Системы и способы доставки биоактивных средств с применением транспортных последовательностей, происходящих от бактериального токсина

Системы и способы доставки биоактивных средств с применением транспортных последовательностей, происходящих от бактериального токсина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные патентные заявки

Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки США №61/403394, поданной 15 сентября 2010 года, включенной во всей полноте в данный документ посредством ссылки.

Область техники

Область настоящего изобретения относится, отчасти, к стратегии новых фармацевтических применений. Более конкретно, настоящее изобретение относится к нетоксичной мутантной форме гена Cholix (ntCholix) Vibrio cholera, варианту Cholix, усеченному по аминокислоте A³⁸⁶ (Cholix³⁸⁶) и применению других различных полипептидных последовательностей, происходящих от Cholix, для улучшения доставки в кишечник биологически активных терапевтических средств. Важно, что системы и способы, описанные в данном документе, предусматривают следующее: возможность доставлять дозы макромолекул без инъекций; возможность доставлять груз, такой как (но без ограничений) siRNA или антисмысловые молекулы, во внутриклеточные компартменты, где требуется их активность; и доставку наночастиц и носителей на основе дендримеров через биологические мембраны, которая иначе была бы затруднена из-за барьерных свойств большинства таких мембран.

Предшествующий уровень техники

Большинство разрешенных в настоящее время низкомолекулярных лекарственных средств всасывается через слизистую оболочку тонкого кишечника для обеспечения доставки в системный кровоток. Фактически, низкомолекулярные лекарственные средства отбираются на основе их стабильности и эффективного всасывания через слизистую оболочку кишечника. Подобная пероральная доставка биологически активных полипептидов (означает полимер, состоящий из аминокислотных остатков; как правило, обозначается как белок или пептид) составляла долговременную цель фармацевтической промышленности. Поскольку желудочно-кишечный (GI) тракт приспособлен для переваривания белков и пептидов, поступающих с пищей, существуют многочисленные физические, физиологические и биологические барьеры, которые ограничивают применимость поглощения терапевтических белков и пептидов из кишечника способом, аналогичным таковому, достигаемому с малыми молекулами; Mahato, R.I., et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 20(2-3): p.153-214 (2003).

Был установлен ряд технологий, которые можно применять для защиты терапевтических белков и пептидов на протяжении желудка, позволяющих им достигать всасывающей поверхности эпителиальных клеток в тонком кишечнике и отделяющих их от условий желудка и кишечника, которые функционируют для разрушения белков и пептидов, поступающих с пищей. К сожалению, однако, эффективный транспорт через этот простой одинарный слой клеток остается существенным препятствием вследствие внутриклеточного направленного перемещения к деструктивным лизосомным компартментам после эндосомального поглощения полипептидов на поверхности просвета; Woodley, J.F., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 11(2-3): p.61-95 (1994). В действительности, этот барьер приспособлен для ингибирования поглощения белков и пептидов до тех пор, пока эти макромолекулы могут в достаточной степени разрушиться для всасывания посредством переносчиков аминокислот и ди- или трипептидов. В связи с этим был предпринят ряд попыток преодоления физических, физиологических и биологических барьеров слизистой оболочки кишечника.

Существуют два основных пути через простой эпителий, который образует клеточный барьер слизистой оболочки кишечника. Конкретно, после прохождения через покрывающий слой слизи молекула может двигаться между соседними эпителиальными клетками (околоклеточный путь) или двигаться через клетки (трансклеточный путь) с помощью серии везикул, которые направленно перемещаются внутри, но не сливаются содержимым с цитоплазмой; Т. Jung et al., Eur J Pharm Biopharm, 50: 147-160 (2000). Другими словами, в обоих путях транспортируемое белковое или пептидное терапевтическое средство не входит в клетку, а скорее остается в среде, внешней относительно цитоплазмы клетки.

Важнейшим барьером для случайного перемещения терапевтического белка и перемещения пептида через околоклеточный путь служит комплекс из белков на апикальной шейке этих клеток, известный как плотный контакт (TJ). Хотя временное открывание и закрывание структур TJ может облегчать транспорт пептидов через эпителий кишечника, данный подход имеет ключевые ограничения: например, он не вполне применим для молекул свыше ~5 кДа; имеется возможность для неселективного поступления материалов в организм из просвета кишечника; и он представляет собой путь, в который вовлекается только небольшая часть площади поверхности эпителия кишечника.

Важнейшим барьером для случайной миграции белковых или пептидных терапевтических средств через клетки с помощью трансклеточного пути является стандартное направленное перемещение везикул, при помощи которого содержимое этих везикул доставляется в деструктивный (лизосомальный) путь. По сравнению с околоклеточным путем перемещение благодаря везикулярному трансклеточному пути может приспосабливаться для материалов диаметром до 100 нм, причем в него вовлекается по существу вся поверхность эпителиальной клетки, и оно может быть высокоселективным в отношении поглощения материалов благодаря применению взаимодействий рецептор-лиганд для поступления в везикулу. Таким образом, трансклеточный путь является очень привлекательным для эпителиального транспорта белковых или пептидных терапевтических средств, если при этом можно избежать деструктивного пути.

У некоторых патогенов решена проблема направленного перемещения через барьер, как показано при помощи эффективного трансцитоза секретируемых полипептидных факторов вирулентности, которые функционируют для содействия и/или стабилизации инфекции хозяина. Экзотоксины представляют собой класс белков, высвобождаемых множеством микроорганизмов, которые действуют как сильные факторы вирулентности. Экзотоксины воздействуют на многоклеточные организмы, а также обладают способностью действовать как сильные токсины у человека; Roszak, D.B., and Colwell, R.R., Microbiol Rev 51: 365-379 (1987). Эти белки обычно убивают или инактивируют клетки-хозяева посредством механизмов, которые включают селективное нарушение синтеза белка. В соответствии с этим всего несколько молекул требуется для того, чтобы убить, что согласуется с наблюдением, что бактериальные экзотоксины известны как одни из наиболее токсичных средств. Подкласс этих белков включает семейство белков, которое состоит из дифтерийного токсина (DT) из Corynebacterium diphtheria, экзотоксина A из Pseudomonas aeruginosa (PE) и недавно идентифицированного белка, названного Cholix из Vibrio cholera, функционирующего для интоксикации клеток-хозяев посредством ADP-рибозилирования фактора элонгации 2 (EF2); Yates, S.P., et al., Trends Biochem Sci, 31: 123-133 (2006). Эти экзотоксины синтезируются в виде одной цепи из аминокислот, которая сворачивается в отдельные домены, которые, как было установлено, имеют специфические функции в нацеливании, проникновении и интоксикации клеток-хозяев.

Недавно была описана биология экзотоксина A из Pseudomonas aeruginosa (PE); Mrsny, R.J., et al., Drug Discov Today, 7(4): p.247-58 (2002). РЕ состоит из одной цепи из 613 аминокислот с теоретическим молекулярным весом (MW) 66828,11 Да, изоэлектрической точкой (pl) 5,28, которая функционально сворачивается в три отдельных домена, обозначенные домен I (Ala¹-Glu²⁵²), домен II (Gly²⁵³-Asn³⁶⁴), домен III (Gly⁴⁰⁵-Lys⁶¹³, который содержит область с ADP-рибозилтрансферазной активностью), и короткую связанную дисульфидной связью петлю, связывающую домены II и III, которая известна как Ib-петля (Ala³⁶⁵-Gly⁴⁰⁴). Организация этих доменов при pH 8,0 была определена на основе дифракции на кристалле при разрешении ~1,5 Å; Wedekind, J.E. et al., J Mol Biol, 314: 823-837 (2001). Домен I (Ia+Ib) имеет сердцевину, образованную 13-нитчатым β-рулетом, домен II состоит из шести α-спиралей, и домен III имеет сложную α/β-упорядоченную структуру. При помощи исследований подтвердилась идея, что блочная природа PE обеспечивает функции отдельных доменов: домен I связывается с рецепторами клетки-хозяина, домен II вовлекается в перемещение через мембрану, и домен III функционирует как ADP-рибозилтрансфераза. По-видимому, PE секретируется Р. aeruginosa в непосредственной близости от апикальной поверхности эпителиальной клетки, возможно в ответ на стимулы среды и/или клеточные сигналы; Deng, Q. and J.T. Barbieri, Annu Rev Microbiol, 62: p.271-88 (2008). Сразу после секреции происходит интернализация внутрь клеток после того, как домен I PE связывается с мембранным белком α2-макроглобулином, белком, который также известен как белок 1, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP1) или CD91; смотри, например, FitzGeraId, D.J., et al., J Cell Biol, 129(6): p.1533-41 (1995); Kounnas, M.Z., et al., J Biol Chem, 267(18); p.12420-3 (1992). После интернализации PE избегает направленного перемещения к лизосоме, а вместо этого эффективно доставляется к базолатеральной поверхности клетки, где он высвобождается в биологически активной форме; Mrsny, R.J., et al., Drug Discov Today, 7(4): p.247-58 (2002). После прохождения через эпителий PE функционирует как фактор вирулентности, проникая в CD91-положительные клетки в подслизистом пространстве (макрофаги и дендритные клетки), где он затем проходит через путь разворачивания, что приводит к доставке в цитоплазму домена III; смотри, например, Mattoo, S., Y.M. Lee, and J.E. Dixon, Curr Opin Immunol, 19(4): p.392-401 (2007); Spooner, R.A., et al., Virol J, 3: p.26 (2006).

Бактерия Vibrio cholerae наиболее известна благодаря своему одноименному средству вирулентности, холерному токсину (CT), который может вызывать острую опасную для жизни тяжелую водянистую диарею. CT представляет собой белковый комплекс, состоящий из одной субъединицы A, сгруппированной с пентамером из субъединиц B, который связывается с ганглиозидными структурами G_M1 клеточной поверхности на апикальной поверхности эпителия. CT секретируется V. cholera после горизонтального переноса генов с вирулентными штаммами V. cholerae, несущими вариант лизогенного бактериофага, называемого CTXf или CTXφ. Последние вспышки холеры, однако, позволили предположить, что штаммы некоторых серогрупп (не-O1, не-O139) не экспрессируют CT, а скорее используют другие факторы вирулентности. Подробные анализы данных из окружающей среды и клинических данных применительно к не-O1, не-O139 позволили предположить наличие нового предполагаемого секретируемого экзотоксина с некоторым сходством с PE.

Jorgensen, R. et al., J Biol Chem, 283(16): 10671-10678 (2008) сообщили, что некоторые штаммы V. cholerae, в самом деле, действительно содержали белковый токсин, сходный с PE, который они назвали токсин Cholix (Cholix). По сравнению с PE Cholix имеет немного больший теоретический MW (70703,89 Да) и немного более кислую теоретическую pl (5,12). Кристаллическая структура белка Cholix из 634 аминокислот была проанализирована при ~2 Å. Было обнаружено, что доменная структура и организация в чем-то сходны с PE: домен I (Val¹-Lys²⁶⁵), домен II (Glu²⁶⁶-Ala³⁸⁶), домен III (Arg⁴²⁶-Lys⁶³⁴) и Ib-петля (Ala³⁸⁷-Asn⁴²⁵). Дополнительное структурное сходство с PE включает: сайт для фуриновой протеазы для активации в клетке; C-концевую последовательность KDEL, которая может направлять токсин в эндоплазматический ретикулум клетки-хозяина; и область с ADP-рибозилтрансферазной активностью в пределах домена III.

Примечательно, что PE и Cholix не обладают значительным генетическим сходством и ограниченным сходством по аминокислотному выравниванию. Исследование генома V. cholera на РЕ-подобные нуклеотидные последовательности не приводит в результате к совпадению любого рода. Только на уровне белковой последовательности имеется намек на то, что PE-подобный белок может продуцироваться этой бактерией. Даже в этом случае, имеется только 32% гомологии между аминокислотными последовательностями PE и Cholix со сходством (42% гомологии), сосредоточенным в ADP-рибозилирующих элементах домена III, и с низкими уровнями аминокислотной гомологии (~15-25%) для большинства сегментов доменов I и II применительно к двум белкам. Более того, эта общая конфигурация Cholix по сравнению с PE даже более примечательна, поскольку эти два белка со сходными элементами произошли от двух различных направлений: Р. aeruginosa представляет собой GC-богатую бактерию, тогда как V. cholera является AT-богатой. То, что эти два токсина, возникшие в двух различных генетических направлениях, пришли к почти одинаковой структуре, но только с 32% аминокислотной гомологии, позволяет предположить, что структурное и функциональное сходство Cholix и PE, вероятно, основано на сходных прессах выживания, а не посредством сходных генетических основ. Очень низкая аминокислотная гомология доменов I и II применительно к этим двум белкам подчеркивает функциональную важность свернутых структур этих двух белков, а не их аминокислотных последовательностей.

По-видимому, C-концевой участок Cholix и PE функционирует при интоксикации клеток посредством ADP-рибозилирования EF2 сходным образом. Недавние исследования, в которых вторую половину Cholix (домен 1 разрушен) нацеливали на раковые клетки посредством конъюгации с антителом, направленным на трансферриновый рецептор, позволяют предположить, что C-концевые участки PE и Cholix, вовлеченные в ADP-рибозилирование EF2, действительно функционально подобны; Sarnovsky, R., et al., Cancer Immunol Immunother 59: 737-746 (2010). Хотя этот дистальный участок Cholix на 36% идентичен и на 50% сходен с PE, поликлональные иммунные сыворотки, вырабатывающиеся у животных, а также сыворотки от больных с нейтрализующими иммунными ответами на этот аналогичный дистальный участок PE, не дает перекрестной реакции с этим вторым участком Cholix. Аналогично, иммунная сыворотка, вырабатывающаяся на этот Cholix, не дает перекрестной реакции с PE. Эти данные позволяют предположить, что хотя как PE, так и Cholix имеют способность к интоксикации клеток посредством сходного механизма, и эти два белка имеют общую структуру сердцевины, имеются выраженные различия в их элементах, которые экспрессированы на поверхности этих белков.

Поскольку предыдущие исследования с применением PE показали, что этот токсин легко транспортируется через поляризованные монослои эпителиальных клеток in vitro и in vivo без интоксикации; Mrsny, R.J., et al., Drug Discov Today, 7(4): p.247-58 (2002), была начата исследовательская работа для дополнительной оценки свойств и биологии Cholix с особым вниманием в отношении функциональных аспектов проксимальных участков Cholix; конкретно, в отношении применения доменов I и II для облегчения транспорта через эпителиальные монослои кишечника. Поскольку домены I и IIa, по-видимому, являются единственными необходимыми элементами PE, которые требуются для эпителиального трансцитоза, особенно важным было исследовать эти аналогичные домены у Cholix. Как утверждалось ранее, существует только ~15%-25% аминокислотной гомологии на протяжении большинства областей, которые, как считается, составляют часть доменов I и IIa. Домены были изучены посредством серии исследований: отслеживанием биологического распределения Cholix после нанесения на эпителиальные поверхности in vivo, оценкой характеристик трансклеточного транспорта Cholix через монослои поляризованных эпителиальных клеток in vitro и доставкой биологически активного груза, генетически интегрированного в белок Cholix на его C-конце. Предварительные данные, полученные в результате генетического слияния первых двух доменов Cholix (аминокислоты 1-386) с зеленым флуоресцентным белком (GFP) или химического связывания этих экспрессированных доменов с латексными гранулами диаметром 100 нм, показали, что отмечался транспорт Cholix, присоединенного к 100 нм латексным гранулам, через эпителиальные монослои кишечника in vitro и in vivo. To, что груз GFP сохранял свой флуоресцентный характер во время и после процесса трансцитоза также поддерживает точку зрения, что Cholix использует недеструктивный (или привилегированный) путь направленного перемещения через поляризованные эпителиальные клетки. Этот результат служит хорошим предзнаменованием для его (повторного) применения в качестве инструмента для доставки биологически активных грузов через эпителиальные барьеры организма, например, таковые в дыхательных и желудочно-кишечных трактах.

Также важным примечанием из предварительных исследований является наблюдение, которое позволяет предположить явное различие между PE и Cholix в отношении взаимодействия с клеточными рецепторами. Как утверждалось ранее, PE поступает в эпителиальные клетки после того, как домен I PE связывается с мембранным белком α2-макроглобулином, белком, который также известен как белок 1, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP1) или CD91. Несмотря на то, что точная природа поверхностного рецептора для Cholix не была установлена, предварительные исследования позволяют предположить, что Cholix не приводит к интоксикации некоторых клеточных линий, экспрессирующих CD91, но приводит к интоксикации некоторых клеточных линий, действительно экспрессирующих CD91. В настоящее время не ясно, какие другие рецепторы, кроме CD91, могут вовлекаться в эпителиальный трансцитоз PE. Тем не менее, Cholix и PE, по-видимому, характеризуются отличающимися взаимодействиями с клеточными рецепторами, демонстрирующими явные различия, которые являются достаточными для того, чтобы предположить очень различные и непредвиденные применения в отношении как пероральных биологических препаратов, так и внутриклеточной доставки биоактивных средств.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на свойствах направленного перемещения через мембрану Cholix и обнаружении того, что Cholix эффективно транспортируется через поляризованные эпителиальные клетки воздухоносных путей и кишечника, что позволяет предположить, что полипептидные последовательности, происходящие от Cholix (в том числе проксимальные элементы белка) можно применять для эффективного трансцитоза белка и наночастиц, что представляет стратегию новых фармацевтических применений.

В связи с этим один аспект настоящего изобретения предполагает обеспечение выделенных конструктов для доставки (например, генетические слияния или химические конструкты), содержащих транспортный домен (например, полипептидная последовательность, происходящая от Cholix) и груз. Как транспортный домен, так и груз могут экспрессироваться/связываться в различных стехиометрических соотношениях и пространственной организации. Различные грузы могут также экспрессироваться/связываться на одном и том же конструкте. В предпочтительных вариантах осуществления такой груз может включать один или любой из белков, пептидов, малых молекул, siRNA, PNA, miRNA, ДНК, плазмиды и антисмысловых последовательностей.

Другой аспект настоящего изобретения предполагает обеспечение возможности доставлять груз, такой как макромолекулы, без инъекций.

Другой аспект настоящего изобретения предполагает обеспечение возможности доставлять груз, такой как (но без ограничений) макромолекулы, малые молекулы, siRNA, PNA, miRNA, ДНК, плазмида и антисмысловые молекулы, во внутриклеточные компартменты, где требуется их активность.

Другой аспект настоящего изобретения предполагает обеспечение транспорта груза путем доставки наночастиц и/или носителей на основе дендримеров через биологические мембраны.

Способы введения/доставки, предполагаемые для применения в настоящем изобретении, включают, например, пероральное введение, ингаляционное введение, интраназальное введение, буккальное введение, сублингвальное введение, глазное введение (в том числе, но без ограничений, доставка к стекловидному телу, роговице, конъюктиве, склере и задней и передней камерам глаза), местное нанесение, инъекцию (с иглой или без иглы), внутривенную инфузию, применение микроиглы, введение с помощью состава лекарственное депо, введение с помощью внутриоболочечного применения, введение с помощью внутрибрюшинного применения, введение с помощью внутрисуставного применения, доставку внутриклеточно, доставку через гематоэнцефалический барьер, доставку через гематоретинальный барьер, вводимые для локальной доставки и действия и/или доставляемые для системной доставки.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую конструкты для доставки и фармацевтически приемлемый носитель.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1 изображен обзор стратегии, примененной для C-концевой модификации ntCholix для облегчения слияния с грузом, причем в данном случае груз представляет собой флуоресцентный краситель Alexa488.

На фигуре 2 изображен транспорт ntCholix-Alexa488® через поляризованные эпителиальные клетки кишечника in vitro. Монослои клеток Caco-2 подвергли воздействию тестируемых материалов в течение 4 часов. Процентную долю транспортированного материала определили посредством анализа стандартной кривой флуоресценции, присутствующей в образцах, и представили как среднюю величину (N=4). В качестве контроля применили BSA-Alexa488.

Вариант(ы) осуществления изобретения

Как будет понятно специалистам в данной области техники, вышеприведенное описание подробно описывает определенные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и, таким образом, является только образцом и не отображает действительный объем настоящего изобретения. Также будет понятно, что терминология, используемая в данном документе, служит только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, определяемого посредством прилагаемой формулы изобретения.

Если не определяется иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Используемые в данном документе следующие термины имеют значение, приписываемое им, если не указывается иное.

Исследования, лежащие в основе настоящего изобретения, относятся к применению в качестве транспортного домена полипептидных последовательностей, происходящих от Cholix, которые будут применяться для получения выделенных конструктов для доставки для улучшения доставки в кишечник биологически активных терапевтических средств. Важно, что системы и способы, описанные в данном документе, предусматривают следующее: возможность доставлять дозы макромолекул без инъекций; возможность доставлять "груз" во внутриклеточные компартменты, где требуется их активность; и доставку наночастиц и/или носителей на основе дендримеров через биологические мембраны, которая иначе была бы затруднена из-за барьерных свойств большинства таких мембран.

Зрелый токсин Cholix ("Cholix") представляет собой чрезвычайно активный мономерный белок (молекулярный вес 70 кДа), секретируемый Vibrio cholerae, который состоит из трех выступающих глобулярных доменов (Ia, II и III) и одного небольшого субдомена (Ib), который соединяет домены II и III. Аминокислотная последовательность зрелого Cholix представлена в Jorgensen, R. et al., J Biol Chem, 283(16): 10671-10678 (2008) и ссылках, цитируемых там. Полипептидные последовательности, происходящие от Cholix, применяемые в получении выделенных конструктов для доставки по настоящему изобретению, будут происходить из описанной в литературе белковой последовательности из 634 аминокислот зрелого Cholix.

Таким образом, конструкты для доставки по настоящему изобретению содержат транспортный домен. Используемый в данном документе "транспортный домен" означает структурные домены, которые способны выполнять определенные функции, например, клеточное распознавание (т.е. включают рецептор-связывающий домен) и трансцитоз (т.е. включают домен для трансцитоза). В основном, транспортные домены, которые применяются в получении конструктов для доставки по настоящему изобретению, представляют собой полипептидные последовательности, происходящие от Cholix, имеющие структурные домены, соответствующие функциональным доменам, например, Ia и II, Cholix.

Наряду с участками молекулы, которые соответствуют функциональным доменам Cholix, конструкты для доставки по настоящему изобретению могут дополнительно включать макромолекулу для доставки в биологический компартмент субъекта. В определенных вариантах осуществления макромолекула выбирается из группы из нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида, белка, полисахарида и липида. В дополнительных вариантах осуществления полипептид выбирается из группы, состоящей из полипептидных гормонов, цитокинов, хемокинов, факторов роста и факторов свертывания крови, которые обычно вводятся субъектам посредством инъекции. Последовательности всех этих макромолекул хорошо известны специалистам в данной области техники, а присоединение этих макромолекул к конструктам для доставки находится в пределах навыков специалиста в данной области техники при применении стандартных методик.

Макромолекула может вводиться в любой участок конструкта для доставки так, чтобы при этом не нарушить активность клеточного связывания или трансцитоза. Макромолекула соединяется с остальной частью конструкта для доставки через расщепляемый линкер. "Линкер" означает молекулу, которая соединяет две другие молекулы, либо ковалентно, либо посредством ионных, ван-дер-ваальсовых или водородных связей, например, молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с одной комплементарной последовательностью на 5'-конце и с другой комплементарной последовательностью на 3'-конце, тем самым соединяя две некомплементарные последовательности. "Расщепляемый линкер" означает линкер, который может распадаться или иным образом разъединяется с отделением двух компонентов, связанных расщепляемым линкером. Расщепляемые линкеры обычно расщепляются под действием ферментов, как правило, пептидаз, протеаз, нуклеаз, липаз и т.п. Расщепляемые линкеры могут также расщепляться под действием стимулов среды, таких как, к примеру, изменения температуры, pH, концентрации солей и т.д., если такое изменение происходит в среде после трансцитоза конструкта для доставки через поляризованную эпителиальную мембрану.

В определенных вариантах осуществления конструкты для доставки дополнительно содержат вторую макромолекулу, которая выбирается из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида, белка, липида и малой органической молекулы, и второй расщепляемый линкер, где расщепление в указанном втором расщепляемом линкере отделяет указанную вторую макромолекулу от остальной части указанного конструкта. В определенных вариантах осуществления первая макромолекула представляет собой первый полипептид, а указанная вторая макромолекула представляет собой второй полипептид. В определенных вариантах осуществления первый полипептид и второй полипептид ассоциируются с образованием мультимера. В определенных вариантах осуществления мультимер представляет собой димер, тетрамер или октамер. В дополнительных вариантах осуществления димер представляет собой антитело.

В определенных вариантах осуществления макромолекулу можно выбрать так, чтобы она не была расщепляемой ферментом, присутствующим на базально-латеральной мембране эпителиальной клетки. К примеру, анализы, описанные в примерах, можно применять для стандартного тестирования того, может ли такой расщепляющий фермент расщеплять макромолекулу, подлежащую доставке. Если да, то макромолекулу можно изменить стандартным образом для того, чтобы исключить непригодную аминокислотную последовательность, распознаваемую расщепляющим ферментом. Измененную макромолекулу затем можно протестировать для того, чтобы удостовериться, что она сохраняет активность, с применением стандартных в области техники способов.

В определенных вариантах осуществления первый и/или второй расщепляемый линкер расщепляется под действием фермента, который проявляет более высокую активность на базально-латеральной стороне поляризованной эпителиальной клетки, чем на апикальной стороне поляризованной эпителиальной клетки. В определенных вариантах осуществления первый и/или второй расщепляемый линкер расщепляется под действием фермента, который проявляет более высокую активность в плазме, чем на апикальной стороне поляризованной эпителиальной клетки.

В определенных вариантах осуществления расщепляемый линкер можно выбрать исходя из последовательности таким образом, чтобы в случае пептидной, полипептидной или белковой макромолекул для доставки избежать применения расщепляемых линкеров, которые содержат последовательности, присутствующие в макромолекуле, подлежащей доставке. К примеру, если макромолекула содержит AAL, то расщепляемый линкер можно выбрать таким образом, чтобы он расщеплялся под действием фермента, который не распознает данную последовательность.

Наряду с участками молекулы, которые соответствуют функциональным доменам Cholix, конструкты для доставки по настоящему изобретению могут дополнительно содержать "груз" для доставки во внутриклеточные компартменты, где требуется их активность. "Груз", используемый в данном документе, включает, но без ограничений: макромолекулы, малые молекулы, siRNA, PNA, miRNA, ДНК, плазмиду и антисмысловые молекулы. Другие примеры груза, который может доставляться в соответствии с настоящим изобретением, включают, но без ограничений, противоопухолевые соединения, такие как нитрозомочевины, например кармустин, ломустин, семустин, стрептозотоцин; метилгидразины, например прокарбазин, дакарбазин; стероидные гормоны, например глюкокортикоиды, эстрогены, прогестины, андрогены, тетрагидродезоксикортикостерон; иммуноактивные соединения, такие как иммуносупрессоры, например пириметамин, триметоптерин, пеницилламин, циклоспорин, азатиоприн; и иммуностимуляторы, например левамизол, диэтилдитиокарбамат, энкефалины, эндорфины; противомикробные соединения, такие как антибиотики, например бета-пактам, пенициллин, цефалоспорины, карбапенемы и монобактамы, ингибиторы бета-лактамазы, аминогликозиды, макролиды, тетрациклины, спектиномицин; противомалярийные средства, амебициды; противопротозойные средства; противогрибковые средства, например амфотерицин бета, противовирусные средства, например ацикловир, идоксуридин, рибавирин, трифлуридин, видарбин, ганцикловир; паразитициды; антигельминтики; радиофармацевтические средства; желудочно-кишечные лекарственные средства; гематологические соединения; иммуноглобулины; белки свертывания крови, например антигемофильный фактор, комплекс фактора IX; антикоагулянты, например дикумарол, гепарин Na; ингибиторы фибролизина, например транексамовая кислота; сердечно-сосудистые лекарственные средства; периферические антиадренергические лекарственные средства; гипотензивные лекарственные средства центрального действия, например метилдопа, метилдопа HCl; гипотензивные прямые вазодилататоры, например, диаксозид, гидразин HCl; лекарственные средства, воздействующие на ренин-ангиотензиновую систему; периферические вазодилататоры, например, фентоламин; антиангинальные лекарственные средства; сердечные гликозиды; кардиотонические средства, например амринон, милринон, эноксимон, феноксимон, имазодан, сульмазол; противоаритмические средства; блокаторы входа кальция; лекарственные средства, воздействующие на липиды крови, например ранитидин, бозентан, резулин; респираторные лекарственные средства; симпатомиметические лекарственные средства, например альбутерол, битолтерола мезилат, добутамин HCl, допамин HCl, эфедрин So, эпинефрин, фенфлурамин HCl, изопротеренол HCl, метоксамин HCl, норэпинефрина битартрат, фенилэфрин HCl, ритодрин HCl; холиномиметические лекарственные средства, например, ацетилхолин Cl; антихолинэстеразы, например эдрофоний Cl; реактиваторы холинэстеразы; адреноблокирующие лекарственные средства, например ацебутолол HCl, атенолол, эсмолол HCl, лабеталол HCl, метопролол, надолол, фентоламина мезилат, пропанолол HCl; антимускариновые лекарственные средства, например анизотропинметилбромид, атропин SO₄, клинидиум Br, гликопирролат, ипратропий Br, скополамин HBr; нейромышечные блокирующие лекарственные средства; деполяризующие лекарственные средства, например атракурия безилат, гексафлуорения Br, метокурина иодид, сукцинилхолина Cl, тубокурарина Cl, векурония Br; мышечные релаксанты центрального действия, например баклофен; нейромедиаторы и нейромедиаторные средства, например ацетилхолин, аденозин, аденозинтрифосфат; аминокислотные нейромедиаторы, например, возбуждающие аминокислоты, GABA, глицин; нейромедиаторы биогенные амины, например допамин, эпинефрин, гистамин, норэпинефрин, октопамин, серотонин, тирамин; нейропептиды, оксид азота, токсины K⁺-каналов; антипаркинсонические лекарственные средства, например амальтидин HCl, бензатропина мезилат, карбидопа; диуретические лекарственные средства, например дихлорфенамид, метазоламид, бендрофлуметиазид, политиазид; противомигренозные лекарственные средства, например, карбопроста трометамина мезилат, метисергида малеат. Транспортные домены конструктов для доставки по настоящему изобретению обычно содержат рецептор-связывающий домен. Рецептор-связывающий домен может представлять собой любой рецептор-связывающий домен, известный специалисту в данной области техники, без ограничений для связывания с рецептором клеточной поверхности, который присутствует на апикальной мембране эпителиальной клетки. Предпочтительно, рецептор-связывающий домен специфично связывается с рецептором клеточной поверхности. Рецептор-связывающий домен должен связываться с рецептором клеточной поверхности с достаточным сродством, что делает возможным эндоцитоз конструкта для доставки.

В определенных вариантах осуществления рецептор-связывающий домен может включать пептид, полипептид, белок, липид, углевод или малую органическую молекулу, или их комбинацию. Примеры каждой из данных молекул, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности, присутствующими на апикальной мембране эпителиальных клеток, хорошо известны специалистам в данной области техники. Подходящие пептиды или полипептиды включают, но без ограничений, рецептор-связывающие домены бактериальных токсинов, такие как рецептор-связывающие домены из PE, холерного токсина, токсина Cholix, ботулотоксина, дифтерийного токсина, шига-токсина, шига-подобного токсина и т.д.; антитела, в том числе моноклональные, поликлональные и одноцепочечные антитела или их производные, факторы роста, такие как EGF, IGF-I, IGF-II, IGF-III и т.д.; цитокины, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-6 и т.д.; хемокины, такие как MIP-1a, MIP-1b, MCAF, IL-8 и т.д.; и другие лиганды, такие как CD4, молекулы клеточной адгезии из суперсемейства иммуноглобулинов, интегрины, лиганды, специфичные к рецептору IgA и т.д. Специалист в области техники может выбрать подходящий рецептор-связывающий домен исходя из паттерна экспрессии рецептора, с которым связывается рецептор-связывающий домен.

Рецептор-связывающий домен можно присоединять к остальной части конструкта для доставки посредством любого способа или средств, известных специалисту в данной области техники, пригодных для присоединения таких молекул без ограничений. В определенных вариантах осуществления рецептор-связывающий домен экспрессируется вместе с остальной частью конструкта для доставки в виде белка слияния. Такие варианты осуществления особенно пригодны, когда рецептор-связывающий домен и остальная часть конструкта образованы из пептидов или полипептидов.

Транспортные домены конструктов для доставки по настоящему изобретению дополнительно содержат домен для трансцитоза. Домен для трансцитоза может представлять собой любой домен для трансцитоза, известный специалисту в данной области техники, осуществляющий трансцитоз химерных белков, которые прикрепились к рецептору клеточной поверхности, присутствующему на апикальной мембране эпителиальной клетки. В предпочтительных вариантах осуществления домен для трансцитоза представляет собой домен II Cholix.

Без намерения ограничиваться какой-либо конкретной теорией или механизмом действия полагают, что домен для трансцитоза обеспечивает направленное перемещение конструкта для доставки через поляризованную эпителиальную клетку после того, как конструкт связывается с рецептором, присутствующим на апикальной поверхности поляризованной эпителиальной клетки. Такое направленное перемещение через поляризованную эпителиальную клетку называется в данном документе "трансцитозом". Данное направленное перемещени