Композиции, относящиеся к мутантному токсину clostridium difficile, и способы их применения

Композиции, относящиеся к мутантному токсину clostridium difficile, и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент US 61/478474, поданной 22 апреля 2011, предварительной заявки на патент US 61/478899, поданной 25 апреля 2011. Содержание упомянутых выше заявок полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим мутантные токсины Clostridium difficile, и способам их применения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Clostridium difficile (С.difficile) представляет собой грамположительную анаэробную бактерию, связанную с желудочно-кишечным заболеванием у людей. Колонизация С.difficile обычно происходит в толстой кишке, если естественная кишечная флора ослаблена в результате лечения антибиотиками. Инфекция может привести к антибиотикоассоциированной диарее и иногда к псевдомембранозному колиту вследствие секреции гликозилирующих токсинов, токсина А и токсина В (308 и 270 кДа, соответственно), которые являются основными факторами вирулентности С.difficile.

Токсин А и токсин В кодируются в пределах локуса патогенности (PaLoc), длина которого составляет 19 т.п.н., генами tcdA и tcdB соответственно. У непатогенных штаммов С.difficile данный локус заменен альтернативной последовательностью, длина которой составляет 115 пар оснований.

Оба токсина, токсин А и токсин В, являются сильными цитотоксинами. Эти белки представляют собой гомологичные глюкозилтрансферазы, которые инактивируют малые ГТФазы семейства Rho/Rac/Ras. В результате прерывание в передаче сигнала вызывает утрату межклеточных контактов, нарушение регуляции актинового цитоскелета и/или апоптоз, приводя в результате к выраженной секреторной диарее, обусловленной инфекциями Clostridium difficile (CDI).

За последнее десятилетие резко возросли число случаев и тяжесть вспышек эпидемии С.difficile в больницах, центрах сестринского ухода и других лечебных учреждениях для хронических больных. Ключевые факторы этого возрастания включают возникновение гипервирулентных патогенных штаммов, усиленное применение антибиотиков, улучшенные способы обнаружения и повышенное воздействие воздушно-капельных спор в лечебных учреждениях.

Метронидазол и ванкомицин представляют принятый в настоящее время стандарт лечения антибиотиками диареи, вызванной С.difficile (CDAD; С.difficile associated disease). Однако приблизительно у 20% пациентов, получающих такое лечение, происходит рецидив инфекции после первого эпизода CDI, и вплоть до приблизительно 50% этих пациентов страдают дополнительными рецидивами. Лечение этих рецидивов является достаточно большой проблемой, и большинство рецидивов обычно встречается в течение месяца после предыдущего эпизода.

Соответственно, существует необходимость в иммуногенных и/или терапевтических композициях и способах их применения, направленных на С.difficile.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Эти и другие цели достигнуты настоящим изобретениям.

В одном аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин А С.difficile. Этот мутантный токсин А С.difficile включает глюкозилтрансферазный домен, имеющий по меньшей мере одну мутацию, и цистеинпротеазный домен, имеющий по меньшей мере одну мутацию, по сравнению с соответствующим токсином А С.difficile дикого типа. В одном воплощении, по меньшей мере одна аминокислота мутантного токсина А С.difficile поперечно-сшита химическим образом.

В одном аспекте изобретение относится к выделенному полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:4, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, и где данный полипептид включает по меньшей мере одну боковую цепь аминокислоты, химически модифицированную с использованием 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS).

В одном воплощении, по меньшей мере одна аминокислота мутантного токсина С.difficile поперечно-сшита химическим образом.

В одном воплощении, по меньшей мере одна аминокислота поперечно-сшита химическим образом с использованием формальдегида, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC), N-гидроксисукцината или комбинации EDC и NHS.

В одном воплощении, иммуногенная композиция распознается соответствующим нейтрализующим антителом против токсина или его связывающим фрагментом.

В одном воплощении иммуногенная композиция проявляет пониженную цитотоксичность по сравнению с соответствующим токсином С.difficile дикого типа.

В другом аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин А С.difficile, который включает глюкозилтрансферазный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:29, которая имеет аминокислотные замены в положении 285 и 287, и цистеинпротеазный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:32, которая имеет аминокислотную замену в положении 158, по сравнению с соответствующим токсином А С.difficile дикого типа, где по меньшей мере одна аминокислота мутантного токсина А С.difficile поперечно-сшита химическим образом.

В следующем аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин А С.difficile, который включает SEQ ID NO:4, где по меньшей мере одна аминокислота мутантного токсина А С.difficile поперечно-сшита химическим образом.

Еще в одном другом аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.

В одном аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин В С.difficile. Этот мутантный токсин В С.difficile включает глюкозилтрансферазный домен, имеющий по меньшей мере одну мутацию, и цистеинпротеазный домен; имеющий по меньшей мере одну мутацию по сравнению с соответствующим токсином В С.difficile дикого типа.

В другом аспекте изобретение относится к выделенному полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO:6, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, и где данный полипептид включает боковую цепь аминокислоты, химически модифицированную 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS).

В другом аспекте, изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин В С.difficile, который включает глюкозилтрансферазный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:31, которая имеет аминокислотные замены в положении 286 и 288, и цистеинпротеазный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:33, которая имеет аминокислотную замену в положении 155, по сравнению с соответствующим токсином В С.difficile дикого типа, где по меньшей мере одна аминокислота мутантного токсина В С.difficile поперечно-сшита химическим образом.

В следующем аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин В С.difficile, который включает SEQ ID NO:6, где по меньшей мере одна аминокислота мутантного токсина В С.difficile поперечно-сшита химическим образом.

В одном аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин А С.difficile, который включает SEQ ID NO:4, и мутантный токсин В С.difficile, который включает SEQ ID NO:6, где по меньшей мере одна аминокислота каждого из мутантных токсинов С.difficile поперечно-сшита химическим образом.

В следующих аспектах изобретение относится к рекомбинантной клетке или потомству этой клетки, которая включает полинуклеотид, кодирующий любой из вышеуказанных мутантных токсинов С.difficile, причем в этой клетке отсутствует эндогенный полинуклеотид, кодирующий токсин.

В другом аспекте изобретение относится к антителу или к связывающему фрагменту антитела, который связывается с иммуногенной композицией, включающей мутантный токсин С.difficile.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения инфекции С.difficile у млекопитающего. Указанный способ включает введение млекопитающему иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин А С.difficile, который включает SEQ ID NO:4, и мутантный токсин В С.difficile, который включает SEQ ID NO:6, где по меньшей мере одна аминокислота каждого из мутантных токсинов С.difficile поперечно-сшита с использованием формальдегида.

В другом аспекте способ лечения С.difficile инфекции С.difficile у млекопитающего включает введение млекопитающему иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин А С.difficile, который включает SEQ ID NO:4, и мутантный токсин В С.difficile, который включает SEQ ID NO:6, где по меньшей мере одна аминокислота каждого из мутантных токсинов С.difficile поперечно-сшита с использованием 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида и/или N-гидроксисукцинимида (NHS).

В одном аспекте изобретение относится к способу индукции иммунного ответа на инфекцию С.difficile у млекопитающего. Данный способ включает введение млекопитающему иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин А С.difficile, который включает SEQ ID NO:4, и мутантный токсин В С.difficile, который включает SEQ ID NO:6, где по меньшей мере одна аминокислота каждого из мутантных токсинов С.difficile поперечно-сшита с использованием формальдегида.

В другом аспекте способ индукции иммунного ответа на инфекцию С.difficile у млекопитающего включает введение млекопитающему иммуногенной композиции, включающей мутантный токсин А С.difficile, который включает SEQ ID NO:4, и мутантный токсин В С.difficile, который включает SEQ ID NO:6, где по меньшей мере одна аминокислота каждого из мутантных токсинов С.difficile поперечно-сшита с использованием 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида и/или N-гидроксисукцинимида (NHS).

В одном воплощении способы лечения или способы индукции иммунного ответа осуществляют у млекопитающего, нуждающегося в этом.

В одном воплощении способы лечения или способы индукции иммунного ответа включают млекопитающее, имеющее рецидивирующую инфекцию С.difficile.

В одном воплощении способы лечения или способы индукции иммунного ответа включают парентеральное введение композиции.

В одном воплощении способы лечения или способы индукции иммунного ответа включают иммуногенную композицию, дополнительно включающую адъювант.

В одном воплощении адъювант включает гель гидроксида алюминия и CpG олигонуклеотид. В другом воплощении адъювант включает ISCOMATRIX.

В одном воплощении выделенный полипептид включает по меньшей мере одну боковую цепь остатка аспарагиновой кислоты полипептида или по меньшей мере одну боковую цепь остатка глутаминовой кислоты полипептида, химически модифицированную глицином.

В одном воплощении выделенный полипептид включает по меньшей мере одну поперечную сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида; и по меньшей мере одну поперечную сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида.

В одном воплощении выделенный полипептид включает бета-аланиновую группировку, сшитую с боковой цепью по меньшей мере одного остатка лизина полипептида.

В одном воплощении выделенный полипептид включает глициновую группировку, сшитую с боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида или с боковой цепью остатка глутаминовой кислоты полипептида.

В одном воплощении выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:4, в которой остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, и боковая цепь по меньшей мере одного остатка лизина полипептида сшита с бета-аланиновой группировкой.

В одном воплощении выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:6, в которой остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, и боковая цепь по меньшей мере одного остатка лизина полипептида сшита с бета-аланиновой группировкой.

В одном воплощении выделенный полипептид включает боковую цепь второго остатка лизина полипептида, сшитую с боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты или с боковой цепью остатка глутаминовой кислоты.

В одном воплощении выделенный полипептид включает боковую цепь остатка аспарагиновой кислоты или боковую цепь остатка глутаминовой кислоты полипептида, сшитую с глициновой группировкой.

В одном воплощении выделенный полипептид имеет значение EC₅₀ по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл.

В одном аспекте иммуногенная композиция включает выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:4, в которой остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, и выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:6, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, и где эти полипептиды имеют по меньшей мере одну боковую цепь аминокислоты, химически модифицированную с использованием 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS).

В одном воплощении полипептид включает по меньшей мере одно из: а) по меньшей мере одной бета-аланиновой группировки, сшитой с боковой цепью остатка лизина полипептида; б) по меньшей мере одной поперечной сшивки между боковой цепью остатка лизина полипептида и боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты; и в) по меньшей мере одной поперечной сшивки между боковой цепью остатка лизина полипептида и боковой цепью остатка глутаминовой кислоты.

В одном воплощении выделенный полипептид имеет значение ЕСво по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл.

В одном аспекте иммуногенная композиция включает выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:4, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, и выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:6, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, и а) где боковая цепь по меньшей мере одного остатка лизина SEQ ID NO:4 сшита с бета-аланиновой группировкой, и б) где боковая цепь по меньшей мере одного остатка лизина SEQ ID NO:6 сшита с бета-аланиновой группировкой.

В одном воплощении иммуногенная композиция включает боковую цепь второго остатка лизина SEQ ID NO:4, сшитую с боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты или с боковой цепью остатка глутаминовой кислоты, и где второй остаток лизина SEQ ID NO:6 сшит с боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты или с боковой цепью остатка глутаминовой кислоты.

В одном воплощении иммуногенная композиция включает боковую цепь остатка аспарагиновой кислоты или боковую цепь остатка глутаминовой кислоты полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:4, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, сшитую с глициновой группировкой.

В одном воплощении иммуногенная композиция включает боковую цепь остатка аспарагиновой кислоты или боковую цепь остатка глутаминовой кислоты полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:6, где остаток метионина в положении 1 возможно отсутствует, сшитую с глициновой группировкой.

В одном воплощении выделенный полипептид имеет значение ЕСбо по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл.

В одном аспекте иммуногенная композиция включает выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:84, и выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:86, где каждый полипептид включает: а) по меньшей мере одну поперечную сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида; б) по меньшей мере одну поперечную сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида; в) бета-аланиновую группировку, сшитую с боковой цепью по меньшей мере одного остатка лизина полипептида; и г) глициновую группировку, сшитую с боковой цепью по меньшей мере одного остатка аспарагиновой кислоты полипептида или с боковой цепью по меньшей мере одного остатка глутаминовой кислоты полипептида.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1А-Н представлено выравнивание последовательности токсина А С.difficile дикого типа из штаммов 630, VPI10463, R20291, CD196, и мутантного токсина А, имеющего последовательность SEQ ID NO:4, с использованием выравнивания CLUSTALW, параметры по умолчанию.

На Фиг.2A-F представлено выравнивание последовательности токсина В С.difficile дикого типа из штаммов 630, VPI10463, R20291, CD196, и мутантного токсина В, имеющего последовательность SEQ ID NO:6, с использованием выравнивания CLUSTALW, параметры по умолчанию.

На Фиг.3 представлен график, показывающий идентификацию штаммов, отрицательных по токсину С.difficile дикого типа. Культуральную среду 13 штаммов С.difficile тестировали с помощью ELISA на токсин А. Как проиллюстрировано, семь штаммов экспрессировало токсин А, и 6 штаммов не экспрессировало его (штаммы 1351, 3232, 7322, 5036, 4811 и VPI11186).

На Фиг.4А и В представлены результаты электрофореза в ДСН-ПААГ, иллюстрирующие, что тройной мутант A (SEQ ID NO:4), двойной мутант В (SEQ ID NO:5) и тройной мутант В (SEQ ID NO:6) не гликозилируют ГТФазы Rac1 или RhoA в анализах гликозилирования in vitro с UDP-¹⁴C-глюкозой; тогда как от 10 мкг до 1 нг токсина В дикого типа гликозилирует Rac1.

На Фиг.5 представлены результаты Вестерн-блота, показывающие нейтрализацию активности цистеиновой протеазы в мутантных токсинах А и В (SEQ ID NO:4 и 6, соответственно) по сравнению с наблюдением расщепленных фрагментов токсинов А и В дикого типа (SEQ ID NO:1 и 2, соответственно). См. Пример 13.

На Фиг.6 представлены графики, показывающие, что тройные мутантные токсины А и В (SEQ ID NO:4 и 6, соответственно) проявляют остаточную цитотоксичность при тестировании при высоких концентрациях (например, приблизительно 100 мкг/мл) в результате анализа цитотоксичности in vitro в клетках IMR-90.

На Фиг.7 представлен график, показывающий, что значения ЕСво аналогичны для тройного мутантного токсина В (SEQ ID NO:6) и гепта-мутантного токсина В (SEQ ID NO:8).

На Фиг.8 изображен график, на котором представлены результаты тестов цитотоксичности in vitro, где уровни АТФ (RLU) нанесены на график против возрастающих концентраций тройного мутантного TcdA (SEQ ID NO:4) (верхняя панель) и тройного мутантного TcdB (SEQ ID NO:6) (нижняя панель). Остаточная цитотоксичность мутантных токсинов А и В может быть полностью нейтрализована нейтрализующими антителами, специфичными к мутантному токсину А (верхняя панель - pAb А и mAb А3-25+А60-22) и к мутантному токсину В (нижняя панель - pAb В).

На Фиг.9 представлены изображения морфологии клеток IMR-90 через 72 часа после обработки. На панели А показаны контрольные клетки, обработанные имитатором. На панели В показана морфология клеток после обработки мутантным TcdB (SEQ ID NO:6), инактивированным формалином. На панели С показана морфология клеток после обработки мутантным TcdB (SEQ ID NO:6), инактивированным EDC. На панели D показана морфология клеток после обработки токсином В дикого типа (SEQ ID NO:2). На панели Е показана морфология клеток после обработки тройным мутантным TcdB (SEQ ID NO:6). Подобные результаты наблюдали для обработок TcdA.

На Фиг.10 представлен график, показывающий титры нейтрализующего антитела, описанного в Примере 25 (исследование muCdiff2010-06).

На Фиг.11 представлен график, показывающий титры нейтрализующего антитела, описанного в Примере 26 (исследование muCdiff2010-07).

На Фиг.12 представлен график, показывающий ответы нейтрализующего антитела против токсинов А и В у хомячков после четырех иммунизации, как описано в Примере 27 (исследование ham C.difficile 2010-02)

На Фиг.13 представлен график, показывающий ответы нейтрализующего антитела у хомячков после вакцинации химически инактивированными, генетически мутантными токсинами и токсоидами List Biological, как описано в Примере 27 (исследование ham C.difficile 2010-02).

На Фиг.14 представлены кривые выживаемости трех иммунизированных групп хомячков по сравнению с не иммунизированными контролями, как описано в Примере 28 (исследование ham C.difficile 2010-02, продолжение).

На Фиг.15 представлен график, показывающий относительный ответ нейтрализующего антитела против различных препаратов мутантных токсинов С.difficile у хомячков (исследование ham C.difficile 2010-03), как описано в Примере 29.

На Фиг.16А-В представлены графики, показывающие сильный ответ нейтрализующего антитела против химически инактивированных генетических мутантных токсинов А и В (SEQ ID NO:4 и 6, соответственно) у яванских макак, как описано в Примере 30.

На Фиг.17 представлены аминокислотные последовательности вариабельных областей легких (VL) и тяжелых (HL) цепей А3-25 mAb IgE. Сигнальный пептид - выделен цветом; CDR - выделены курсивом и подчеркнуты; константная область - выделена полужирным шрифтом и подчеркнута (полноразмерная последовательность не показана).

На Фиг.18 представлен график, показывающий титрование индивидуальных антител к токсину А в анализе нейтрализации токсина с использованием уровней АТФ (количественно определяемый в относительных световых единицах - RLU) как индикатора выживаемости клеток. По сравнению с контролем токсина (4×ЕС₅₀) mAb A80-29, А65-33, А60-22 и А3-25 обладали возрастающими нейтрализующими действиями на токсин А с возрастанием концентрации, но не действовали на уровень положительных контрольных антител кролика против токсина A. mAb A50-10, А56-33 и А58-46 не нейтрализовали токсин А. Контроль, представляющий собой только клетки, имел 1-1,5×10⁶ RLU.

На Фиг.19 представлено картирование 8 групп эпитопов mAb к токсину В с помощью BiaCore.

На Фиг.20А-С представлены синергетические нейтрализующие активности комбинаций mAb к токсину А: Добавление различных разведении нейтрализующих антител А60-22, А65-33 и A80-29 к возрастающим концентрациям А3-25 mAb синергетическим путем повышало нейтрализацию токсина А независимо от разведения. Проиллюстрирован контроль RLU только токсина А (4х EC₅₀) (менее 0,3×10⁶), а контроли, представляющие собой только клетки, имели 2-2,5×10⁶ RLU, как изображено на графиках, показанных на Фиг.20 В и Фиг.20С.

На Фиг.21 представлены синергетические нейтрализующие активности mAb к токсину В: Нейтрализация токсина В антителами mAb 8-26, В60-2 и В59-3 проиллюстрирована на Фиг.21А. Нейтрализация токсина В возрастала синергетическим путем после объединения В8-26 с разведениями В59-3 (Фиг.21В).

На Фиг.22 представлены результаты Вестерн-блота, показывающие, что экспрессия ГТФазы Rac1 снижена в экстрактах, обработанных генетическим мутантным токсином В (SEQ ID NO:6) с 24 до 96 часов, но не снижена в экстрактах, обработанных токсином В (SEQ ID NO:2) дикого типа. Результаты блота также показывают, что Rac1 гликозилирован в экстрактах, обработанных токсином В, но не гликозилирован в экстрактах, обработанных генетическим мутантным токсином В.

На Фиг.23А-К представлены графики, на которых показаны результаты тестов цитотоксичности in vitro, в которых уровни АТФ (RLU) нанесены на график против возрастающих концентраций культуральной среды С.difficile и пула сывороток хомячков (■); необработанный токсин (собранная культуральная среда) от соответствующего штамма и пул сывороток хомячка (●); очищенный токсин (коммерческий токсин, полученный от List Biologicals) и пул сывороток хомячка (▲); необработанный токсин (▼), контроль; и очищенный токсин (♦), контроль. Токсины из соответствующих штаммов добавляли к клеткам при значениях 4×ЕС₅₀. На фиг.23 показано, что иммуногенная композиция, включающая мутантный TcdA (SEQ ID NO:4) и мутантный TcdB (SEQ ID NO:6), где мутантные токсины были инактивированы EDC в соответствии, например, с Примером 29, таблицей 15, описанной здесь, индуцировала нейтрализующие антитела, которые проявляли нейтрализующую активность против токсинов по меньшей мере из следующих 16 различных штаммов CDC С.difficile по сравнению с соответствующим контролем, представляющим собой только токсин: 2007886 (Фиг.23А); 2006017 (Фиг.23В); 2007070 (Фиг.23С); 2007302 (Фиг.23D); 2007838 (Фиг.23Е); 2007886 (Фиг.23F); 2009292 (Фиг.23G); 2004013 (Фиг.23Н); 2009141 (Фиг.231); 2005022 (Фиг.23J); 2006376 (Фиг.23К).

На Фиг.24 представлена иллюстрация примерной инактивации EDC/NHS мутантных токсинов С.difficile, приводящей в результате по меньшей мере к трем возможным типам модификаций: поперечным сшивкам, образованию аддуктов глицина и аддуктов бета-аланина. Панель А иллюстрирует поперечное сшивание. Карбоксильные остатки тройных мутантных токсинов инактивируют добавлением EDC и NHS. Активированные эфиры взаимодействуют с первичными аминами с образованием стабильных амидных связей, приводящих в результате к внутри- и межмолекулярным поперечным сшивкам. Панель В иллюстрирует образование аддуктов глицина. После инактивации остаточные активированные сложные эфиры гасят добавлением глицина с образованием стабильных амидных связей. Панель С иллюстрирует образование аддуктов бета-аланина. Три моль NHS может взаимодействовать с одним моль EDC с образованием активированного бета-аланина. Затем он взаимодействует с первичными аминами с образованием стабильных амидных связей.

На Фиг.25 представлена иллюстрация примерной инактивации EDC/NHS мутантных токсинов С.difficile, приводящей в результате по меньшей мере к одному из следующих типов модификаций: поперечные сшивки, аддукты глицина и аддукты бета-аланина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:1 описывает аминокислотную последовательность токсина А С.difficile 630 (TcdA) дикого типа.

SEQ ID NO:2 описывает аминокислотную последовательность токсина В С.difficile 630 (TcdB) дикого типа.

SEQ ID NO:3 описывает аминокислотную последовательность мутантного TcdA, имеющего мутацию в положениях 285 и 287 по сравнению с SEQ ID NO:1.

SEQ ID NO:4 описывает аминокислотную последовательность мутантного TcdA, имеющего мутацию в положениях 285, 287 и 700 по сравнению с SEQ ID NO:1.

SEQ ID NO:5 описывает аминокислотную последовательность мутантного TcdB, имеющего мутацию в положениях 286 и 288 по сравнению с SEQ ID NO:2.

SEQ ID NO:6 описывает аминокислотную последовательность мутантного TcdB, имеющего мутацию в положениях 286, 288 и 698 по сравнению с SEQ ID NO:2.

SEQ ID NO:7 описывает аминокислотную последовательность мутантного TcdA, имеющего мутацию в положениях 269, 272, 285, 287, 460, 462 и 700 по сравнению с SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:8 описывает аминокислотную последовательность мутантного TcdB, имеющего мутацию в положениях 270, 273, 286, 288, 461, 463 и 698 по сравнению с SEQ ID NO:2

SEQ ID NO:9 описывает последовательность ДНК, кодирующую токсин А С.difficile 630 (TcdA) дикого типа.

SEQ ID NO:10 описывает последовательность ДНК, кодирующую токсин В С.difficile 630 (TcdB) дикого типа.

SEQ ID NO:11 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO:3.

SEQ ID NO:12 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO:4.

SEQ ID NO:13 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO:5.

SEQ ID NO:14 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO:6.

SEQ ID NO:15 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile R20291 дикого типа.

SEQ ID NO:16 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 15.

SEQ ID NO:17 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile CD196 дикого типа.

SEQ ID NO:18 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 17.

SEQ ID NO:19 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile VPI10463 дикого типа.

SEQ ID NO:20 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 19.

SEQ ID NO:21 описывает аминокислотную последовательность TcdB С.difficile R20291 дикого типа.

SEQ ID NO:22 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO:21.

SEQ ID NO:23 описывает аминокислотную последовательность TcdB С.difficile CD196 дикого типа.

SEQ ID NO:24 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 23.

SEQ ID NO:25 описывает аминокислотную последовательность TcdB С.difficile VPI10463 дикого типа.

SEQ ID NO:26 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO:27 описывает последовательность ДНК локуса патогенности С.difficile VPI10463 дикого типа.

SEQ ID NO:28 описывает аминокислотную последовательность для остатков 101-293 SEQ ID NO:1.

SEQ ID NO:29 описывает аминокислотную последовательность для остатков 1-542 SEQ ID NO:1.

SEQ ID NO:30 описывает аминокислотную последовательность для остатков 101-293 SEQ ID NO:2.

SEQ ID NO:31 описывает аминокислотную последовательность для остатков 1-543 SEQ ID NO:2.

SEQ ID NO:32 описывает аминокислотную последовательность для остатков 543-809 SEQ ID NO:1.

SEQ ID NO:33 описывает аминокислотную последовательность для остатков 544-767 SEQ ID NO; 2.

SEQ ID NO:34 описывает аминокислотную последовательность мутантного TcdA, в которой остатки 101, 269, 272, 285, 287, 460, 462, 541, 542, 543, 589, 655 и 700 могут представлять собой любую аминокислоту.

SEQ ID NO:35 описывает аминокислотную последовательность мутантного TcdB, в которой остатки 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698 и 751 могут представлять собой любую аминокислоту.

SEQ ID NO:36 описывает аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdA С.difficile (A3-25 mAb).

SEQ ID NO:37 описывает аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdA С.difficile (A3-25 mAb).

SEQ ID NO:38 описывает аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdA С.difficile (A3-25 mAb).

SEQ ID NO:39 описывает аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdA С.difficile (A3-25 mAb).

SEQ ID NO:40 описывает аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdA С.difficile (A3-25 mAb).

SEQ ID NO:41 описывает аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdA С.difficile (A3-25 mAb).

SEQ ID NO:42 описывает аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdA С.difficile (A3-25 mAb).

SEQ ID NO:43 описывает аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdA С.difficile (A3-25 mAb).

SEQ ID NO:44 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO:3.

SEQ ID NO:45 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO:4.

SEQ ID NO:46 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO:47 описывает последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO:6.

SEQ ID NO:48 описывает нуклеотидную последовательность иммуностимуляторного олигонуклеотида ODN CpG 24555.

SEQ ID NO:49 описывает аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (В8-26 mAb).

SEQ ID NO:50 описывает аминокислотную последовательность сигнального пептида вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B8-26 mAb).

SEQ ID NO:51 описывает аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B8-26 mAb).

SEQ ID NO:52 описывает аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B8-26 mAb).

SEQ ID NO:53 описывает аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B8-26 mAb).

SEQ ID NO:54 описывает аминокислотную последовательность константной области вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B8-26 mAb).

SEQ ID NO:55 описывает аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B8-26 mAb).

SEQ ID NO:56 описывает аминокислотную последовательность сигнального пептида вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B8-26 mAb).

SEQ ID NO:57 описывает аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B8-26 mAb).

SEQ ID NO:58 описывает аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B8-26 mAb).

SEQ ID NO:59 описывает аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B8-26 mAb).

SEQ ID NO:60 описывает аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (В59-3 mAb).

SEQ ID NO:61 описывает аминокислотную последовательность сигнального пептида вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B59-3 mAb).

SEQ ID NO:62 описывает аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (В59-3 mAb).

SEQ ID NO:63 описывает аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (В59-3 mAb).

SEQ ID NO:64 описывает аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (В59-3 mAb).

SEQ ID NO:65 описывает аминокислотную последовательность константной области вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B59-3 mAb).

SEQ ID NO:66 описывает аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B59-3 mAb).

SEQ ID NO:67 описывает аминокислотную последовательность сигнального пептида вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B59-3 mAb).

SEQ ID NO:68 описывает аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B59-3 mAb).

SEQ ID NO:69 описывает аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B59-3 mAb).

SEQ ID NO:70 описывает аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B59-3 mAb).

SEQ ID NO:71 описывает аминокислотную последовательность вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (В9-30 mAb).

SEQ ID NO:72 описывает аминокислотную последовательность сигнального пептида вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B9-30 mAb).

SEQ ID NO:73 описывает аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B9-30 mAb).

SEQ ID NO:74 описывает аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B9-30 mAb).

SEQ ID NO:75 описывает аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B9-30 mAb).

SEQ ID NO:76 описывает аминокислотную последовательность константной области вариабельной тяжелой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B9-30 mAb).

SEQ ID NO:77 описывает аминокислотную последовательность вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B9-30 mAb).

SEQ ID NO:78 описывает аминокислотную последовательность сигнального пептида вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B9-30 mAb).

SEQ ID NO:79 описывает аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B9-30 mAb).

SEQ ID NO:80 описывает аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B9-30 mAb).

SEQ ID NO:81 описывает аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной легкой цепи нейтрализующего антитела к TcdB С.difficile (B9-30 mAb).

SEQ ID NO:82 описывает аминокислотную последовательность мутантного TcdB, где остаток в положении 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698 и 751 может представлять собой любую аминокислоту.

SEQ ID NO:83 описывает аминокислотную последовательность мутантного TcdA, имеющего мутацию в положениях 269, 272, 285, 287, 460, 462 и 700 по сравнению с SEQ ID NO:1, в которой метионин в положении 1 отсутствует.

SEQ ID NO:84 описывает аминокислотную последовательность мутантного токсина А С.difficile, имеющего мутацию в положениях 285, 287 и 700 по сравнению с SEQ ID NO:1, в которой метионин в положении 1 отсутствует.

SEQ ID NO:85 описывает аминокислотную последовательность мутантного токсина В С.difficile, имеющего мутацию в положениях 270, 273, 286, 288, 461, 463 и 698 по сравнению с SEQ ID NO:2, в которой метионин в положении 1 отсутствует.

SEQ ID NO:86 описывает аминокислотную последовательность мутантного токсина В С.difficile, имеющего мутацию в положениях 286, 288 и 698 по сравнению с SEQ ID NO:2, в которой метионин в положении 1 отсутствует.

SEQ ID NO:87 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2004013 дикого типа.

SEQ ID NO:88 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2004111 дикого типа.

SEQ ID NO:89 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2004118 дикого типа.

SEQ ID NO:90 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2004205 дикого типа.

SEQ ID NO:91 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2004206 дикого типа.

SEQ ID NO:92 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2005022 дикого типа.

SEQ ID NO:93 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2005088 дикого типа.

SEQ ID NO:94 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2005283 дикого типа.

SEQ ID NO:95 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2005325 дикого типа.

SEQ ID NO:96 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2005359 дикого типа.

SEQ ID NO:97 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2006017 дикого типа.

SEQ ID NO:98 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2007070 дикого типа.

SEQ ID NO:99 описывает аминокислотную последовательность TcdA С.difficile 2007217 дикого типа.

SEQ ID NO:100 описывает аминокислотную последовательнос