Аллергены, полученные рекомбинантными способами

Аллергены, полученные рекомбинантными способами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области аллергии. Более конкретно, изобретение относится к идентификации новых аллергенов млекопитающих и к диагностированию и лечению аллергии у млекопитающих.

Уровень техники

Перхоть собаки является основной причиной аллергии внутри помещений, и симптомы этой аллергии включают ринит, конъюнктивит, бронхит и астму. Аллергены собаки могут быть обнаружены не только в домах, где собак содержат в качестве домашних животных, но также и в других местах, таких как школы и детские сады, где собаки присутствуют непостоянно [1].

Аллергия на собак сопровождается и зависит от сенсибилизации к белкам шерсти и перхоти собаки. При подозрении на аллергию на собак клиническое обследование включает оценку сенсибилизации с помощью кожной пробы или измерения специфических IgE-антител, используя экстракт шерсти и/или перхоти собаки. Лабораторное иммунологическое исследование на специфические IgE, такое как Phadia ImmunoCAP^TM, в большинстве случаев может обнаружить сенсибилизацию к аллергенам собаки, используя природный экстракт перхоти собаки, благодаря благоприятным условиям анализа и большой твердой фазе, доступной для прикрепления аллергена.

Экстракты шерсти и перхоти собаки содержат комплекс аллергенных и неаллергенных белков [2, 3]. К настоящему моменту было идентифицировано и изучено четыре аллергена собаки: Can f 1, Can f 2, Can f 3 и Can f 5 [4-6]. Два первых аллергена являются членами семейства белков липокалина, и они были очищены и экспрессированы как рекомбинантные белки [4, 7]. Can f 3, сывороточный альбумин собак, представляет собой относительно консервативный белок, проявляющий обширную перекрестную реактивность с другими альбуминами млекопитающих [8]. Can f 5, простатический калликреин собак, недавно был описан как главный аллерген собаки и было показано, что он перекрестно взаимодействует с простатспецифическим антигеном (PSA) человека [5].

Из аллергенов перхоти собаки, известных до настоящего времени, Can f 1 и Can f 5, по-видимому, являются наиболее важными, так как связывают IgE-антитела у приблизительно 50% и 70% индивидов, имеющих аллергию на собак, соответственно [5, 9]. Хотя у приблизительно 20-40% взрослых индивидов, имеющих аллергию на собак, было отмечено связывание IgE-антител с Can f 2 или Can f 3, по-видимому, незначительное количество индивидов реагирует только или предпочтительно на любой из этих аллергенов [5, 9]. В недавнем исследовании было обнаружено, что у небольшой части пациентов, страдающих аллергией на собак, отсутствует связывание IgE-антител с любым из Can f 1, Can f 2, Can f 3 и Can f 5, несмотря на то, что они сенсибилизированы к природному экстракту перхоти собаки [5].

Кроме аллергенов, описанных выше, был описан IgE-реактивный липокалин-подобный белок с молекулярной массой 18 кДа, отличный от Can f 1 и Can f 2, который был обозначен как Can f 4 [9]. Было показано, что у пятнадцати из 25 (60%) пациентов, страдающих аллергией на собак, была отмечена реактивность сывороточного IgE к полосе с молекулярной массой 18 кДа на иммуноблоттинге, что указывает на то, что этот белок возможно является важным аллергенным компонентом собаки. Однако аллерген был охарактеризован только как N-концевая последовательность, состоящая из 13 аминокислот, по результатам SDS PAGE геля, при этом последовательность не совпадает ни с одной известной белковой последовательностью собаки. Таким образом, полноразмерная белковая последовательность неизвестна, а клонирование рекомбинантного белка не было проведено. Ни кем не был выделен нативный белок, и не было выдвинуто предположений относительно того, каким образом можно осуществить клонирование Can f 4.

В реферате статьи Saarelainen et al., опубликованной в сборнике тезисов 3-его международного симпозиума по молекулярной аллергологии (Зальцбург, 18-20 апреля 2008 года), отмечается, что mAb, специфичное к Can f 4, распознавало белок с молекулярной массой 20 кДа в экстракте перхоти коровы.

В специальном издании научного журнала Allergy, в котором опубликованы рефераты XXVIII Конгресса европейской академии по аллергии и клинической иммунологии (EAACI) (Варшава, 6-10 июня 2009 года), присутствует реферат, в котором раскрыта информация о том, что была клонирована кДНК, кодирующая полноразмерный Can f 4 [Allergy 64 (Suppl. 90): 179-538]. Однако в реферате не дано указание, каким образом было проведено клонирование и не приведены ни нуклеотидная, ни аминокислотная последовательность.

Сущность изобретения

Авторы изобретения определили необходимость в данной области проведение дополнительной характеристики и проверки важности аллергена Can f 4.

Как указано выше, с помощью лабораторного иммунологического исследования для специфических IgE можно обнаружить большинство случаев сенсибилизации к аллергенам собаки, используя природный экстракт перхоти собаки, благодаря благоприятным условиям анализа и большой твердой фазы, доступной для присоединения аллергена. Однако было обнаружено, что при проведении мини-анализа или не лабораторного иммунологического исследования, например, на микрочипах, для определения аллергенов или при тестировании в кабинете врача, сочетание менее благоприятных условий исследования, более низкой емкости антитело-связывающего аллерген реагента и экстракта природного аллергена с ограниченной эффективностью, приводит к недостаточной диагностической чувствительности. Такая ситуация также может иметь место при проведении иммунологических исследований для специфических IgE к эпителию других животных. Таким образом, в некоторых случаях существует необходимость использовать чистые аллергенные белки, для того, чтобы получить достаточную чувствительность в диагностических тестах на специфические IgE. Другая необходимость в использовании рекомбинантных аллергенных компонентов связана со способом компонентной аллергодиагностики [24]. Согласно этому способу анализ IgE-ответа на индивидуальные аллергенные компоненты, а не на экстрактах целых аллергенов, позволяет лучше провести различие между сенсибилизацией к перекрестно-реактивному аллергену и сенсибилизацией к природному аллергену. Таким образом, существует необходимость идентифицировать и получить в виде рекомбинантного белка все возможные аллергенные компоненты из конкретного источника аллергена.

Авторы настоящего изобретения столкнулись с проблемой при попытке секвенировать и клонировать Can f 4 стандартными методами, известными в данной области техники. Проблемы были решены только при использовании нестандартных методов, как описано ниже в разделе «Результаты». Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении, что IgE-антитело связывает как экстракт перхоти собаки, так и экстракт перхоти коровы, и на понимании того, что для того, чтобы определить последовательность нуклеиновой кислоты и осуществить клонирование Can f 4, авторы изобретения должны были сопоставить Can f 4 с белком другого организма.

В одном из аспектов изобретение относится к аллергену Can f 4, полученному рекомбинантными способами.

В другом аспекте изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей указанный аллерген Can f 4, полученный рекомбинантными способами.

В других аспектах изобретение относится к вектору, содержащему указанную нуклеиновую кислоту, и клетке-хозяину, содержащей указанный вектор.

В дополнительных аспектах изобретение относится к аллергену Can f 4, полученному рекомбинантными способами, который может использоваться в in vitro диагностике аллергии I типа.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения аллергенной композиции, предусматривающей стадию добавления аллергена Can f 4, полученного рекомбинантными способами, к композиции, содержащей аллергенный экстракт и/или по меньшей мере один очищенный аллергенный компонент.

В другом аспекте изобретение относится к аллергенной композиции, в которую добавлен аллерген Can f 4, полученный рекомбинантными способами. Такая аллергенная композиция может представлять экстракт аллергена или смесь очищенных и/или рекомбинантных аллергенных компонентов, не содержащая или содержащая пониженное количество аллергена Can f 4, в которую вводят аллерген Can f 4, полученный рекомбинантными способами, для связывания IgE пациентов, у которых IgE не связываются или имеют низкий уровень связывания с другими аллергенными компонентами композиции. В этом аспекте изобретение также относится к способу получения такой композиции, которая содержит стадию добавления аллергена Can f 4, полученного рекомбинантными способами, к аллергенной композиции, такой как экстракт аллергена (необязательно содержащей другие компоненты) или смесь очищенного природного или рекомбинантного аллергенных компонентов.

Кроме того, в другом аспекте изобретение относится к диагностическому тесту in vitro для диагностики аллергии I типа у пациента, где образцы биологических жидкостей, такие как образцы крови или сыворотки пациента, вступают в контакт с аллергеном Can f 4, полученным рекомбинантными способами, или композицией согласно предыдущему аспекту, и обнаруживается, содержит ли образец пациента IgE-антитела, которые специфически связываются с аллергеном Can f 4, полученным рекомбинантными способами или нет, где присутствие подобных IgE-антител, специфически связывающих с указанным аллергеном Can f 4, свидетельствует о наличии аллергии I типа. Такой диагностический метод может быть осуществлен любым способом, известным в данной области. Аллерген Can f 4, полученный рекомбинантными способами, можно, например, иммобилизировать на твердой подложке, например, стандартного лабораторного иммунологического исследования, на микрочипах или в горизонтальном проточном анализе.

В другом аспекте изобретение относится к диагностическому набору для осуществления метода согласно предыдущему аспекту, который включает аллерген Can f 4, полученный рекомбинантными способами.

Изобретение, кроме того, относится к способу лечения аллергии I типа у млекопитающих, предусматривающему введение индивиду, при необходимости, аллергена Can f 4, полученного рекомбинантными способами, или его формы, которая модифицирована, чтобы исключить или ослабить его IgE-ответ, как объяснено ниже. В одном из вариантов осуществления млекопитающее представляет собой собаку. В другом варианте осуществления млекопитающее может быть любым индивидом, имеющим аллерген млекопитающих, который имеет гомологию с аллергеном Can f 4, полученным рекомбинантными способами, при условии, что у индивида отмечена IgE-опосредованная перекрестная реактивность с указанным аллергеном млекопитающих, таким как Bos d 23k. Этот аспект изобретения также относится к применению аллергена Can f 4, полученного рекомбинантными способами, в иммунотерапии, в том числе, например, в компонентной иммунотерапии. Примеры модификаций включают, но ими не ограничены, фрагментацию, процессинг или тандемеризацию молекулы, делецию внутреннего сегмента(ов), замену аминокислотного остатка(ов), перегруппировку доменов или разрушение по меньшей мере части третичной структуры путем разрушения дисульфидных мостиков или путем связывания с другой макромолекулярной структурой или путем удаления способности белка связывать низкомолекулярные соединения.

В другом аспекте изобретение относится к аллергену Can f 4, полученному рекомбинантными способами, или к его форме, которая модифицирована так, чтобы исключить или ослабить его IgE-ответ, как объяснено ниже, для использования при лечении аллергии I типа.

В еще одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей аллерген Can f 4, полученный рекомбинантными способами, или к форме указанного аллергена Can f 4, которая модифицирована так, чтобы исключить или ослабить его IgE-ответ.

В указанных аспектах аллерген Can f 4, полученный рекомбинантными способами, может быть заменен его вариантом или фрагментом, имеющим общие антигенные детерминанты антител с аллергеном Can f 4 дикого типа, как определено ниже.

В одном из вариантов осуществления каждого указанного аспекта аллерген Can f 4, полученный рекомбинантными способами, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1.

Кроме того, изобретение относится к аллергену Can f 4, полученному рекомбинантными способами, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, который может быть использован в диагностике, а также в терапии.

Изобретение, кроме того, относится к аллергену Bos d 23k, полученному рекомбинантными способами, который используется в in vitro диагностике аллергии I типа.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения композиции аллергена, предусматривающему стадию добавления аллергена Bos d 23k, полученного рекомбинантными способами, к композиции, содержащей экстракт аллергена и/или по меньшей мере один очищенный аллергенный компонент.

В другом аспекте изобретение относится к аллергенной композиции, в которую добавлен аллерген Bos d 23k, полученный рекомбинантными способами. Такая аллергенная композиция может представлять собой экстракт аллергена или смесь очищенных и/или рекомбинантных аллергенных компонентов, не содержащую или содержащую незначительное количество аллергена Bos d 23k, где аллерген Bos d 23k, полученный рекомбинантными способами, добавляют для связывания IgE пациентов, у которых IgE не связывается или плохо связывается с другими аллергенными компонентами композиции. В этом аспекте изобретение также относится к способу получения такой композиции, который предусматривает стадию добавления аллергена Bos d 23k, полученного рекомбинантными способами, к аллергенной композиции, такой как экстракт аллергена (необязательно содержащий другие компоненты) или смесь очищенного нативного или рекомбинантного аллергенных компонентов.

Кроме того, в другом аспекте изобретение относится к диагностическому методу для диагностирования in vitro аллергии I типа у пациента, где образец биологической жидкости, такой как образец крови или сыворотки пациента, приводят в контакт с аллергеном Bos d 23k, полученным рекомбинантными способами, или композицией в соответствие с предыдущим аспектом, и обнаруживается, содержит ли образец пациента антитела IgE, которые специфически связывают аллерген Bos d 23k, полученный рекомбинантными способами, или нет, где присутствие подобных антител IgE, специфически связывающихся с вышеуказанным аллергеном Bos d 23k, свидетельствует о наличии аллергии I типа. Такой диагностический метод может быть осуществлен любым способом, известным в данной области. Аллерген Bos d 23k, полученный рекомбинантными способами, можно, например, иммобилизовать на твердой подложке, такой как подложка стандартного лабораторного иммунологического исследования, на микрочипах или в горизонтальном проточном анализе.

В другом аспекте изобретение относится к диагностическому набору для осуществления способа в соответствие с предыдущим аспектом, который содержит аллерген Bos d 23k, полученный рекомбинантными способами.

Изобретение, кроме того, относится к способу лечения аллергии I типа у млекопитающих, предусматривающему введение индивиду, при необходимости, аллергена Bos d 23k, полученного рекомбинантными способами, или его формы, которая модифицирована так, чтобы исключить или ослабить его IgE-связывающий ответ, как объяснено ниже. В одном из вариантов осуществления млекопитающее представляет собой корову. В другом варианте осуществления млекопитающее может быть любым индивидом, имеющим аллерген млекопитающих, который имеет гомологию с аллергеном Bos d 23k, полученным рекомбинантными способами, при условии, что у индивида отмечена IgE-опосредованная перекрестная реактивность с вышеуказанным аллергеном млекопитающих, таким как Can f 4. В данном аспекте изобретение также относится к применению аллергена Bos d 23k, полученного рекомбинантными способами, в иммунотерапии, в том числе, например, в компонентной иммунотерапии. Примеры модификаций включают, но ими не ограничиваются, фрагментацию, процессинг или тандемеризацию молекулы, делецию внутреннего сегмента(ов), замену аминокислотного остатка(ов), перегруппировку доменов или разрушение по меньшей мере части третичной структуры путем разрушения дисульфидных мостиков или путем связывания с другой макромолекулярной структурой, или путем удаления способности белка связывать низкомолекулярные соединения.

В другом аспекте изобретение относится к аллергену Bos d 23k, полученному рекомбинантными способами, или к форме, которая модифицирована так, чтобы исключить или ослабить его IgE-связывающий ответ, как объяснено ниже, для использования при лечении аллергии I типа.

В еще одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей аллерген Bos d 23k, полученный рекомбинантными способами, или к форме аллергена Bos d 23k, которая модифицирована так, чтобы исключить или ослабить его IgE-связывающий ответ.

В вышеуказанных аспектах аллерген Bos d 23k, полученный рекомбинантными способами, может быть заменен его вариантом или фрагментом, имеющим общие антигенные детерминанты антител для аллергена Bos d 23k дикого типа, как определено ниже.

В одном из вариантов осуществления каждого указанного аспекта, касающегося Bos d 23k, аллерген Bos d 23k, полученный рекомбинантными способами, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 и кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:3.

Определения

Can f 4 следует рассматривать как аллерген собаки, включенный в список International of Immunological Societies Allergen Nomenclature Sub-Committee (www.allergen.org).

Липокалины следует рассматривать как многочисленную и разнообразную группу белков, присутствующих в широком ряде организмов и вовлеченных во множество функций [25-27]. Эти белки характеризуются определенными консервативными структурными особенностями, но в остальном их аминокислотная последовательность не является высоко консервативной. Липокалины способны связывать небольшие, главным образом, гидрофобные молекулы, включая стероиды, жирные кислоты и феромоны. Одна подгруппа липокалинов, присутствующая в обонятельном аппарате млекопитающих, относится к одорант-связывающим белкам благодаря их способности обратимо связывать и высвобождать летучие соединения, вовлеченные в передачу обонятельных сигналов [28]. Несколько липокалинов млекопитающих были описаны как аллергены, вызывающие респираторные аллергические симптомы у сенсибилизированных людей [29].

Белок, обозначенный авторами изобретения Bos d 23k, описывается в «Примере» как белок с молекулярной массой 23 кДа, выделенный из перхоти коровы, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с гипотетическим бычьим генным продуктом, описанным в Acc No. XP_581277, выведенным из геномной последовательности Bos taurus.

Термин «Can f 4», не определенный в дальнейшем, следует рассматривать как полноразмерный, немодифицированный, интактный Can f 4.

Подобное определение также применяется с соответствующими изменениями в Bos d 23k.

Варианты и фрагменты аллергена Can f 4, имеющие общие антигенные детерминанты антител для аллергена Can f 4, следует рассматривать как фрагменты и варианты, для которых связывание IgE-антител из образца сыворотки типичного Can f 4-сенсибилизированного пациента может значительно ингибироваться аллергеном Can f 4. Подобный анализ ингибирования можно, например, провести согласно протоколу, описанному в примере 8 документа WO 2008/079095. Также указано, что варианты и фрагменты имеют сходные свойства связывания IgE с аллергеном как и Can f 4.

Подобное определение также применяется с соответствующими изменениями к Bos d 23k.

Форму вышеуказанного аллергена Can f 4, которая модифицирована так, чтобы исключить или уменьшить его IgE-ответ, следует рассматривать в контексте настоящего изобретения как значение аллергена Can f 4, который химически или генетически модифицирован так, чтобы исключить его иммунологические свойства, например, как проиллюстрировано выше, относительно иммунотерапевтического аспекта изобретения.

Подобное определение также применяется с соответствующими изменениями к Bos d 23k.

Гомолог аллергена следует рассматривать как значение аллергена, у которого последовательность нуклеиновой кислоты может гибридизоваться с последовательностью нуклеиновой кислоты другого аллергена. Результат гибридизации может зависеть от длины последовательностей, от того как гомология распространена по последовательностям и от экспериментальных условий, таких как концентрация соли, температура, жесткость промывки и т.д. Гомолог аллергена по настоящему изобретению может обладать более низкой идентичностью последовательности, чем идентичность, которую часто принимают для гомолога, то есть 65-70%. По определению в настоящем изобретении последовательность нуклеиновой кислоты гомолога аллергена может иметь более низкую идентичность последовательности к нуклеиновой кислоте другого аллергена, но все еще будет гибридизоваться с другим аллергеном благодаря сегментам последовательностей, показывающим более высокую идентичность.

Перекрестную реактивность к аллергену следует рассматривать как значение, при котором IgE-антитела индивида к первому аллергену также являются реактивными ко второму аллергену, который может или не может являться гомологом первого аллергена.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показан иммуноблотинг связывания IgE-антител с белками экстракта перхоти собаки в невосстанавливающих условиях. Показаны десять из 37 проанализированных сывороток. Номер индивида указан выше и разведение сыворотки ниже каждой линии. Положения маркеров молекулярных масс белков указаны слева.

На фиг.2 показана очистка белка перхоти собаки с молекулярной массой 16 кДа, идентифицированного иммуноблоттингом в четыре последовательные стадии. A, препаративная эксклюзионная хроматография. Объединенные фракции обозначены вертикальными столбиками. B, анион-обменная хроматография. Заштрихованная линия обозначает электропроводность (правая ось y). Фракции, объединенные для дальнейшей очистки, обозначены горизонтальной скобкой. C, обращенно-фазная хроматография. Заштрихованная линия обозначает концентрацию ацетонитрила (правая ось y). Фракции, объединенные для дальнейшей очистки, обозначены горизонтальной скобкой. D, анион-обменная хроматография. Заштрихованная линия обозначает электропроводность (правая ось y). Пик, содержащий чистый мишеневый белок, обозначен стрелкой.

На фиг.3 показаны пептидные последовательности, полученные из триптических фрагментов очищенного белка перхоти собаки с молекулярной массой 16 кДа.

На фиг.4 показана последовательность кДНК (как SEQ ID NO:1 из перечня последовательностей) и установленная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) Can f 4. Предполагаемый сайт расщепления сигнального пептида обозначен стрелкой.

На фиг.5 показан сравнительный биохимический и иммунологический анализ очищенного nCan f 4 и rCan f 4. A, аналитическая гель-фильтрация. Заштрихованная линия: nCan f 4 (правая ось y); сплошная линия: rCan f 4 (левая ось y). Объемы элюции калибровочных белков с молекулярной массой 6,5, 13,7, 29, 43 и 75 кДа отмечены ромбами. B, SDS электрофорез в полиакриламидном геле образцов nCan f 4 и rCan f 4 при невосстанавливающих (ox) и восстанавливающих (red) условиях. Размеры соответствующих маркеров молекулярных масс белков указаны слева. C, анализ активности связывания IgE-антител (кЕ/л) при использовании ImmunoCAP. Проанализированы сыворотки 37 индивидов с аллергией на собаку. Заштрихованные линии указывают на уровень 0,10 и 0,35 кЕ/л.

На фиг.6 показана концентрация IgE-антител в отношении экстракта перхоти собаки (DDE), rCan f 1, rCan f 2, nCan f 3, rCan f 5 и rCan f 4 среди 37 индивидов с аллергией на собаку. Горизонтальные столбики указывают средние значения. Пунктирная линия указывает на уровень 0,35 кЕ/л. Значения ниже 0,1 кЕ/л приравнивали к 0,1 кЕ/л.

На фиг.7 показано ингибирование связывания IgE-антител с Bos d 23k, вызванного rCan f 4. Три Bos d 23k-реактивные сыворотки (A-C) преинкубировали с 100 мкг/мл rCan f 4 (черные столбики) или буфером (отрицательный контроль, серые столбики), до момента измерения связывания IgE с иммобилизованным Bos d 23k.

На фиг.8 показана очистка двух белков, связывающих IgE-антитела, Bos d 23k и Bos d 2, из перхоти коровы. A, фракционирование путем эксклюзионной хроматографии. Главные фракции от двух пиков, обозначенных A и B, объединяли и подвергали SDS-электрофоретическому анализу при восстанавливающих условиях (вставка). Размеры соответствующих маркеров молекулярных масс белков указаны справа. B, SDS электрофорез в полиакриламидном геле образцов очищенного Bos d 23k и Bos d 2 после дальнейшей очистки путем гидрофобного взаимодействия и анион-обменной хроматографии при невосстанавливающих (ox) и восстанавливающих (red) условиях. Размеры соответствующих маркеров молекулярных масс белков указаны слева от каждого геля.

На фиг.9 показано сравнение связывания IgE-антител с Can f 4, Bos d 23k (верхний график) и Bos d 2 (нижний график). Указан коэффициент корреляции (r) для каждого сравнения. Проанализированы сыворотки 37 индивидов с аллергией на собаку. Заштрихованные линии указывают уровень 0,10 и 0,35 кЕ/л.

На фиг.10 показано выравнивание аминокислотной последовательности Can f 4 (как SEQ ID NO:2) и Bos d 23k (как SEQ ID NO:4).

Подробное описание изобретения

Пример ниже иллюстрирует настоящее изобретение с выделением и использованием липокалин-подобного белка Can f 4 от собаки. Также представлена часть, иллюстрирующая перекрестную реактивность между Can f 4 и аллергеном коровы. Пример является только иллюстративным и его не следует рассматривать как ограничивающий изобретение, которое определено объемом приложенной формулы изобретения.

ПРИМЕР

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Иммуноблот-анализ IgE

Осуществляли иммуноблот-анализ экстракта перхоти собаки, разделенного посредством SDS электрофореза в полиакриламидном геле при невосстанавливающих условиях, используя гомогенный 12,5% ExcelGel (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden) и нанесенного электроблоттингом на нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL (GE Healthcare Life Sciences). В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор LMW (GE Healthcare Life Sciences). Белковые блоты блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре, используя блокирующий буфер (50 мМ фосфат pH 7,4, 0,1% (об./об.) Tween-20, 0,9% (масс./об.) NaCl, 0,3% (масс./об.) декстран T10) и затем инкубировали в течение ночи с сывороткой каждого пациента, разводили в 1,5-30 раз в блокирующем буфере. После промывания в блокирующем буфере с 0,5% (об./об.) Tween-20 мембрану инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре с ¹²⁵I-меченными человеческими анти-IgE антителами в блокирующем буфере и после промывания связанные IgE детектировали рентгенографически, используя фосфоимиджер и сканер Typhoon 9410 Variable Mode Imager (GE Healthcare Life Sciences).

Очистка белка с молекулярной массой 16 кДа из перхоти собаки

Перхоть собаки (Allergon, Välinge, Швеция) экстрагировали в 20 мМ MOPS pH 7,6, 0,5 М NaCl (MBS), осветляли центрифугированием, отфильтровывали через 0,45-мкм смешанный фильтр сложного эфира целлюлозы (Millipore, Billerica, MA) и наносили на колонку Superdex 75 (GE Healthcare Life Sciences) для проведения эксклюзионной хроматографии (SEC). Фракции, содержащие полосу с молекулярной массой 16 кДа, наблюдаемую в иммуноблот-анализе, концентрировали в перемешиваемой ячейке Amicon (Millipore), используя фильтр YM-3, обессоливали на высокодисперсной колонке Sephadex G25 (GE Healthcare Life Sciences), используя 20 мМ Tris-HCl pH 8,0. Обессоленный препарат затем наносили на колонку Source Q (GE Healthcare Life Sciences) для проведения анион-обменной хроматографии (AIEC) и элюировали линейным градиентом NaCl 0-0,5 М. Дальнейшую очистку проводили путем обращенно-фазной хроматографии (RPC), используя колонку Source 15 RPC (GE Healthcare Life Sciences) и элюировали линейным градиентом ацетонитрила 0-54% в воде, содержащей 0,05% трифторуксусной кислоты (TFA). Фракции, содержащие целевой белок, идентифицировали путем SDS электрофореза в полиакриламидном геле и объединяли. После восстановления, алкилирования и расщепления трипсином, пептиды очищенного белка выделяли путем RPC и анализировали, определяя аминокислотную последовательность. Для оценки связывания IgE-антител с использованием ImmunoCAP белок с молекулярной массой 16 кДа подвергали заключительному этапу доочистки путем катион-обменной хроматографии (CIEC), используя колонку SP Sepharose FF (GE Healthcare Life Sciences), уравновешенную в 20 мМ цитрате pH 4,0 и элюировали линейным градиентом NaCl 0-1 М.

Очистка IgE-связывающих белков из перхоти коровы

Перхоть коровы (Allergon) экстрагировали и фракционировали путем SEC, как описано выше. Фракции, содержащие доминантную полосу с молекулярной массой 23 кДа, объединяли, обрабатывали NH₄SO₄ до конечной концентрации 1 М и далее очищали путем гидрофобной хроматографии (HIC), используя колонку с фенил-Сефарозой HP (GE Healthcare Life Sciences). Полосу с молекулярной массой 23 кДа элюировали в потоке по фракциям и обессоливали в 20 мМ Bis-Tris пропане pH 8,5 на колонке с высокодисперсной Sephadex G25 (GE Healthcare Life Sciences) и впоследствии наносили на колонку Source 15Q (GE Healthcare Life Sciences), уравновешенную тем же самым буфером. Элюцию проводили линейным градиентом NaCl 0-0,4 М, и фракции, содержащие полосу с молекулярной массой 23 кДа, объединяли. Концентрацию белка конечного препарата определяли по спектральной поглощательной способности при 280 нм, используя расчетный коэффициент экстинкции 1,04 на мг/мл.

Фракции, содержащие доминантную полосу с молекулярной массой 19 кДа, объединяли и далее очищали посредством HIC, как описано выше. Белок с молекулярной массой 19 кДа элюировали линейным градиентом 0-1 М NH₄SO₄ в 20 мМ Tris-HCl pH 8,0 и объединяли пики фракций. Обессоливание и хроматографию AIEC на колонке Source 15Q проводили, как описано выше. Концентрацию белка конечного препарата определяли по спектральной поглощательной способности при 280 нм, используя расчетный коэффициент экстинкции 1,04 на мг/мл.

Анализ белка

Если иначе не определено, SDS электрофорез в полиакриламидном геле образцов белка при восстанавливающих (4% β-меркаптоэтанол) и невосстанавливающих условиях проводили, используя 10% гель NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) и Mark 12 (Invitrogen) в качестве маркеров молекулярной массы. После электрофоретического разделения белки визуализировали путем окрашивания Coomassie Brilliant Blue. Анализ N-концевой последовательности выделенных полос белка проводили, используя Hewlett-Packard G1000A (HewlettPackard, Palo Alto, CA). Аналитическую хроматографию SEC проводили на колонке Superdex 75 HR 10/30 (GE Healthcare Life Sciences), уравновешенной MBS. Калибровку молекулярных масс колонки проводили, используя набор для калибровки гель-фильтрационных колонок LMW (GE Healthcare Life Sciences).

Для проведения анализа масс пептидов (PMF) путем матричной лазерной десорбционной времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии (MS), подготовку образца RPC-очищенного белка в растворе, включая восстановление, алкилирование и расщепление трипсином, проводили по существу как описано [10], используя Bruker Daltonics Autoflex 2 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). Анализ проводили путем тандемной масс-спектрометрии (MS/MS) для того, чтобы идентифицировать отобранные пептиды. Для того, чтобы идентифицировать белки, соответствующие результатам, полученным при PMF и MS/MS анализе, исследовали базу данных MSDB, используя сервер Mascot (Matrixscience, Landon, UK).

Расщепление трипсином в геле отдельных белковых полос из SDS электрофореза в полиакриламидном геле проводили по существу согласно Shevchenko et al. [11]. Подготовку образца и анализ масс пептидов проводили, как описано выше.

Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного Can f 4

Тотальную РНК получали из бокового сегмента языка собаки, используя набор RNAqueous Kit (Ambion, Austin, Texas). Полиаденилированную РНК получали из тотальной РНК, используя набор mRNA Purification Kit (GE Healthcare Life Sciences), и первую цепочку кДНК получали, используя набор First-Strand cDNA Synthesis kit (GE Healthcare Life Sciences). ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (3'RACE) проводили согласно Frohman [12], используя внутренние («nested») обратные олигонуклеотидные праймеры 5'-ATGAAGATCCTACTGTTGTGTC-3' и 5'-CAGCTACCCCTTCCTAATG-3', оба несущие терминальный сайт рестрикции NdeI для клонирования. Семь независимых 3'RACE-клонов выделяли и полностью секвенировали, посредством чего можно было идентифицировать кодирующую последовательность Can f 4. Секвенирование ДНК проводили, используя генетический анализатор Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Анализы и оценки последовательности ДНК и аминокислотной последовательности проводили, используя программы GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA, USA). Предсказание сигнального пептида проводили, используя SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). С целью экспрессии белка кодирующую последовательность Can f 4 амплифицировали, используя праймеры 5'-GTCAGCATATGCAGCTACCCCTTCCTAATG-3' и 5'-ACTGACTCGAGTTCATGGTTGGGACAGTTGTC-3', и клонировали между сайтами NdeI и XhoI вектора pET-23a(+) (Novagen, Madison, WI, USA). Рекомбинантный Can f 4 получали как белок, меченный шестью аминокислотными остатками гистидина с C-конца, в E. coli BL21, используя биореактор 3-L (Belach Bioteknik, Solna, Sweden).

Для очистки rCan f 4 собранные клетки повторно суспендировали в 20 мМ Tris-HCl pH 8,0 и лизировали путем пропускания суспензии через гомогенизатор Emulsiflex C5 (Avestin Inc., Canada) при 15000-17000 кПа. После осветления центрифугированием и фильтрацией, супернатант наносили на колонку Chelating Sepharose FF (GE Healthcare Life Sciences), насыщенную NiSO₄. Промывку колонки проводили 20 мМ имидазолом в 20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 0,15 М NaCl и рекомбинантный белок элюировали в линейном градиенте имидазола 20-500 мМ в том же самом буфере. Дальнейшую очистку рекомбинантного белка проводили путем хроматографии AIEC в 20 мМ Tris-HCl pH 8,0 используя колонку Q Sepharose FF (GE Healthcare Life Sciences). Белок элюировали, используя линейный градиент NaCl 0-0,5 М, и фракции объединяли в соответствии с результатами SDS электрофореза в полиакриламидном геле. Концентрацию белка конечного препарата определяли по спектральной поглощательной способности при 280 нм, используя расчетный коэффициент экстинкции 0,78 на мг/мл. Интактность рекомбинантного белка подтверждали N-концевым секвенированием.

Индивиды с аллергией на собаку и пыльцевые аллергические контроли

В исследовании использовались сыворотки 37 индивидов с аллергией на собаку из Испании (n=23), Швеции (n=10) и Америки (n=4) (таблица 2). Все пациенты имели установленный врачом диагноз аллергии на собаку, с такими симптомами, как астма, риноконъюктивит и крапивница, положительную кожную пробу и положительный тест ImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden) для специфического IgE к экстракту перхоти собаки. В целях контроля использовали сыворотки 44 индивидов с аллергией на пыльцу, не имеющих диагноз или описанные симптомы аллергии на собаку. Все образцы и клинические данные собирали с одобрения локального этического комитета в каждом центре.

Измерения специфических IgE-антител

IgE-связывающая активность очищенных и рекомбинантных аллергенов проверяли, используя стандартные и экспериментальные тесты ImmunoCAP^TM (Phadia). Экспериментальные тесты ImmunoCAP подготавливали, как описано [13]. Специфичность исследования экспериментальных тестов оценивали, используя отрицательную контрольную сыворотку, с добавленным IgE-миелома в конечной концентрации 0, 1000 или 3000 кЕ/л. Эксперимент по ингибированию IgE проводили путем преинкубации образцов сыворотки с рекомбинантным Can f 4 в конечной концентрации 100 мкг/мл до измерения связывания IgE-антител с белком перхоти коровы с молекулярной массой 23 кДа, иммобилизованным на твердой фазе ImmunoCAP. Результаты вычисляли как средние значения повторных определений.

Результаты

Иммуноблот-анализ сывороток индивидов с аллергией на собаку

Образцы сывороток 10 индивидов с аллергией на собаку подвергали IgE-иммуноблот-анализу, используя экстракт перхоти собаки при невосстанавливающих условиях (фиг.1). Для сравнения для тех же сывороток были получены данные анализа ImmunoCAP для специфических IgE к rCan f 1, rCan f 2, nCan f 3 и rCan f 5. Иммуноблот-анализ выявлял связывание IgE с по меньшей мере 8 различными белковыми полосами. Из данных 8 полос полосы в области участка, соответствующего молекулярной массе 23 кДа, коррелировали с выявленным ImmunoCAP анализом связыванием IgE с rCan f 1 и rCan f 2 (индивиды 5, 24, 31 и 33), полосы в области участка, соответствующего молекулярной массе 28 кДа, с реактивностью rCan f 5 (индивиды 1, 3, 5, 15, 31, 33 и 36) и полосы в области участка, соответствующего молекулярной массе приблизительно 60 кДа, с реактивностью nCan f 3 (индивиды 9, 15 и 33).

Связывание IgE с полосой с молекулярной массой 16 кДа на иммуноблоте обнаруживали для сыво