По существу нетоксичный мутеин альфа-токсина clostridium perfringens и кодирующая его молекула нуклеиновой кислоты

По существу нетоксичный мутеин альфа-токсина clostridium perfringens и кодирующая его молекула нуклеиновой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка является непредварительной заявкой, по которой испрашивается приоритет согласно 35 U.S.С. § 119(е) в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №60/792553, поданной 17 апреля 2006 года, содержание которой включено в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки.

Область, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к аттенуированным микроорганизмам Clostridium, способам их получения и применения и мутеинам альфа-токсина и кодирующим их нуклеиновым кислотам.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Анаэробные бактериальные патогены представляют собой серьезную экономическую проблему для сельского хозяйства. Особую проблему представляют бактерии семейства Clostridium, поскольку эти бактерии вызывают серьезные заболевания домашней птицы и других экономически ценных домашних животных. Предыдущие попытки борьбы с этими микроорганизмами основывались на санитарных мерах и введении в корм для животных антибиотиков.

В частности, Clostridium perfringens («С.perfringens») представляет собой анаэробную бактерию, наблюдаемую в почве, разлагающемся органическом веществе и в составе кишечной флоры людей и животных. Различные штаммы С.perfringens обозначены как биотипы А-Е в зависимости от спектра продуцируемых токсинов [Justin et al., Biochemistry 41, 6253-6262 (2002); McDonel (1986) PHARMACOLOGY OF BACTERIAL TOXINS: F Dorner and J Drews (Eds.) Pergamon Press, Oxford]. Штаммы биотипа А имеют особую значимость как этиологические агенты различных типов гангрены и кишечных заболеваний. Особенно серьезным кишечным заболеванием, вызываемым С.perfringens, является enteritis necroticans (также известный как «некротический энтерит»), гангрена кишечника, приводящая к некрозу, сепсису и гемолизу, как у людей, так и у домашних животных [см., Pearson et al., J. Am. Vet. Med. 188(11):1309-10 (1986); Al-Sheikhy and Truscott, Avian Dis. 21(2):256-63 (1977)]. Для птиц, например, кур (Gallus gallus), некротический энтерит является существенной проблемой. С.perfringens типа А или типа С могут быть причиной крупных потерь, особенно, в производстве цыплят-бройлеров [Ficken and Wages, Necrotic Enteritis, In Diseases of Poultry, 10th Ed. pp.261-264 (1997)]. Помимо потерь, связанных со вспышками некротического энтерита, сообщается, что в стадах, страдающих заболеванием, связанным с С.perfringens, продуктивность снижается [Lovl and Kaldhusdal, Avian Pathology 30:73-81 (2001)]. Как отмечено выше, самым распространенным способом борьбы являются антибактериальные средства, вносимые в корм для животных. Однако, антибактериальные средства, например, антибиотики, дорогостоящи и вызывают все большую озабоченность, связанную с развитием бактериальной резистентности.

Позднее были сделаны попытки приготовить вакцины против патогенных штаммов Clostridium. Например, Lovland et al. [Avian Pathology 33(1):83-92 (2004)] продемонстрировали кандидатные вакцины на основе анатоксинов С.perfringens типа А и типа C с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта. Сообщалось, что вакцинация несушек обеспечивала наработку специфичных антител для защиты потомства от поражений кишечника, путем субклинического заражения С.perfringens. Известны другие вакцины на основе анатоксинов, приготовленные на основе обезвреженных токсинов С.perfringens [см., например, патент США №4292307, в котором описаны анатоксины С.perfringens типов А, В и D, Cl. oedematiens и Cl. septicum].

Также были предложены препараты рекомбинантных анатоксинов. Например, Titball et al. [патенты США №№5851827, 6403094 и 5817317] описывают нуклеиновые кислоты, которые кодируют антигенные пептиды С.perfringens, а также сами пептиды, и вакцины, приготовленные на основе этих пептидов. Например, описаны пептиды, содержащие аминокислотные остатки 261-300 нативного альфа-токсина С.perfringens, но не содержащие доменов фосфолипазы С и гидролизинов сфингомиелина нативного токсина. Далее сообщалось, что эти пептиды индуцируют иммунную защиту от нативного токсина. Кроме того, в патенте США №6610300 описана вакцина на основе антигенного фрагмента мутеина бета-токсина С.perfringens.

Однако, независимо от того, получена ли анатоксинная вакцина из нативного микроорганизма, или она получена рекомбинантными методами, считается экономически обременительным получать и вводить анатоксинные белки животным, нуждающимся в иммунизации, за исключением особых случаев (например, лечения людей, у которых могут быть аллергические реакции или которые чувствительны к другим компонентам цельноклеточных вакцин). Кроме того, для наступления полного эффекта обычно требуются повторные ревакцинации вакцинами на основе белка/анатоксина.

Другим предложенным решением было конструирование антигенно активного вируса, который будет продуцировать мутантный альфа-токсин вместо токсина дикого типа. Например, Bennett et al. [Viral Immunol. 12(2):97-105 (1999)] описали рекомбинантный вектор на основе вируса коровьей оспы, который экспрессирует нетоксичный С-домен альфа-токсина С.perfringens. К сожалению, хотя за последние 20 лет было предложено несколько рекомбинантных вакцин на основе вируса коровьей оспы, по-прежнему остается опасение, связанное с безопасностью выпуска живых инфекционных вирусов коровьей оспы в окружающую среду, где они могут передаваться людям, которые не резистентны к этому вирусу.

Известно, что альфа-токсин (ген plc) С.perfringens обладает несколькими биологическими активностями, в том числе, гемолитической активностью, фосфорилазной С, сфингомиелиназной, фосфодиэстеразной и летальной активностями. В предшествующем уровне техники имеется целый ряд сообщений, касающихся мутаций этого альфа-токсина, которые снижают токсичность. Schoepe, et al. [Infect, and Immun. 69(11):7194-7196 (2001)] описывают природный штамм С.perfringens, который продуцирует нетоксичный альфа-токсин. Однако, модифицировать этот штамм для индукции иммунной защиты против варианта, отличного от токсичных штаммов С.perfringens дикого типа, сложно.

Williamson и Titball [Vaccine 11(12):1253-1258 (1993)] показали, что участка токсина, содержащего только аминокислотные остатки 247-370, было достаточно для иммунизации мышей против газовой гангрены, индуцированной в эксперименте С.perfringens. Alape-Giron et al. [Eur. J. Biochem. 267:5191-5197 (2000)] сообщили, что замены в Asp269, Asp336, Tyr275, Tyr307 и Tyr331 снижали токсичность альфа-токсина. Nagahama, et al. [Infect, and Immun. 65:3489-3492 (1997)] сообщили, что замены Asp-56, Asp-130 или Glu-152 приводили к снижению токсичности альфа-токсина. Nagahama et al. [J. Bacteriology 177:1179-1185 (1995)] сообщили, что замена гистидина в положении 68 альфа-токсина С.perfringens нейтральной аминокислотой, такой как глицин, приводит к полной потере гемолитической, фосфолипазной С, сфингомиелиназной и летальной активностей мутантного альфа-токсина. Было высказано мнение о том, что такая замена одной аминокислоты инактивирует один из трех цинк-связывающих доменов этого белка. Этот цинк-связывающий домен, инактивируемый заменой His68, впоследствии был обозначен как Zn2 [Justin et al., Biochemistry 41:6253-6262 (2002)].

Несмотря на вышесказанное, в данной области техники остается потребность в безопасном, экономичном и эффективном способе защиты интенсивно выращиваемых домашних животных, включая птицу, такую как куры, от заражения штаммами Clostridium, включая С.perfringens.

Цитирование любой ссылки в настоящем описании не должно рассматриваться как признание того, что такая ссылка может восприниматься как часть «предшествующего уровня техники» для настоящей заявки.

Краткое раскрытие сущности изобретения

Устраняя описанные выше недостатки решений, известных из предшествующего уровня техники, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют по существу нетоксичный мутеин альфа-токсина Clostridium perfringens. В соответствии с одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин альфа-токсина, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением, по меньшей мере, 18 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с другим вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин альфа-токсина, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением, по меньшей мере, 12 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин альфа-токсина, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением, по меньшей мере, 9 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин альфа-токсина, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин альфа-токсина, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением, по меньшей мере, 3 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈.

В соответствии с одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует мутеин, в котором удалено не более 48 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3. В соответствии с другим вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин, в котором удалено не более 36 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3. В соответствии с еще одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин, в котором удалено не более 24 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3. В соответствии с еще одним вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует мутеин, в котором удалено не более 18 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3.

В соответствии с конкретным вариантом выполнения настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей мутеин, в котором из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3 удалено девять последовательных аминокислотных остатков, одним из которых является His₆₈. В соответствии с конкретным вариантом выполнения этого типа молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин, в котором девять удаленных последовательных аминокислотных остатков находятся в интервале от Tyr₆₂ до Trp₇₀ SEQ ID NO:3. В соответствии с более конкретным вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты кодирует мутеин, в котором эти девять удаленных последовательных аминокислот заменены одним остатком лейцина.

В соответствии с другим вариантом выполнения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, в которой удалены нуклеотиды 268-294. В соответствии с конкретным вариантом выполнения этого типа нуклеотиды 268-294 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 заменены тремя нуклеотидами, которые кодируют один остаток лейцина.

Настоящее изобретение также относится к по существу нетоксичным мутеинам альфа-токсина Clostridium perfringens. В соответствии с одним таким вариантом выполнения мутеин альфа-токсина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением, по меньшей мере, 18 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с другим вариантом выполнения мутеин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением, по меньшей мере, 12 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения мутеин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением, по меньшей мере, 9 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения мутеин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈. В соответствии с еще одним вариантом выполнения мутеин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, за исключением, по меньшей мере, 3 последовательных аминокислотных остатков, причем одним из удаленных аминокислотных остатков является His₆₈.

В соответствии с одним вариантом выполнения из мутеина согласно настоящему изобретению удалено не более 48 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3. В соответствии с другим вариантом выполнения из мутеина согласно настоящему изобретению удалено не более 36 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3. В соответствии с еще одним вариантом выполнения из мутеина согласно настоящему изобретению удалено не более 24 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3. В соответствии с еще одним вариантом выполнения из мутеина согласно настоящему изобретению удалено не более 18 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3.

В соответствии с конкретным вариантом выполнения настоящее изобретение относится к по существу нетоксичному мутеину, в котором из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3 удалено девять последовательных аминокислотных остатков, одним из которых является His₆₈. В соответствии с более конкретным вариантом выполнения этого типа девять удаленных последовательных аминокислотных остатков находятся в интервале от Tyr₆₂ до Trp₇₀ SEQ ID NO:3. В соответствии с еще более конкретным вариантом выполнения эти девять удаленных последовательных аминокислот заменены в аминокислотной последовательности мутеина одним остатком лейцина.

Изобретение дополнительно относится к аттенуированным микроорганизмам Clostridium perfringens, содержащим интегрированную в их хромосомы молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует по существу нетоксичный мутеин альфа-токсина Clostridium perfringens. Эта интегрированная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно расположена в положении в хромосоме, которое гомологично локализации молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует альфа-токсин дикого типа в микроорганизме Clostridium perfringens дикого типа. Таким образом, аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens согласно настоящему изобретению может быть по существу нетоксичным благодаря отсутствию функционального гена plc дикого типа. Как проиллюстрировано примерами в настоящем описании, аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens может представлять собой Clostridium perfringens типа А.

В соответствии с конкретным вариантом выполнения настоящего изобретения аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens представляет собой Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin 365-054 (АТСС деп. № РТА7364). В соответствии с другим конкретным вариантом выполнения настоящего изобретения аттенуированный микроорганизм Clostridium perfringens представляет собой Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin 365-053 (АТСС деп. № РТА7365).

Микроорганизм Clostridium perfringens, который подвергается аттенуации в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, может быть выделен из организма животного-хозяина, которое представляет собой либо млекопитающее, либо птицу. Такие млекопитающие могут включать в себя крупный рогатый скот, овец и свиней. Примеры подходящих птиц включают в себя кур, индеек, уток, голубей, гусей, горлиц, лебедей, куропаток и рябчиков.

Настоящее изобретение также относится к вакцинам. Такие вакцины могут содержать аттенуированные микроорганизмы Clostridium perfringens согласно настоящему изобретению. Вакцины согласно настоящему изобретению также могут содержать фармакологически приемлемые буферы, наполнители и/или адъюванты.

Кроме того, изобретение относится к способам индукции иммунного ответа на Clostridium perfringens у животных. Один такой вариант выполнения предусматривает введение животному иммунологически эффективной дозы вакцины согласно настоящему изобретению Вакцины согласно настоящему изобретению могут быть введены с помощью ряда способов, включая пероральное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, подкожное и интраназальное введение. Вакцина согласно настоящему изобретению может быть нанесена на корм для животного и/или распылена на животных для обеспечения перорального введения. Настоящее изобретение дополнительно относится к корму для животных, который содержит вакцину согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к аттенуированому микроорганизму Clostridium perfringens согласно настоящему изобретению, который дополнительно экспрессирует, по меньшей мере, один ген, кодирующий полипептид, отличный от полипептида Clostridium perfringens. В соответствии с одним таким вариантом выполнения один или несколько полипептидов, отличных от полипептидов Clostridium perfringens, представляют собой бактериальные полипептиды, такие как антигенные белки E.coli, сальмонеллы, лавсонии или кампилобактера и т.д., или их комбинаций. Альтернативно, или в сочетании с ними, полипептид, отличный от полипептида Clostridium perfringens, может представлять собой небактериальный полипептид. Примеры таких небактериальных полипептидов включают в себя белки млекопитающих или птиц, например, цитокины, такие как куриный IL-18; вирусов, таких как ротавирус или коронавирус; и паразитов, таких как эймерия, изоспора и криптоспоридии.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к антителу, которое селективно связывается с эпитопом, отсутствующем в по существу нетоксичном мутеине альфа-токсина Clostridium perfringens. Такие антитела могут различать по существу нетоксичный мутеин альфа-токсина от альфа-токсина Clostridium perfringens дикого типа.

Также предложены тест-наборы, которые содержат антитела согласно настоящему изобретению, применимые для определения того, было ли данное животное вакцинировано, или, альтернативно, было ли оно естественным путем инфицировано микроорганизмом Clostridium perfringens.

Соответственно, также предложены способы идентификации и/или распознавания животного, которое было инфицировано микроорганизмом Clostridium perfringens естественным путем, от животного, вакцинированного аттенуированным микроорганизмом Clostridium perfringens. В соответствии с одним таким вариантом выполнения способ предусматривает взаимодействие жидкого образца, полученного от животного, с антителом, которое селективно связывается с эпитопом, присутствующем в альфа-токсине Clostridium perfringens дикого типа, который удален из по существу нетоксичного мутантного альфа-токсина Clostridium perfringens согласно настоящему изобретению. Таким образом, антитело может обеспечить различение животных, которые были вакцинированы по существу нетоксичным мутеином альфа-токсина Clostridium perfringens согласно настоящему изобретению (и/или аттенуированным микроорганизмом Clostridium perfringens, экспрессирующим мутеин), от животных, которые инфицированы или были инфицированы альфа-токсином Clostridium perfringens дикого типа. Следующая стадия предусматривает определение того, вступает ли антитело во взаимодействие с жидким образцом, например, связывается ли оно с антигеном, содержащимся в жидком образце. Животное идентифицируют как животное, которое инфицировано/было инфицировано естественным путем микроорганизмом Clostridium perfringens, в том случае, если антитело вступает во взаимодействие с жидким образцом.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Таким образом, изобретение относится к модифицированным микроорганизмам Clostridia и культурам, которые экспрессируют один или несколько токсинов Clostridia, например, альфа-токсины, в виде мутеинов, которые не обладают определяемой токсичностью и/или обладают по существу низкой токсичностью по сравнению с нативными токсинами Clostridia, или токсинами Clostridia дикого типа. Предпочтительно, мутантные микроорганизмы С.perfringens согласно изобретению легко вводятся животным в виде живой вакцины. Также предлагается мутеин альфа-токсина С.perfringens согласно изобретению, наряду с кодирующими мутеины молекулами нуклеиновой кислоты, векторами для экспрессии альфа-токсинов и способами их применения.

Для предоставления понятного описания изобретения некоторые термины определены следующим образом. Вакцина представляет собой композицию, которая включает в себя иммуноген и другие необязательные фармацевтически приемлемые ингредиенты, включая в соответствии с некоторыми вариантами выполнения подходящие адъюванты. Используемый в настоящем описании термин «иммуноген» описывает композицию, вещество или вектор, которые при введении животному стимулируют иммунный ответ. Для целей настоящего изобретения подразумевается, что иммуноген включает в себя любой вектор, способный экспрессировать или вводить мутеин альфа-токсина согласно изобретению иммунизируемому животному. Вектор включает в себя, например, С.perfringens согласно изобретению или другой подходящий микроорганизм, который экспрессирует мутеин альфа-токсина согласно изобретению при введении животному этого вектора. Вектор также включает в себя известные из предшествующего уровня техники молекулы нуклеиновой кислоты, например, плазмиды и т.п., которые экспрессируют мутеин альфа-токсина согласно изобретению при непосредственном введении животному, например, проникая в клетку животного и экспрессируя в организме животного мутеин альфа-токсина. Иммуногеном также является белок, такой как альфа-токсин согласно изобретению, используемый как таковой или как часть подходящей вакцинной композиции.

Если иное не оговорено особо, используемые в настоящем описании термины «иммунизировать» и «вакцинировать» являются синонимами и используются взаимозаменяемо для описания введения иммуногена животному для индукции иммунного ответа у этого животного. Индуцированный иммунный ответ обеспечивает защитный иммунитет иммунизированному животному, который ограничивает или уменьшает клинические симптомы заболевания, например, газовой гангрены, и/или смертность, у вакцинированных животных, которые в последствии заражаются вирулентной дозой микроорганизмов С.perfringens, против которых вакцина согласно изобретению обладает защитными свойствами.

Термин «адъювант» определяется как одно или несколько веществ, которые вызывают стимуляцию иммунной системы. В этом контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на один или несколько антигенов/изолятов в составе вакцины. Адъювант может быть введен целевому животному до введения вакцины, в сочетании с вакциной или после введения вакцины. Адъюванты согласно настоящему изобретению могут быть получены из любого из ряда источников, включая природные источники, рекомбинантные источники, и/или могут быть синтезированы химически, и т.д. Примеры химических соединений, используемых в качестве адъювантов, включают в себя без ограничения соединения алюминия; метаболизируемые и неметаболизируемые масла; блоксополимеры; ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); витамины и минералы (включая без ограничения витамин Е, витамин А, селен и витамин B₁₂); Quil А (сапонины); сшитые полимеры на основе акриловой кислоты (например, полимеры проп-2-еновой кислоты), сшитые на различных уровнях с полиалкенильным полиэфиром, распространяемые под товарным знаком CARBOPOL®; и/или равномерно диспергированные капли масла микронного размера в виде водной эмульсии, например, распространяемые под товарным знаком Emulsigen®.

Дополнительные примеры адъювантов, которые иногда особо указывались в качестве иммунных стимуляторов, включают в себя компоненты клеточной стенки бактерий и грибов (например, липополисахариды, липопротеиды, гликопротеиды, мурамилпептиды, бета-1,3/1,6-глюканы), различные сложные углеводы растительного происхождения (например, гликаны, ацеманнан), различные белки и пептиды животного происхождения (например, гормоны, цитокины, костимулирующие факторы) и новые нуклеиновые кислоты, полученные из вирусов и других источников (например, двухцепочечная РНК, CpG). Кроме того, любое количество комбинаций упомянутых выше веществ может обеспечить адъювантный эффект, и, таким образом, может образовывать адъювант согласно настоящему изобретению.

Подразумевается, что используемый в настоящем описании термин «антитело» охватывает поликлональные антитела, моноклональные антитела и/или их фрагменты или рекомбинантные производные, включая сконструированные связывающие белки, содержащие вариабельные домены антител.

Используемая в настоящем изобретении нумерация остатков и положения аминокислотных остатков белков альфа-токсина согласно изобретению основана на системе нумерации, описанной для штамма 13 Clostridium perfringens. Альфа-токсин штамма 13 С.perfringens включен в GenBank под кат. № NC 003366, представленным последовательностью SEQ ID NO:1. Полноразмерный белок содержит 398 аминокислот. Альфа-токсин, кодируемый мутантными векторами, проиллюстрированными приведенными ниже примерами, соответствует белку SEQ ID NO:1, содержащему делецию аминокислотных остатков 90-98. Имеется сигнальная последовательность размером 28 аминокислот, которая отщепляется в процессе созревания белка. Таким образом, проиллюстрированная примером делеция соответствует аминокислотным остаткам 62-70 зрелого белка, который содержит 370 аминокислот (SEQ ID NO:3).

Нумерация кодонов ДНК, кодирующей белки альфа-токсина согласно изобретению основана на таковой гена plc штамма 13 Clostridium perfringens, включенного в GenBank под кат. № NP 560952, и представленного последовательностью SEQ ID NO:2. Последовательность, кодирующая альфа-токсин, находится между нуклеотидами 48590 и 49786 в штамме 13 С.perfringens. Делеция кодона в двух проиллюстрированных в настоящем описании конструкциях соответствует нуклеотидам 48857-48883 (включительно) гена NP 560952. Эта делеция находится в гене альфа-токсина и соответствует нуклеотидам 268-294 кодирующей последовательности SEQ ID NO:2.

Далее, использование терминов в единственном числе для удобства описания никоим образом не предназначено для ограничения. Таким образом, например, ссылка на композицию, содержащую клетку С.perfringens включает в себя ссылку на одну или несколько таких клеток. Также следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными в настоящем описании конфигурациями, стадиями способов и веществами, поскольку такие конфигурации, стадии способов и вещества могут несколько различаться. Также следует понимать, что используемая в настоящем описании терминология используется исключительно с целью описания конкретных вариантов выполнения и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения предусмотрены необратимые мутанты С.perfringens, являющиеся «по существу нетоксичными», т.е. организмы, которые экспрессируют иммуногенный альфа-токсин низкой или нулевой токсичности, что делает их подходящими для использования в качестве защитных вакцин. Таким образом, микроорганизмы С.perfringens согласно изобретению характеризуются достаточно сниженной токсичностью по сравнению с микроорганизмами С.perfringens дикого типа для того, чтобы быть переносимыми в качестве вакцины или антигена при использовании в условиях, эффективных для индукции у надлежащим образом вакцинированных животных иммунного ответа против альфа-токсина или против С.perfringens. Таким образом, микроорганизм С.perfringens согласно изобретению является «аттенуированным» по сравнению с С.perfringens дикого типа.

Выражение «по существу нетоксичный» также предназначено для применения к вышеуказанным иммуногенным мутеинам альфа-токсина, которые имеют достаточно низкую или нулевую токсичность, что также делает их подходящими для использования в защитной вакцине.

Снижение токсичности измеряется, например, с помощью одного из следующих анализов, известных из предшествующего уровня техники: анализа гемолитической активности, анализа активности фосфорилазы С, анализа активности сфингомиелиназы, анализа активности фосфодиэстеразы и анализа общей летальной активности в группе экспериментальных животных. Как правило, этими стандартными исследованиями остаточная токсичность не определяется. Тем не менее, наличие минимального уровня одной или нескольких этих активностей, например, от около 10^-4 до около 10^-2, по сравнению с токсичностью эквивалентного числа инфицирующих единиц альфа-токсина С.perfringens дикого типа, из которого был получен мутеин, может оказаться приемлемым в ветеринарной практике.

В соответствии с одним вариантом выполнения изобретение осуществляют на практике с использованием штаммов С.perfringens биотипа А, которые представляют особую важность как этиологические факторы гангрены и кишечных заболеваний различных типов. В частности, альфа-токсин С.perfringens является мишенью для аттенуирующей делеции, поскольку аттенуации этого токсина достаточно для того, чтобы сделать С.perfringens в достаточной степени нелетальными по сравнению со штаммами дикого типа.

В общих чертах, ген plc С.perfringens согласно изобретению экспрессирует мутеин альфа-токсина. Мутеин альфа-токсина содержит делецию, которая содержит His в петле Zn2 вместе с фланкирующими остатками, что резко уменьшает возможность любой обратной мутации в токсическую форму. В настоящее время известно, что делеция остатка His петли Zn2, например, His₆₈ последовательности SEQ ID NO:3, вместе с делецией дополнительных остатков, фланкирующих остаток His петли Zn2, приводит к образованию альфа-токсина, сохраняющего достаточную иммуногенность для индукции защитного иммунитета у животных, вакцинированных С.perfringens согласно изобретению, в то же время характеризующегося малой вероятностью претерпеть обратную мутацию в альфа-токсин дикого типа. Дополнительные остатки, которые могут быть удалены, удаляются в C-концевом направлении и/или N-концевом направлении относительно His₆₈ и могут составлять от около 4 до около 60 остатков в любом из этих направлений. Альтернативно, аналогичным образом могут быть удалены His₁₄₈ и фланкирующие остатки.

В соответствии с одним вариантом выполнения мутеин альфа-токсина согласно изобретению также содержит, помимо делеции His₆₈, делецию, по меньшей мере, 30 аминокислотных остатков с любой стороны (в C-концевом или N-концевом направлении) от положения His₆₈ по сравнению с SEQ ID NO:3. В соответствии с другим вариантом выполнения мутеин альфа-токсина согласно изобретению содержит, помимо делеции His₆₈, делецию, по меньшей мере, 20 аминокислотных остатков с любой стороны от His₆₈ по сравнению с SEQ ID NO:3. В соответствии с одним альтернативным вариантом выполнения мутеин альфа-токсина согласно изобретению содержит, помимо делеции His₆₈, делецию, по меньшей мере, 5 аминокислотных остатков с любой стороны от His₆₈ по сравнению с SEQ ID NO:3. В соответствии с еще одним вариантом выполнения мутеин альфа-токсина согласно изобретению содержит, помимо делеции His₆₈, делецию примерно от остатка 62 примерно до остатка 70, по сравнению с SEQ ID NO:3. Удаленные аминокислотные остатки необязательно заменены одним или несколькими другими остатками, например, одним остатком лейцина.

В соответствии с еще одним вариантом выполнения мутеин альфа-токсина С.perfringens получают и выделяют из С.perfringens или из альтернативного рекомбинантного микроорганизма, используемого в качестве реагента для исследования и/или в диагностических наборах или аналитических наборах, например, в качестве мишени для антител против альфа-токсина. Еще одним применением мутеинов альфа-токсина С.perfringens является применение в специализированных вакцинах для животных, например, людей, которые могут не перенести вакцинации аттенуированным микроорганизмом С.perfringens согласно изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу, которое специфично связывается с альфа-токсином дикого типа в отличие от мутеинов альфа-токсина согласно настоящему изобретению.

В соответствии со следующим вариантом выполнения представлено антитело, которое предпочтительно связывается с белком альфа-токсина С.perfringens дикого типа, демонстрируя минимальное или нулевое связывание с мутеином альфа-токсина согласно изобретению, например, не связывающееся с мутеином альфа-токсина, который содержит делецию, подробно описанную выше. Таким образом, представленное антитело применимо для отличия несущего делецию мутеина альфа-токсина от альфа-токсина дикого типа, и за счет этого также применимо для различения животных, вакцинированных вакциной согласно настоящему изобретению, от животных, которые были инфицированы С.perfringens дикого типа. Способы индукции и скрининга таких селективных антител известны из предшествующего уровня техники. Аналогично, также могут быть получены антитела, которые распознают мутеин альфа-токсина согласно настоящему изобретению, но не белок дикого типа. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть поликлональными, моноклональными («mAb») или фрагментами или сконструированными фрагментами или производными таких антител, сохраняющими свойства селективного связывания.

Методики получения и скрининга моноклональных антител были подробно описаны [см., например, Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, California (1988); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.), Academic Press, New York (1986); и Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975), каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки].

Например и без ограничения, иммунный ответ индуцируют у подходящих животных, таких как мышь или курица, путем вакцинации очищенным альфа-токсином С.perfringens дикого типа, например, в сочетании с подходящим адъювантом. Например, во избежание проявления токсичности альфа-токсина дикого типа иммуноген представляет собой пептид, соответствующий удаленным остаткам, и при необходимости иммуногенность пептида усиливают объединением с подходящим адъювантом или путем сочетания с подходящим белком-переносчиком. Сочетание с белком-переносчиком известно из предшествующего уровня техники и может быть проведено, например, с использованием пептида с концевым цистеином и его соединением с гемоцианином фиссуреллы (KLH) или бычьим сывороточным альбумином (BSA), используя либо реакцию присоединения малеимидной группы, либо сульфосукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилатный) линкер (производства Pierce). Также может быть использован карбодиимидный линкер, что снимает необходимость концевого цистеина.

Для получения моноклональных антител могут быть получены лимфоциты селезенки иммунизированного животного, из этих лимфоцитов получают гибридомы, и могут быть получены одна или несколько потенциально подходящих гибридом, экспрессирующих антитело против альфа-токсина. Гибридомы подвергают скринингу как против мутеина, так и против альфа-токсина дикого типа, и гибридому, экспрессирующую антитело, которое связывается только с альфа-токсином дикого типа, идентифицируют, клонируют и используют для получения моноклональных антител, которые связываются только с альфа-токсином дикого типа. Необязательно, получают кДНК из идентифицированной гибридомной клональной линии, и рекомбинантные антитела или фрагменты антител могут быть получены в других экспрессионных системах, известных из предшествующего уровня техники.

Как обсуждалось выше, одним потенциальным недостатком вакцинации в целом является то, что у вакцинированных животных могут наблюдаться ложноположительные реакции при тестировании на инфекцию с использованием антител, полученных против природного штамма, тем самым затрудняя идентификацию инфицированных животных. Таким образом, настоящее изобретение относится к тест-набору для отличия исследуемого животного, которое было инфицировано природным микроорганизмом С.perfringens, от животного, вакцинированного мутеином альфа-токсина согласно настоящему изобретению.

Один такой тест-набор содержит некоторое количество селективных антител против альфа-токсина дикого типа, которые характеризуются минимальным или нулевым