Новые модуляторы и способы их применения

Новые модуляторы и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА ЗАЯВКИ

В данной заявке заявляет приоритет предварительной заявки США 61/421157 поданной 8 декабря 2010 года и заявки PCT/US2011/050451, поданной 2 сентября 2011 года, каждая из которых включена в данную заявку посредством ссылки во всей полноте.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в ASCII формате посредством EFS-Web и включен в данную заявку посредством ссылки во всей полноте. Указанная копия ASCII, созданная 22 ноября 2011 года, называется 11200PCT.txt и имеет размер 80102 байт.

Область изобретения

Заявка в целом относится к новым композициям и способам их применения в предупреждении, лечении или облегчении гиперпролиферативных расстройств и любого их распространения, повторного проявления, рецидива или метастазов. В широком аспекте настоящее изобретение относится к применению модуляторов лигандов эфринов A (EFNA), включая анти-EFNA антитела и слитые конструкции, для лечения или профилактики опухолевых заболеваний. В особенно предпочтительных воплощениях настоящего изобретения предложено применение таких EFNA-модуляторов для иммунотерапевтического лечения злокачественных образований, включающего снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток.

Предшествующий уровень техники

Дифференцировка стволовых клеток и клеток-предшественников, а также клеточная пролиферация являются нормальными непрерывными процессами, которые действуют совместно для поддержания роста тканей во время органогенеза, а также замены клеток и восстановления большинства тканей в течение жизни всех живых организмов. Решения о дифференцировке и пролиферации часто контролируется многочисленными факторами и сигналами, которые уравновешены так, чтобы поддерживать решения относительно судьбы клеток и архитектуры тканей. Нормальная архитектура ткани в основном сохраняется клетками в ответ на сигналы микроокружения, которые регулируют деление клеток и созревание тканей. Соответственно, клеточная пролиферация и дифференцировка обычно происходит только по мере необходимости для замены поврежденных или умирающих клеток или для роста. К сожалению, нарушение клеточной пролиферации и/или дифференцировки может быть результатом множества факторов, в том числе, например, недостатка или избытка различных химических агентов, участвующих в передаче сигналов, наличия измененного микроокружения, генетических мутаций или любой их комбинации. Нарушение или какое-либо расстройство нормальной клеточной пролиферации и/или дифференцировки может привести к различным заболеваниям или расстройствам, в том числе к гиперпролиферативным расстройствам, таким как рак.

Обычные методы лечения рака включают химиотерапию, лучевую терапию, хирургию, иммунотерапию (например модификаторы биологического ответа, вакцины или терапевтические средства направленного действия) или их комбинации. К сожалению, слишком многие виды рака не отвечают или минимально отвечают на такие традиционные методы лечения, предоставляя пациентам небольшой выбор. Например, у ряда больных в случае некоторых видов рака обнаруживаются генные мутации, которые делают их нечувствительными, несмотря на общую эффективность выбранной терапии. Кроме того, в зависимости от типа рака, некоторые доступные виды лечения, такие как хирургия, не являются реальной альтернативой. Ограничения, присущие существующим терапевтическим средствам, представляющими стандарт лечения, особенно очевидны при попытке лечить пациентов, прошедших предыдущее лечение и имеющих после этого рецидивы. В таких случаях безрезультатные схемы лечения и результирующее ухудшение состояния пациента может содействовать трудноизлечимым опухолям, которые часто проявляются, как более агрессивное заболевание, которое в конечном счете оказывается неизлечимым. Несмотря на большие успехи в диагностике и лечении рака на протяжении многих лет, уровень общей выживаемости для многих солидных опухолей остается в значительной степени неизменным из-за неспособности существующих методов лечения предотвратить рецидив, повторное проявление опухоли и метастазы. Таким образом, остается проблема разработки более целенаправленной и эффективной терапии.

Одно из перспективных направлений исследований предполагает использование терапевтических средств направленного действия для поиска онкогенных "затравочных" клеток, которые, по-видимому, лежат в основе многих видов рака. Исходя из этого, в настоящее время известно, что большинство твердых тканей содержит популяции взрослых, расположенных в тканях, стволовых клеток, образующих дифференцированные клеточные типы, которые составляют большую часть этой ткани. Опухоли, образующиеся в этих тканях, также состоят из гетерогенных популяций клеток, которые также возникают из стволовых клеток, но заметно отличаются по своей общей пролиферации и организации. Хотя все чаще признается, что большинство опухолевых клеток имеют ограниченную способность к пролиферации, меньшая часть популяции раковых клеток (общеизвестная как раковые стволовые клетки или CSC) обладают исключительной способностью активно самообновляться, тем самым наделяя опухоль присущей ей способностью к возобновлению. Более конкретно, гипотеза раковых стволовых клеток предполагает, что существует отдельная подгруппа клеток (то есть CSC) в каждой опухоли (приблизительно 0,1-10%), которая способна неограниченно самообновляться и образовывать опухолевые клетки с постепенным ограничением их репликативной способности в результате дифференцировки в клетки-предшественники опухоли и затем в окончательно дифференцированные опухолевые клетки.

В последние годы стало более очевидно, что эти CSC (также известные как клетки, поддерживающие опухоль, или ТРС) могут быть более резистентными к традиционным химиотерапевтическим агентам или облучению и, таким образом, сохраняться после стандартного клинического лечения, чтобы позже стимулировать рост трудноизлечимых опухолей, вторичных опухолей и содействовать образованию метастазов. Кроме того, растущие доказательства свидетельствуют о том, что пути, регулирующие органогенез и/или самообновление расположенных в нормальных тканях стволовых клеток, разрегулированы или изменены в CSC, что приводит к непрерывному увеличению количества самообновляющихся раковых клеток и к образованию опухоли. См. в целом Al-Hajj et al., 2004, PMID: 15378087; и Dalerba et al., 2007, PMID: 17548814; каждый из которых включен в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки. Таким образом, эффективность традиционных, а также более поздних методов лечения посредством направленной доставки, по-видимому, ограничена существованием и/или появлением резистентных раковых клеток, которые способны поддерживать рак, даже несмотря на эти разнообразные методы лечения. Huff et al., European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006) и Zhou et al., Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009), каждый из которых включен в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки. Такие наблюдения подтверждены устойчивой неспособностью традиционных циторедуктивных агентов существенно увеличивать выживаемость пациентов, страдающих от солидных опухолей, а также развитием более тонкого понимания того, как опухоли растут, рецидивируют и метастазируют.Соответственно, недавние стратегии лечения опухолевых заболеваний признали важность ликвидации, уменьшения, подавления или стимуляции дифференцировки клеток, поддерживающих опухоль, с тем, чтобы уменьшить возможность повторного проявления опухоли, метастазов или рецидивов у пациента.

Усилия по разработке таких стратегий включают последние работы с использованием нетрадиционных ксенотрансплантатных (NTX) моделей, в которых образцы первичных человеческих солидных опухолей имплантировали и пассировали исключительно мышам с ослабленным иммунитетом. На многочисленных видах раковых заболеваний такие способы подтверждают существование субпопуляции клеток с уникальной способностью образовывать гетерогенные опухоли и поддерживать их рост в течение неопределенного времени. Как ранее предполагалось, работа на NTX моделях подтверждает, что идентифицированные CSC-субпопуляции опухолевых клеток являются более резистентными к циторедуктивным схемам лечения, таким как химиотерапия и лучевая терапия, что может объяснить несоответствие между показателями клинического ответа и общей выживаемостью. Кроме того, применение NTX-моделей в исследовании CSC вызвало фундаментальное изменение в разработке лекарственных средств и в доклинической оценке кандидатов в лекарственные средства, которые могут привести к CSC-нацеленной терапии, оказывающей существенное воздействие на повторное проявление опухоли и метастазирование, и, тем самым, повышая выживаемость пациентов. Несмотря на прогресс, главными проблемами являются имеющиеся технические трудности, связанные с обработкой первичной и/или ксенотрансплантатной опухолевой ткани, наряду с отсутствием экспериментальных оснований для характеристики отличительных особенностей CSC и способности к дифференцировке. Таким образом, по-прежнему сохраняется существенная потребность в селективном нацеливании на раковые стволовые клетки и разработке диагностических, профилактических или терапевтических соединений и методов, которые можно использовать в лечении, предупреждении и/или контролировании гиперпролиферативных расстройств.

Краткое изложение сущности изобретения Эти и другие цели предусмотрены настоящим изобретением, которое в широком смысле относится к способам, соединениям, композициям и изделиям, которые можно использовать в лечении EFNA-ассоциированных расстройств (например гиперпролиферативных расстройств или опухолевых заболеваний). В связи с этим в настоящем изобретении предлагаются новые модуляторы EFNA (или лиганда эфрина А), которые эффективно нацелены на опухолевые или раковые стволовые клетки и могут быть использованы для лечения пациентов, страдающих от широкого спектра злокачественных образований. Как будет обсуждаться более подробно ниже, в настоящее время имеется шесть известных лигандов эфринов А (то есть EFNA 1-6) и раскрытые модуляторы могут содержать любой один или более лиганд эфрин А или соединяться с любым одним или более лигандами эфринами А. Кроме того, в некоторых воплощения раскрытые модуляторы EFNA могут содержать любое соединение, которое распознает, конкурирует, является агонистом, является антагонистом, взаимодействует, связывается или соединяется с полипептидом EFNA, его рецептором или его геном и модулирует, регулирует, изменяет, меняет или модифицирует воздействие белка EFNA на один или более физиологических путей. Таким образом, в широком смысле настоящее изобретение относится к выделенным модуляторам EFNA. В предпочтительных воплощениях изобретение более конкретно относится к выделенным модуляторам EFNA1 или выделенным модуляторам EFNA4 (то есть модуляторам, которые содержат по меньшей мере EFNA1 или EFNA4 или соединены с ними). Кроме того, как подробно рассмотрено ниже, такие модуляторы могут быть использованы для получения фармацевтических композиций.

В отдельных воплощениях изобретения модуляторы EFNA могут содержать сам лиганд эфрин А или его фрагмент либо в выделенной форме, либо слитым, либо соединенным с другими группировками (например, Fc-EFNA, PEG-EFNA или EFNA, соединенный с группировкой, обеспечивающей направленную доставку). В других выбранных воплощениях модуляторы EFNA могут содержать антагонисты EFNA, которые в контексте настоящей заявки, означают любую конструкцию или соединение, которое распознает, конкурирует, взаимодействует, связывается или соединяется с EFNA и нейтрализует, устраняет, уменьшает, сенсибилизирует, перепрограммирует, ингибирует или контролирует рост опухолевых клеток, в том числе опухоль-инициирующих клеток. В предпочтительных воплощениях модуляторы EFNA по настоящему изобретению содержат анти-EFNA антитела или их фрагменты или их производные, которые, как было неожиданно обнаружено, останавливают, нейтрализуют, снижают, уменьшают, истощают, сдерживают, ослабляют, перепрограммируют, устраняют или иным способом ингибируют способность опухоль-инициирующих клеток размножаться, сохраняться, распространяться, пролиферировать или другим способом содействовать выживанию, повторному проявлению, регенерации и/или метастазированию опухолевых клеток. В особенно предпочтительных воплощениях антитела или иммунореактивные фрагменты могут быть соединены или конъюгированы с одним или более противораковыми агентами.

В одном воплощении модулятор EFNA может содержать гуманизированное антитело, где указанное антитело содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:157 и SEQ ID NO:161, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:159 и SEQ ID NO:163. В других предпочтительных воплощениях изобретение будет представлено в виде композиции, содержащей гуманизированное антитело, выбранное из группы, состоящей из hSC4.5, hSC4.15, hSC4.22 и hSC4.47, и фармацевтически приемлемого носителя. В другом предпочтительном воплощении модулятор EFNA может содержать антитело, которое содержит один или более CDR с Фиг.7А (SEQ ID NO:8-59 и 70-95). Предпочтительно, антитело, содержащее по меньшей мере одну CDR с Фиг.7А, включает гуманизированное антитело.

В некоторых других воплощениях изобретение включает модулятор EFNA, который снижает частоту появления опухоль-инициирующих клеток при введении субъекту. Предпочтительно уменьшение частоты появления определяют, используя анализ методом серийных разведении in vitro или in vivo. В особенно предпочтительных воплощениях такой анализ может быть выполнен с использованием анализа методом серийных разведении in vivo, включающего трансплантацию живых опухолевых клеток человека мышам с ослабленным иммунитетом. Альтернативно, анализ методом серийных разведении может быть выполнен с использованием анализа методом серийных разведении in vitro, включающего посев живых опухолевых клеток человека in vitro методом серийных разведении в условиях, поддерживающих образование колоний. В любом случае анализ, вычисление или количественное определение снижения частоты появления предпочтительно включает использование статистических параметров распределения Пуассона для обеспечения точного подсчета. Следует иметь в виду, что, хотя такие количественные методы являются предпочтительными, другие, менее трудоемкие методы, такие как проточная цитометрия или иммуногистохимия также могут быть использованы для получения нужных значений и, соответственно, рассматриваются как входящие в объем настоящего изобретения. В таких случаях снижение частоты появления можно определить, используя проточный цитометрический анализ или иммуногистохимическое обнаружение поверхностных маркеров опухолевых клеток, которыми, как известно, богаты опухоль-инициирующие клетки.

Соответственно, в другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение включает способ лечения EFNA-ассоциированного расстройства, включающий введение терапевтически эффективного количества модулятора EFNA нуждающемуся в этом субъекту, в результате чего снижается частота появления опухоль-инициирующих клеток. Кроме того, снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток предпочтительно определяют, используя анализ методом серийных разведении in vitro или in vivo.

В связи с этим следует иметь в виду, что настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того, что полипептиды EFNA (и в частности EFNA4, как описано ниже) ассоциированы с клетками, поддерживающими опухоль, (то есть раковыми стволовыми клетками), которые вовлечены в этиологию различных неоплазий. В частности, в настоящей заявке неожиданно продемонстрировано, что введение различных типичных модуляторов EFNA может опосредовать, снижать, ингибировать или ликвидировать онкогенную передачу сигналов опухоль-инициирующими клетками (то есть снижать частоту появления опухоль-инициирующих клеток). Это подавляет передачу сигналов либо посредством уменьшения, удаления, перепрограммирования или подавления опухоль-инициирующих клеток, либо посредством изменения морфологии опухолевых клеток (например индуцированной дифференцировки, разрушения ниши), что в свою очередь обеспечивает возможность более эффективного лечения EFNA-ассоциированных расстройств посредством ингибирования онкогенеза, поддержания опухоли, увеличения объема и/или метастазирования и ее повторного проявления. В других воплощениях раскрытые модуляторы могут стимулировать, поддерживать или иным образом улучшать EFNA-опосредованную передачу сигналов, что может ограничивать или задерживать рост опухоли. В других воплощениях раскрытые модуляторы могут препятствовать, подавлять или иным образом замедлять EFNA опосредованную передачу сигналов, что может способствовать росту опухоли. Кроме того, как будет обсуждаться более подробно ниже, полипептиды EFNA вовлечены в образование сил адгезии и отталкивания между клетками посредством интегрина и перегруппировки цитоскелета. Вмешательство в такие межклеточные взаимодействия с использованием новых модуляторов EFNA, описанных в данной заявке, может, таким образом, облегчать расстройство посредством более чем одного механизма (то есть сокращения опухоль-инициирующих клеток и разрушения клеточной адгезии) с обеспечением аддитивных или синергических эффектов. Также в других предпочтительных воплощениях может использоваться клеточная интернализация лигандов эфринов А для доставки модулятор-опосредованного противоракового агента. В связи с этим, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретным механизмом действия, а охватывает широкое использование раскрытых модуляторов для лечения EFNA-ассоциированных расстройств (в том числе различных неоплазий).

Таким образом, другое предпочтительное воплощение изобретения включает способ лечения EFNA-ассоциированного расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадию введения модулятора EFNA указанному субъекту. В особенно предпочтительных воплощениях модулятор EFNA соединен (например конъюгирован) с противораковым агентом. Кроме того, полезные аспекты настоящего изобретения, включая любое нарушение клеточной адгезии, и сопутствующие преимущества могут быть достигнуты независимо от того демонстрирует опухолевая ткань субъекта повышенные уровни EFNA или пониженные или уменьшенные уровни EFNA по сравнению с нормальной соседней тканью.

Как упоминалось выше и обсуждается более подробно ниже, в настоящее время известно шесть лигандов эфринов А (то есть EFNA 1-6). Очевидно, что в соответствии с настоящим изобретением раскрытые модуляторы могут быть образованы, изготовлены и/или выбраны так, чтобы вступать во взаимодействие с одним лигандом эфрином А (например EFNA4), подгруппой лигандов эфринов А (например EFNA4 и EFNA1) или всеми шестью лигандами эфринами А. Более конкретно, как описано здесь и изложено в приведенных ниже примерах, предпочтительные модуляторы, такие как антитела, могут быть получены и выбраны таким образом, чтобы они вступали во взаимодействие или связывались с доменами или эпитопами, которые экспрессируются на одном лиганде эфрине А, или с эпитопами, которые являются консервативными (по меньшей мере в некоторой степени) и представлены в некоторых или всех полипептидах EFNA (например EFNA 1 и 4 или EFNA 3 и 4). Это имеет большое значение в отношении настоящего изобретения, поскольку, как показано ниже в Примере 18, было обнаружено, что некоторые лиганды эфрины А предпочтительно экспрессируются на TIC и, в комбинации, могут служить в качестве особенно эффективных терапевтических мишеней, обеспечивающих селективное снижение частоты появления опухолевых клеток и/или истощение популяций раковых стволовых клеток.

Таким образом, в выбранном воплощении изобретение включает пан-модулятор EFNA, который иммуноспецифически соединяется с двумя или более лигандами эфринами А. В таких воплощениях выбранный модулятор может быть получен посредством иммунизации конкретным лигандом (например EFNA4) и может соединяться или в большей или меньшей степени вступать в перекрестную реакцию с различными лигандами субъекта. Соответственно, в других воплощениях настоящее изобретение включает способ лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества пан-модулятора EFNA. Другие воплощения включают способ лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества модулятора EFNA, который иммуноспецифически соединен с одним или более лигандами эфринами А.

Соответственно, в других воплощениях настоящее изобретение включает пан-модулятор EFNA. В других воплощениях настоящее изобретение включает способ лечения EFNA-ассоциированного расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадию введения пан-модулятора EFNA указанному субъекту.

Конечно следует понимать, что раскрытые модуляторы EFNA могут быть получены, изготовлены и/или выбраны так, чтобы преимущественно взаимодействовать или соединяться с одним лигандом эфрином А (например EFNA4) и демонстрировать минимальное соединение или не демонстрировать соединения с любым другим лигандом эфрином А. Соответственно, другие воплощения изобретения направлены на модуляторы EFNA, которые иммуноспецифически соединены с выбранным лигандом эфрином А и демонстрируют минимальное соединение или не демонстрируют соединения с любым другим лигандом эфрином А. В связи с этим предпочтительные воплощения, раскрытые здесь, включают способы лечения EFNA-ассоциированного расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, включающие стадию введения модулятора EFNA, где модулятор EFNA иммуноспецифически соединяется с выбранным лигандом эфрином А и по существу не вступает во взаимодействие с каким-либо другим лигандом эфрином А. Кроме того, в объем настоящего изобретения входят способы получения, изготовления и выбора таких модуляторов.

В других аспектах настоящего изобретения используется способность раскрытых модуляторов потенциально разрушать клеточные адгезивные взаимодействия с одновременным подавлением опухоль-инициирующих клеток. Такие мультиактивные модуляторы EFNA (например антагонисты EFNA) могут оказаться особенно эффективными при использовании в комбинации со стандартными противораковыми агентами или циторедуктивными агентами. Кроме того, два или более антагониста EFNA (например антитела, которые специфически связываются с двумя отдельными эпитопами на лиганде эфрине А или которые соединяются с отдельными лигандами) можно использовать в комбинации в соответствии с идеей настоящего изобретения. Кроме того, как обсуждается более подробно ниже, модуляторы EFNA по настоящему изобретению можно использовать в конъюгированном или неконъюгированном состоянии и возможно в качестве сенсибилизирующего агента в комбинации с различными химическими или биологическими противораковыми агентами.

Таким образом, другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения включает способ сенсибилизации опухоли субъекта к лечению противораковым агентом, включающий стадию введения модулятора EFNA указанному субъекту. В особенно предпочтительном аспекте изобретения модулятор EFNA конкретно приводит к снижению частоты появления опухоль-инициирующих клеток, определенной с использованием in vitro или in vivo анализа методом серийных разведении, тем самым сенсибилизируя опухоль к сопутствующему или последующему циторедуктивному воздействию.

Аналогично, так как соединения по настоящему изобретению могут приносить терапевтическую пользу через различные физиологические механизмы, настоящее изобретение также направлено на выбранные эффекторы или модуляторы, которые специально изготовлены так, чтобы использовать определенные клеточные процессы. Например, в некоторых воплощениях предпочтительный модулятор может быть сконструирован так, чтобы соединяться с EFNA на или около поверхности опухоль-инициирующей клетки и стимулировать иммунный ответ субъекта. В других воплощениях модулятор может содержать антитело, направленное на эпитоп, нейтрализующее активность лиганда эфрина А и взаимодействия с эфриновыми рецепторами, что может влиять на силы адгезии и отталкивания между клетками посредством интегрина и перегруппировки цитоскелета. В других воплощениях раскрытые модуляторы могут действовать путем истощения или удаления EFNA-ассоциированных клеток. Таким образом, важно понимать, что настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом действия, а скорее охватывает любой способ или модулятор EFNA, который достигает нужного результата.

Предпочтительные воплощения в рамках раскрытых воплощений направлены на способ лечения субъекта, страдающего от опухолевого заболевания, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного нейтрализующего модулятора EFNA.

Другие воплощения направлены на способ лечения субъекта, страдающего от EFNA-ассоциированного расстройства, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного истощающего модулятора EFNA. Похожий способ направлен на истощение EFNA-ассоциированных клеток у субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадию введения модулятора EFNA.

В еще одном воплощении в настоящем изобретении предложены способы поддерживающей терапии, в которых раскрытые эффекторы или модуляторы вводят в течение некоторого периода времени после начальной процедуры (например химиотерапии, лучевой терапии или хирургического вмешательства), предназначенной для удаления по меньшей мере части опухолевой массы. Такие схемы лечения могут быть введены на протяжении недель, месяцев и даже лет, где модуляторы EFNA могут действовать профилактически с целью ингибирования метастазирования и/или повторного появления опухоли. В других воплощениях раскрытые модуляторы можно вводить в соответствии с известными циторедуктивными схемами для предупреждения или замедления метастазирования.

Очевидно, что, помимо терапевтических применений, описанных выше, модуляторы по настоящему изобретению можно использовать для диагностики EFNA-ассоциированных расстройств и, в частности, гиперпролиферативных расстройств. В некоторых воплощениях модулятор можно вводить субъекту и определять или контролировать in vivo. Специалистам в данной области техники понятно, что такие модуляторы могут быть мечеными или соединенными с маркерами или репортерными группами, как описано ниже, и могут быть обнаружены с использованием любого стандартного метода (например MRI (визуализация методом ядерного магнитного резонанса) или CAT (компьютерная томография)). В других случаях модуляторы можно использовать в диагностических установках in vitro с использованием принятых в данной области операций. Таким образом, предпочтительное воплощение включает способ диагностики гиперпролиферативного расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадии:

а) получение образца ткани из указанного субъекта;

б) приведение образца ткани в контакт по меньшей мере с одним модулятором EFNA; и

в) обнаружение или количественное определение модулятора EFNA, соединенного с образцом.

Такие способы могут быть легко поняты с учетом настоящей заявки и могут быть легко осуществлены с использованием общедоступной промышленной технологии, таких как автоматические планшет-ридеры, специально предназначенные репортерные системы и т.д. В выбранных воплощениях модулятор EFNA соединен с клетками, поддерживающими опухоль, присутствующими в образце. В других предпочтительных воплощениях стадия обнаружения и количественного определения включает снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток и их обнаружение. Кроме того, анализ методом серийных разведении может быть проведен, как упоминалось выше, и предпочтительно с использованием статистических параметров распределения Пуассона для обеспечения точного подсчета снижения частоты появления.

Аналогично, в настоящем изобретении также предложены наборы, которые полезны в диагностике и контроле EFNA-ассоциированных расстройств, таких как рак. С этой целью в настоящем изобретении предпочтительно предложено изделие, полезное для диагностики или лечения EFNA-ассоциированных расстройств, содержащее контейнер, содержащий модулятор EFNA и инструкции по использованию указанного модулятора EFNA для лечения или диагностики EFNA-ассоциированного расстройства.

В других предпочтительных воплощениях изобретения также используются свойства раскрытых модуляторов как инструмента, полезного для идентификации, выделения, разделения или обогащения популяций или субпопуляций опухоль-инициирующих клеток посредством таких методов, как сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или лазерное отделение.

Таким образом, другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения направлено на способ идентификации, выделения, разделения или обогащения популяции опухоль-инициирующих клеток, включающий стадию приведения указанных опухоль-инициирующих клеток в контакт с модулятором EFNA.

Вышеизложенное представляет собой краткое изложение сущности изобретения и, таким образом, содержит, по необходимости, упрощения, обобщения и опускания деталей; и, следовательно, специалистам в данной области техники будет понятно, что краткое изложение является лишь иллюстративным и не предназначено являться каким-либо ограничением. Другие аспекты, характеристики и преимущества способов, композиций и/или устройств и/или другие объекты, описанные здесь, станут очевидными из изложенного здесь руководства. Краткое изложение представлено для того, чтобы изложить ряд концепций в упрощенной форме, которые дополнительно описаны ниже в Подробном описании изобретения. Это краткое изложение не предназначено для определения ключевых или существенных признаков заявленного изобретения и не предназначено для использования в определении объема заявленного изобретения.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1А-В показаны, соответственно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий EFNA4 (SEQ ID NO:1), соответствующая аминокислотная последовательность изоформы человеческого EFNA4 (SEQ ID NO:2) и выравнивание последовательностей изоформ человеческого EFNA4 a, b и с, показывающее аминокислотные различия (SEQ ID NO:2-4), в то время как на Фиг.1Г-Е показаны, соответственно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий EFNA1 (SEQ ID NO:5), соответствующая аминокислотная последовательность изоформы человеческого EFNA1 (SEQ ID NO:6) и выравнивание последовательностей изоформ EFNA1 а и b человека, показывающее аминокислотные различия (SEQ ID NO:6 и 7);

На Фиг.2А и 2Б показаны графики, представляющие уровень экспрессии генов выбранных человеческих лигандов эфринов А и эфриновых рецепторов А у необработанных (ФИГ.2А) и у обработанных иринотеканом (Фиг.2Б) мышей при измерении с использованием всей последовательности транскриптома популяций, значительно обогащенных клетками-предшественниками опухоли (TProg), и клетками, поддерживающими опухоль (ТРС), и неонкогенными клетками (NTG), полученными из подгруппы всех образцов колоректальной опухоли;

На Фиг.3А и 3Б показаны графики, представляющие уровень генной экспрессии человеческого лиганда эфрина А4 в образцах колоректальной опухоли (Фиг.3А) и образцах опухоли поджелудочной железы (Фиг.3Б) при измерении с использованием всей последовательности транскриптома из популяций, значительно обогащенных клетками-предшественниками опухоли (TProg) и клетками, поддерживающими опухоль (ТРС), и неонкогенными клетками (NTG) или популяций онкогенных (TG) и неонкогенных клеток (NTG);

На Фиг.4 представлен график, показывающий относительный уровень генной экспрессии человеческого EFNA4 в популяциях, значительно обогащенных клетками-предшественниками опухоли (TProg), и клетками, поддерживающими опухоль (ТРС), полученных из мышей, несущих одну из четырех разных нетрадиционных ксенотрансплантатных (NTX) клеточных линий колоректальной опухоли или опухоли поджелудочной железы, и нормализированных относительно популяций, обогащенных неонкогенными клетками (NTG), при измерении с использованием количественного OT-PCR;

На Фиг.5А и 5Б представлены графики, показывающие относительный уровень экспрессии гена человеческого EFNA4 при измерении с использованием OT-PCR во всех образцах колоректальной опухоли от пациентов с I-IV стадией болезни, нормализованных относительно средней экспрессии в нормальной ткани толстой и прямой кишки (Фиг.5А) или относительно нормальной соседней ткани (Фиг.5Б);

На Фиг.6А-6Д представлен уровень экспрессии генов человеческих EFNA, измеренный для EFNA4 на Фиг.6А и 6Б посредством OT-PCR в целых опухолевых образцах (серые точки) или соответствующие NAT (технология амплификации нуклеиновых кислот) (белые точки) от пациентов с одной из восемнадцати разных солидных типов опухоли, на Фиг.6 В и 6Г посредством OT-PCR для EFNA4 и EFNA1 в выбранных NTX опухолевых клеточных линиях и посредством Вестерн-блот анализа на Фиг.6Д для EFNA4 в нормальной ткани и выбранных NTX опухолевых клеточных линиях;

На Фиг.7А-7Т представлены последовательности нескольких модуляторов EFNA, при этом на Фиг.7А представлена в табличном виде генетическая организация и последовательности CDR тяжелой и легкой цепи (как определено Chothia et al.) отдельных модуляторов EFNA, выделенных и клонированных, как описано здесь, на Фиг.7Б-7O представлены мышиные нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи для тех же модуляторов, представленных на Фиг.7А, и на Фиг.7П-7Т представлены нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи типичных гуманизированных вариантов раскрытых модуляторов EFNA;

На Фиг.8А-8Г представлены биохимические и иммунологические свойства типичных модуляторов в виде таблицы на Фиг.8А, сравнение аффинности мышиного SC4.47 и гуманизированного SC4.47 соответственно, при определении посредством анализа взаимодействия без использования метки, с фиксированным количеством антитела и серийными разведениями антигена на Фиг.8Б и 8 В, и представленное в виде таблицы сравнение выбранных гуманизированных и мышиных модуляторов на Фиг.8Г;

На Фиг.9 показаны свойства связывания с клеточной поверхностью пятидесяти типичных модуляторов лиганда эфрина А по настоящему изобретению для клеток Jurkat E6 и клеток Z138 соответственно;

На Фиг.10А и 10Б показано связывание лиганда эфрина А с клетками, экспрессирующими рецепторы эфрина А в зависимости от дозы (Фиг.10А) и ингибирование связывания с клеточной поверхностью лиганда эфрина А при воздействии типичных раскрытых модуляторов (Фиг.10Б);

На Фиг.11А-11Г представлены графики, иллюстрирующие способность раскрытых модуляторов ингибировать связывание с клеточной поверхностью человеческого и мышиного лиганда эфрина А, при этом на Фиг.11А показаны кривые для положительного контроля, а на Фиг.11 Б-11Г показана способность трех типичных модуляторов EFNA уменьшать связывание лиганда;

На Фиг.12А-12Д представлены графики, показывающие способность модуляторов по настоящему изобретению ингибировать связывание с клеточной поверхностью растворимого рецептора эфрина А, при этом на Фиг.12А представлена стандартная кривая связывания рецептора, на Фиг.12Б показаны свойства типичных модуляторов при изменении концентрации растворимого рецептора, на Фиг.12 В показаны последствия изменения концентрации модулятора при сохранении неизменным количества рецептора, и на Фиг.12Г и 12Д показана способность модуляторов ингибировать связывание рецептора эфрина А с лигандами эфрином А4 и эфрином А1 соответственно;

На Фиг.13А-13В показана способность выбранных модуляторов по настоящему изобретению вступать в перекрестную реакцию с мышиным ортологом лиганда эфрина А4, при этом на Фиг.13А показан нереакционноспособный модулятор, а на Фиг.13Б и Фиг.13 В показаны мышиный и гуманизирова