах) иммунитетом и изменчивым и ограниченным, но потенциально защитным Т-хелпер (Th) 1-подобным ответом IFN-γ. Одной характеристикой инфекции PRRSV, которая наиболее вероятно способствует несбалансированному развитию адаптивного иммунитета, является недостаток адекватного врожденного иммунного ответа. Обычно клетки, инфицированные вирусом, секретируют интерферон «IFN» типа I (включающий IFN-α и IFN-β), который защищает соседние клетки от инфекции. Кроме того, высвобожденный IFN типа I взаимодействует с субпопуляцией «наивных» Т-клеток для стимуляции их превращения в специфичные к вирусу клетки, секретирующие IFN типа II (IFN)-γ. Напротив, ответ IFN-α свиней на воздействие PRRSV практически отсутствует. Такая неэффективная стимуляция продукции IFN-α патогеном, как ожидается, будет иметь значительное влияние на природу адаптивного иммунного ответа хозяина, поскольку IFN-α повышает экпрессию гена IFN-γ. Соответственно, первый цитокин контролирует основной путь, который стимулирует развитие адаптивного иммунитета, а именно опосредованные Т-клетками ответы IFN-γ и пиковые противовирусные иммунные защитные механизмы.

В данном отношении стало очевидным, что предполагаемая связь между врожденным и адаптивным иммунитетом при вирусных инфекциях происходит посредством специфического типа дендритных клеток, которые обладают способностью продуцировать большие количества интеферона типа I и которые играют решающую роль в поляризации функции Т-клеток. Конкретно, редкий, но примечательный тип дендритных клеток, плазмацитоидные дендритные клетки (PDC), также известные как естественные клетки, продуцирующие IFN-α/β, играет решающую роль в противовирусном иммунитете посредством их способности вызывать дифференциацию «наивных» Т-клеток в клетки, секретирующие IFN-γ. Несмотря на их редкость, PDC являются чрезвычайно сильными продуцентами IFN-α, причем каждая клетка способна продуцировать 3-10 пг IFN-α в ответ на вирус. В отличие от этого, моноциты продуцируют в 5-10 раз меньше IFN-α в расчете на клетку. Были описаны фенотип и некоторые биологические свойства PDC свиней (Summerfield et al., 2003, Immunology 110:440). В недавних исследованиях определили, что PRRSV не стимулирует секрецию IFN-α PDC свиней (Calzada et al., 2010, Veterinary Immunology and Immunopathology 135:20).

Данный факт в сочетании с наблюдением того, что IFN-α, добавленный экзогенно во время вакцинации, улучшал интенсивность ответа IFN-γ, специфичного в отношении PRRSV (W.A. Meier et al., Vet. Immunol. Immunopath. 102, pp 299-314, 2004), подчеркивает решающую роль, которую играет IFN-α во время инфекции свиней этим вирусом. Принимая во внимание очевидную решающую роль IFN-α при развитии защитного иммунитета, важно определить способность разных штаммов вируса PRRS стимулировать и/или ингибировать продукцию IFN-α. Соответственно, существует острая необходимость в новых и улучшенных модифицированных живых вакцинах для защиты против PRRS. Как описано ниже, очевидно, что вирусы, происходящие из нового инфекционного клона кДНК, pCMV-S-P129-PK, и других, имеют другой фенотип, чем вирус Р129 дикого типа или два модифицированных живых вакцинных вируса PRRS вакцин, имеющихся в продаже. Без какого-либо ограничения теорией, согласно настоящему изобретению предложены вакцины, которые способствуют иммунному ответу на основе клеток против вируса и характеризуют новое и эффективное поколение PRRS вакцин.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом воплощении согласно настоящему изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, включающая последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую вирус PRRS, который генетически модифицирован таким образом, что в качестве вакцины он вызывает эффективный иммунозащитный ответ против вируса PRRS у свиней. В определенных аспектах согласно изобретению предложена последовательность ДНК, как изложено в данной заявке, включающая SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, или последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную идентичность с ней, предпочтительно 80%-ную идентичность с ней и более предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность с ней.

В определенных воплощениях согласно изобретению предложена плазмида, которая включает выделенную полинуклеотидную молекулу, как изложено в данной заявке, и промотор, способный транскрибировать полинуклеотидную молекулу в подходящей клетке-хозяине. В другом воплощении приведенная в данной заявке последовательность плазмиды, кодирующая северо-американский или китайский PRRS, дополнительно кодирует один или более чем один детектируемый гетерологичный антигенный эпитоп. Согласно настоящему изобретению предложена трансфицированная клетка-хозяин, которая включает изложенную в данной заявке плазмиду.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена вакцина для защиты свиньи от инфекции вирусом PRRS. Вакцина может включать северо-американский или китайский вирус PRRS, кодируемый инфекционной молекулой РНК, инфекционную молекулу РНК или плазмиду, причем каждая(ый) из них кодируется выделенной полинуклеотидной молекулой, как она изложена в данной заявке. В еще одном аспекте вакцина включает вирусный вектор, включающий приведенный в данной заявке полинуклеотид. Изложенная в данной заявке вакцина возможно может включать приемлемый для ветеринарного применения носитель вакцины. В одном важном аспекте вакцина имеет пониженный эффект ингибирования интерферона-α по сравнению с вирусом PRRS Р129 дикого типа (см. АТСС (Американская коллекция типовых культур) 203488, 203489, патент США №6500662).

В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен диагностический набор, включающий полинуклеотидные молекулы, которые различают (так называемый анализ DIVA (дифференциация инфицированных и вакцинированных животных)) свиней, инфицированных естественным путем полевым штаммом вируса PRRS, и свиней, вакцинированных изложенной в данной заявке модифицированной живой вакциной.

В других воплощениях согласно изобретению предложен способ защиты свиньи от инфекции штаммом вируса PRRS, включающий введение животному иммуногенно защитного количества вакцины согласно изложенной в данной заявке формуле изобретения.

Дополнительные и предпочтительные воплощения изобретения включают выделенный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS) или кодирующую его полинуклеотидную последовательность, где белок, кодируемый ORF1a (открытая рамка считывания 1а), выбран из группы, состоящей из тех белков, которые содержат любую из следующих аминокислотных последовательностей, где подчеркнутые остатки, как считается, являются новыми: AMANVYD (SEQ ID NO: 9); IGHNAVM (SEQ ID NO: 12); TVPDGNC (SEQ ID NO: 15); CWWYLFD (SEQ ID NO: 18); HGVHGKY (SEQ ID NO: 21); AAKVDQY (SEQ ID NO: 24); PSATDTS (SEQ ID NO: 27); LNSLLSK (SEQ ID NO: 30); APMCQDE (SEQ ID NO: 33); CAPIGMD (SEQ ID NO: 36); PKVAKVS (SEQ ID NO: 39); AGEIVGV (SEQ ID NO: 42); ADFNPEK (SEQ ID NO: 45) и QTPILGR (SEQ ID NO: 48). В другом предпочтительном воплощении изобретения согласно изобретению предложен выделенный североамериканский или китайский PRRS, который содержит любую из идентифицированных выше последовательностей в пределах белка, кодируемого ORF1a, включая любые комбинации (2, 3, 4… вплоть до 17) этих идентифицированных последовательностей.

Согласно изобретению также предложен выделенный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), где его белок, кодируемый ORF1a, выбран из группы, состоящей из тех аминокислотных последовательностей, которые содержат любую из: ANV (см. SEQ ID NO: 9); HNA (см. SEQ ID NO: 12); PDG (см. SEQ ID NO: 15); WYL (см. SEQ ID NO: 18); VHG (см. SEQ ID NO: 21); KVD (см. SEQ ID NO: 24); ATD (см. SEQ ID NO: 27); SLL (см. SEQ ID NO: 30); MCQ (см. SEQ ID NO: 33); PTG (см. SEQ ID NO: 36); VAK (см. SEQ ID NO: 39); EIV (см. SEQ ID NO: 42); FNP (см. SEQ ID NO: 45) и PIL (см. SEQ ID NO: 48), включая любые комбинации (2, 3, 4… вплоть до 17) этих идентифицированных последовательностей.

В другом предпочтительном воплощении согласно изобретению предложен выделенный северо-американский или китайский вирус PRRS, где независимо от идентичности любых других специфических положений нуклеотидной или аминокислотной последовательности в любой точке в полинуклеотиде, кодирующем вирус, или в белках, кодируемых им, вирусный белок ORF1a содержит:

(а) любую из следующих специфических аминокислот в определенных последовательностях:

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислоту D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ IDNO: 15);

аминокислоту Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислоту Н в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21);

аминокислоту V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислоту Т в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислоту L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислоту С в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33);

аминокислоту Т в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислоту А в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39);

аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности EIV (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45) и

аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 48) с включением любых комбинаций (2, 3, 4… вплоть до 17) этих идентифицированных последовательностей, или

(б) содержит указанную специфическую подчеркнутую одиночную аминокислоту в определенных последовательностях пептида ORF1a из 3 остатков любых других северо-американских или китайских вирусов PRRS, которые соответствуют последовательностям из 3 остатков, как определено выше, принимая во внимание то, что указанные другие специфические аминокислотные последовательности из 3 остатков могут демонстрировать одну или две дополнительные аминокислотные замены, но все еще распознаваться как соответствующие последовательностям, определенным выше. Для целей данного воплощения изобретения термин «соответствующий» означает то, что родственные последовательности могут быть оптимально выровнены с использованием алгоритма BLOSUM, как описано в Henikoff et al. Proc Natl. Acad. Sci., USA, 89, pp.10915-10919, 1992.

В другом предпочтительном воплощении изобретения предложен выделенный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), где его белок, кодируемый ORF1a, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит одну или более чем одну из вариаций (а), (б), (в) и (г), где каждая указанная вариация определена следующим образом:

вариация (а):

аминокислота N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислота N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислота D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ ID NO: 15);

аминокислота Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислота H в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21) или любое подмножество вариации (а);

вариация (б):

аминокислота V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислота T в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислота L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислота C в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33) или любое подмножество вариации (б);

вариация (в):

аминокислота T в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислота A в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39) или любое подмножество вариации (в); и

вариация (г),

аминокислота I в пределах аминокислотной последовательности EIV (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислота N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45);

и аминокислота I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 20) или любое подмножество ее вариации (г).

Такие вирусы PRRS могут дополнительно содержать две или более чем две из пяти аминокислотных последовательностей, идентифицированных в вариации (а), и/или две или более чем две из четырех аминокислотных последовательностей, идентифицированных в вариации (б), и/или две аминокислотные последовательности, идентифицированные в вариации (в), и/или две или более чем две из трех аминокислотных последовательностей, идентифицированных в вариации (г).

Согласно настоящему изобретению также предложена плазмида, способная непосредственно трансфицировать подходящую клетку-хозяина и экспрессировать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS) из подходящей клетки-хозяина, трансфицированной таким образом, причем плазмида содержит: (а) последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую вирус PRRS, и (б) промотор, способный транскрибировать указанную инфекционную молекулу РНК, где белок, кодируемый ORF1a указанного вируса, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит:

(1) аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислоту D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ ID NO: 15),

аминокислоту Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислоту Н в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21) или любое их подмножество; и/или

(2) аминокислоту V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислоту T в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислоту L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислоту C в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33) или любое их подмножество; и/или

(3) аминокислоту T в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислоту A в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39) или любое их подмножество; и/или

(4) аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности EIV (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45)

и аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 48) или любое их подмножество.

Следует иметь в виду, что ORF1a кодирует полипротеин, имеющий протеазную функцию, a ORF1b кодирует полипротеин, имеющий репликазную (РНК-полимераза) и хеликазную функции. Дополнительную информацию относительно функций белков, кодируемых разными ORF (открытыми рамками считывания) PRRS можно найти, например, в патенте США №7132106. См. также патент США №7544362 относительно функции ORF7 и других открытых рамок считывания. Как было бы понятно в данной области, ожидается, что белки, кодируемые ORF1, имеют дополнительные функции, известные и неизвестные, и новые аминокислотные замены, полезные при использовании настоящего изобретения, не ограничиваются их эффектами на какую-либо одну специфическую функцию белков, кодируемых ORF1.

В других предпочтительных воплощениях указанная плазмида содержит промотор, который представляет собой эукариотический промотор, способный обеспечивать инициацию ДНК в эукариотических клетках-мишенях, или прокариотический или фаговый промотор, способный управлять транскрипцией плазмиды in vitro. Согласно изобретению аналогичным образом предложен способ генерирования вируса PRRS, включающий трансфицирование подходящей клетки-хозяина соответствующей плазмидой и получение вируса PRRS, генерированного трансфицированной клеткой.

Соответственно, в конкретном и предпочтительном воплощении согласно изобретению предложена выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую северо-американский вирус PRRS, где указанная последовательность ДНК выбрана из группы, состоящей из:

(а) SEQ ID NO: 6;

(б) последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью ДНК (а), где белок, кодируемый ее ORF1a, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит:

из группы (б) (1):

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислоту D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ ID NO: 15);

аминокислоту Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислоту H в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21) или любое их подмножество; и/или

из группы (б) (2):

аминокислоту V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислоту T в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислоту L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислоту C в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33) или любое их подмножество; и/или

из группы (б) (3):

аминокислоту T в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислоту A в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39) или любое их подмножество; и/или

из группы (б) (4):

аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности EIV (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45)

и аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 20) или любое их подмножество; и

(в) последовательности ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности ДНК (а) или (б) при очень жестких условиях, которые включают гибридизацию с ДНК, связанной с фильтром, в 0,5 М NaHPO₄, 7% SDS (додецилсульфат натрия), 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) при 65°C и промывку в 0,1 SSC (хлорид натрия/цитрат натрия)/0,1% SDS при 68°C.

Согласно изобретению также предложены клетки-хозяева, трансфицированные полинуклеотидными молекулами, и предложены вакцины для защиты свиньи против инфекции вирусом PRRS, причем вакцина содержит:

(а) генетически модифицированный северо-американский вирус PRRS, кодируемый такими упомянутыми выше полинуклеотидными молекулами, или (б) указанную инфекционную молекулу, или (в) указанную полинуклетидную молекулу в виде плазмиды, или (г) вирусный вектор, содержащий указанную полинуклеотидную молекулу, где вирус PRRS способен вызывать эффективный иммунозащитный ответ против инфекции вирусом PRRS, в количестве, эффективном для выработки иммунной защиты против инфекции, и подходящий для ветеринарного применения носитель.

Согласно изобретению также предложены полинуклеотидные последовательности РНК, соответствующие (т.е. благодаря наличию комплементарных последовательностей кодирующих оснований):

(а) последовательности ДНК SEQ ID NO: 6;

(б) последовательности ДНК, которая имеет по меньшей мере 85%-ную идентичность с последовательностью ДНК (а), где белок, кодируемый ее ORF1a, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит любую из следующих и любую комбинацию любых из следующих:

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности ANV (см. SEQ ID NO: 9);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности HNA (см. SEQ ID NO: 12);

аминокислоту D в пределах аминокислотной последовательности PDG (см. SEQ ID NO: 15);

аминокислоту Y в пределах аминокислотной последовательности WYL (см. SEQ ID NO: 18);

аминокислоту Н в пределах аминокислотной последовательности VHG (см. SEQ ID NO: 21);

аминокислоту V в пределах аминокислотной последовательности KVD (см. SEQ ID NO: 24);

аминокислоту T в пределах аминокислотной последовательности ATD (см. SEQ ID NO: 27);

аминокислоту L в пределах аминокислотной последовательности SLL (см. SEQ ID NO: 30);

аминокислоту C в пределах аминокислотной последовательности MCQ (см. SEQ ID NO: 33);

аминокислоту Т в пределах аминокислотной последовательности PTG (см. SEQ ID NO: 36);

аминокислоту А в пределах аминокислотной последовательности VAK (см. SEQ ID NO: 39);

аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности EIN (см. SEQ ID NO: 42);

аминокислоту N в пределах аминокислотной последовательности FNP (см. SEQ ID NO: 45)

и аминокислоту I в пределах аминокислотной последовательности PIL (см. SEQ ID NO: 20); или

(в) последовательности ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности ДНК (а) или (б) при очень жестких условиях, которые включают гибридизацию с ДНК, связанной с фильтром, в 0,5 М NaHPO₄, 7% SDS, 1 мМ EDTA при 65°C и промывку в 0,1 SSC/0,1% SDS при 68°C.

Соответственно, согласно изобретению также предложены диагностические наборы, содержащие полинуклеотидные молекулы, которые различают свиней, инфицированных естественным путем полевым штаммом вируса PRRS, и свиней, вакцинированных вакцинами по изобретению, причем вакцины (вирусы) предпочтительно демонстрируют пониженный эффект ингибирования интерферона-α по сравнению с вирусом PRRS Р129 дикого типа (SEQ ID NO: 5).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ТАБЛИЦ И ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

В Таблице 1 показаны инфекционные клоны кДНК и соответствующие вирусы, которые были получены трансфекцией в клетки PK-9.

В Таблице 2 показан эффект ингибирования интерферона-α вируса PRRS дикого типа и производными, адаптированными для роста в культуре клеток.

В Таблице 3 описан эффект ингибирования интерферона-α вируса PRRS Р129 дикого типа и его генетически сконструированными производными, адаптированными для роста в клетках PK-9, экспрессирующих CD163.

В Таблице 4 показан пониженный эффект ингибирования интерферона-α вирусов P129-PK-FL и P129-PK-d43/44 по сравнению с вирусом Р129 дикого типа и вакцинами Ingelvac PRRS.

В Таблице 5 проиллюстрирована схема исследования, проведенного для оценки безопасности и эффективности вакцинных вирусов.

В Таблице 6 показаны все отличия нуклеотидов и обусловленные ими отличия аминокислот между пассажем 0 Р129 и пассажем 17 P129-PK-FL по положению в геноме.

В Таблице 7 показано обобщение различий нуклеотидов и аминокислот между пассажем 0 Р129 и пассажем 17 P129-PK-FL по вирусному белку.

В Таблице 8 показаны все отличия нуклеотидов и обусловленные ими отличия аминокислот между геномам PRRSV, обнаруженными в инфекционных клонах кДНК pCMV-S-P129 и pCMV-S-P129-PK17-FL по положению в геноме.

В Таблицах 9 и 10 показаны аминокислотные замены, способствующие фенотипу вируса пассажа 52 (SEQ ID NO: 6).

На Фиг.1 показаны ректальные температуры после вакцинации.

На Фиг.2 показаны ректальные температуры после заражения вирулентным PRRSV NADC20.

На Фиг.3 показаны массы тела после вакцинации и после заражения.

На Фиг.4 показаны данные после заражения в отношении процентной доли легких с поражениями PRRS.

На Фиг.5 показаны баллы оценки легких (LAS) после заражения в отношении тяжести наблюдаемых поражений.

Фиг.6 представляет собой гистограмму, на которой проиллюстрированы уровни антител против PRRSV в сыворотке после вакцинации и после заражения (отношения S/P (образец/положительный контроль) ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ)).

Фиг.7 является графическим представлением вирусной нагрузки в сыворотке после заражения (log TCID50 (50%-ная инфекционная доза для тканевой культуры)/мл на клетках РАМ).

Фиг.8 представляет собой графическое представление способов, используемых для получения вакцин, включающих SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6, как описано в данной заявке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

В SEQ ID NO: 1 приведен полный геном пассажа 17 P129-PK-FL.

В SEQ ID NO: 2 приведен полный геном пассажа 17 P129-PK-d43/44.

В SEQ ID NO: 3 приведен полный геном пассажа 24 P129-PK-FL.

В SEQ ID NO: 4 приведен полный геном пассажа 34 P129-PK-d43/44.

В SEQ ID NO: 5 приведен полный геном пассажа 0 Р129.

В SEQ ID NO: 6 приведен полный геном пассажа 52 Р129.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения единственные формы включают множественные ссылки, если контекст ясно не диктует иное. Таким образом, например, ссылки на «способ» включают один или более чем один способ и/или этап типа, описанного в данной заявке, которые будут очевидны специалистам в данной области при чтении данного описания и так далее.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют те же самые значения, как они обычно понимаются специалистом в области техники, к которой принадлежит это изобретение. Несмотря на то, что при использовании или испытании изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в данной заявке, далее описываются предпочтительные способы и материалы.

При использовании настоящего изобретения, если конкретно не указано противоположное, будут применяться традиционные способы вирусологии, иммунологии, микробиологии, молекулярной биологии и технологии рекомбинантных ДНК, хорошо известные специалисту в данной области техники, многие из которых описаны ниже с целью иллюстрации. Такие методики подробно описаны в литературе. См., например, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

Термин «северо-американский вирус PRRS» означает любой вирус PRRS, имеющий генетические характеристики, ассоциированные с изолятом северо-американского вируса PRRS, такого как вирус PRRS, который был впервые выделен в Соединенных Штатах приблизительно в начале 1990-х гг. (см., например, Collins, J.Е., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4: 117-126); изолят MN-1b североамериканского вируса PRRS (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6: 293-296); штамм PRRS Quebec IAF-exp91 (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140: 1405-1418) и изолят VR 2385 северо-американского вируса PRRS (Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 1795-1801), но не ограничиваясь ими. Генетические характеристики относятся к сходству геномных нуклеотидных последовательностей и сходству аминокислотных последовательностей, общих для штаммов северо-американского вируса PRRS. Штаммы китайского вируса PRRS обычно показывают примерно 80-93%-ное сходство нуклеотидной последовательности с северо-американскими штаммами.

Термин «европейский вирус PRRS» относится к любому штамму вируса PRRS, имеющему генетические характеристики, ассоциированные с вирусом PRRS, который был впервые выделен в Европе приблизительно в 1991 году (см., например, Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13: 121-130). «Европейский вирус PRRS» в данной области иногда также называют «вирусом Lelystad».

«Эффективный иммунозащитный ответ», «иммунная защита» и подобные термины для целей настоящего изобретения означают иммунный ответ, который направлен против одного или более чем одного антигенного эпитопа патогена для защиты вакцинированного животного от инфекции патогеном. Для целей настоящего изобретения защита против инфекции патогеном включает не только абсолютное предупреждение инфекции, но также любое детектируемое снижение степени или уровня инфекции патогеном, или любое детектируемое снижение тяжести заболевания или любого симптома или состояния, возникающего в результате инфекции патогеном, у вакцинированного животного по сравнению с невакцинированным инфицированным животным. Эффективный иммунозащитный ответ может быть индуцирован у животных, которые ранее не были инфицированы патогеном и/или не являются инфицированными патогеном во время вакцинации. Эффективный иммунозащитный ответ также может быть индуцирован у животного, уже инфицированного патогеном во время вакцинации.

Генетически модифицированный вирус PRRS является «аттенуированным», если он менее вирулентен, чем его немодифицированный родительский штамм. Штамм является «менее вирулентным», если он показывает статистически значимое снижение одного или более чем одного параметра, определяющего тяжесть заболевания. Такие параметры могут включать уровень виремии, лихорадку, тяжесть респираторного дистресс-синдрома, тяжесть репродуктивных симптомов или количество или тяжесть поражений легких и так далее.

«Клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию вируса PRRS» означает клетку, способную генерировать инфекционный PRRS, будучи инфицированной вирусом по изобретению. Такие клетки включают клетки линии моноцитов/макрофагов свиней, такие как свиные альвеолярные клетки-макрофаги и производные, клетки почки обезьяны МА-104 и производные, такие как клетки MARC-145, и клетки, трансфицированные рецептором вируса PRRS. Термин «клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию вируса PRRS» также может включать клетки живой свиньи.

Термин «открытая рамка считывания» или «ORF» в том виде, как он используется в данной заявке, означает минимальную нуклеотидную последовательность, требующуюся для кодирования определенного белка вируса PRRS без промежуточного стоп-кодона.

Термины «свиной» и «свинья» используются в данной заявке взаимозаменяемо и относятся к любому животному, которое является членом семейства Suidae, такому как, например, свинья. Термин «вирус PRRS» в том виде, как он используется в данной заявке, если не указано иное, означает любой штамм либо северо-американских, либо европейских вирусов PRRS.

«PRRS» охватывает симптомы заболевания у свиньи, вызванного инфекцией вируса PRRS. Примеры таких симптомов включают, но не ограничиваются ими, лихорадку, выкидыш у беременных самок, респираторный дистресс-синдром, поражения легких, потерю аппетита и падеж молодых свиней. Вирус PRRS, который «не способен вызвать PRRS», в том виде, как он используется в данной заявке, относится к вирусу, который может инфицировать свинью, но который не вызывает каких-либо симптомов заболевания, обычно ассоциированных с инфекций PRRS у свиньи.

Термины «N-белок» или «ORF7» PRRSV в том виде, как они используются в данной заявке, определяются как полипептид, который кодируется ORF7 как европейского, так и северо-американского генотипов вируса PRRS. Примерами конкретных изотипов N-белка, которые известны в настоящее время, являются: полипептид из 123 аминокислот изолята VR2322 североамериканского PRRS прототипа, представленный в Genbank под номером доступа PRU87392, и N-белок из 128 остатков изолята Lelystad европейского PRRS прототипа, представленный в Genbank под номером доступа А26843.

Термин «область NLS-1 N-белка PRRSV» или «область NLS-1 ORF7 PRRSV» относится к сигналу ядерной локализации «pat4» или «nuc1» (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003), содержащему четыре расположенные рядом основные аминокислоты (лизин или аргинин) или три основных остатка и гистидин или пролин, расположенные в пределах приблизительно первых 15 N-концевых остатков зрелого N-белка. В качестве примера, последовательностью области NLS-1 VR2332 является KRKK, и она локализована в остатках 9-12, тогда как пследовательностью изолята Lelystad является КККК, и она локализована в остатках 10-13 N-белка.

Термин «область NLS-2 N-белка PRRSV» или «область NLS-2 ORF7 PRRSV» относится ко второму сигналу ядерной локализации в пределах N-белка, который может принимать одну из двух форм. У северо-американских вирусов PRRS NLS-2 имеет структуру, которую авторы изобретения обозначили как мотив «pat8», который начинается с пролина и в пределах трех остатков сопровождается последовательностью из пяти остатков, содержащей по меньшей мере три основных остатка (K или R) из пяти (незначительная модификация мотива «pat7» или «nuc2», описанная Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). В качестве примера, такая последовательность локализована в остатках 41-47 N-белка изолята VR2332 северо-американского PRRSV и представлена последовательностью Р…K. В европейских вирусах PRRS NLS-2 имеет мотив «pat4» или «nuc1», который представляет собой непрерывный участок из четырех основных аминокислот или трех основных остатков, ассоциированных с гистидином или пролином (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). NLS-2 изолята Lelystad европейского PRRSV локализован в остатках 47-50 и представлен последовательностью K…K.

«Область NoLS N-белка PRRSV» или «область NoLS ORF7 PRRSV» относится к сигналу ядрышковой локализации, имеющему общую длину примерно 32 аминокислоты и включающему область NLS-2 вблизи его N-конца. В качестве примера, область NoLS VR2332 локализована в остатках 41-72 и представлена последовательностью P…R (Rowland & Yoo, 2003), и соответствующая последовательность изолята Lelystad локализована в остатках42-73 и представлена последовательностью P…R.

Термин «трансфицированная клетка-хозяин» означает практически любую клетку-хозяина, как она описана в патенте США №5600662, которая при трансфицировании РНК вируса PRRS может продуцировать по меньшей мере первое поколение вирионов PRRS.

Термин «инфекционная молекула ДНК» для целей настоящего изобретения представляет собой молекулу ДНК, которая кодирует необходимые элементы для поддержки репликации, транскрипции и трансляции в функциональный вирион из подходящей клетки-хозяина.

Подобным образом, термин «выделенная полинуклеотидная молекула» относится к композиции вещества, содержащей полинуклеотидную молекулу по настоящему изобретению, очищенную до любой детектируемой степени из ее природного состояния, если такое существует.

Для целей настоящего изобретения нуклеотидная последовательность второй полинуклеотидной молекулы (либо РНК, либо ДНК) является «гомологичной» нуклеотидной последовательности первой полинуклеотидной молекулы или имеет «идентичность» с указанной первой полинуклеотидной молекулой, когда нукле