Рекомбинантный непатогенный mdv-вектор, обеспечивающий полиспецифический иммунитет

Рекомбинантный непатогенный mdv-вектор, обеспечивающий полиспецифический иммунитет

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области ветеринарных вакцин, в частности, к ветеринарным вакцинам для домашних птиц на основе вирусных векторов, основанных на рекомбинантных непатогенных вирусах болезни Марека.

Вирусы болезни Марека (MDV) образуют семейство Alphaherpesvirideae, инфицирующее виды птиц. Их вирион заключен в оболочку и имеет размер приблизительно 160 нм. Внутри капсида содержится большой геном, состоящий из линейной двухцепочечной ДНК.

MDV серотипа 1 (MDV1), также известный как герпесвирус куриных 2, является патогенным для куриц и распространен по всему миру. Он является канцерогенным и вызывает лимфомы и паралич. Аттенуированные штаммы MDV1 применяли в качестве вакцины, например, вакцины Rispens (штамм CVI-988) (Kreager, 1998, Poultry Sci., vol. 77, p. 1213).

MDV серотипа 2 (MDV2), также известный как герпесвирус куриных 3, является сильно аттенуированным к практически непатогенному MDV куриц (Petherbridge et al., 2009, J. Virol. Meth., vol. 158, p. 11), который повсеместно применяют в качестве вакцины против MDV1. Хорошо известная вакцина MDV2 представляет собой Nobilis™ Marexine SB1 (MSD Animal Health).

MDV серотипа 3, также известный как герпесвирус индюков 1 (HVT). Он был описан в 1970-х годах как вирус герпеса, заражающий индюков (Witter et al., 1970, Am. J. Vet. Res., vol. 31, p. 525) и непатогенный для куриц. Штаммы HVT, такие как PB1 или FC-126, повсеместно применяют для вакцинации против MDV1. Альтернативно, когда необходима защита от высоковирулентного MDV1, HVT применяют в сочетании с вакцинным штаммом MDV2, например, с SB1 от Nobilis™ Marexine CA126+SB 1 (MSD Animal Health), или с вакцинным штаммом MDV1, таким как Rispens от Nobilis™ RISMAVAC+CA126 (MSD Animal Health).

Непатогенные вирусы болезни Марека (npMDV) MDV2 и HVT реплицируются в лимфоцитах периферической крови птиц (PBL), и, таким образом, представляют собой системные вирусы, вызывающие продолжительный иммунный ответ, который в основном затрагивает клеточную, а не на гуморальную иммунную систему.

Вакцины npMDV можно применять для куриц с раннего возраста, что возможно благодаря их безопасным непатогенным свойствам, а также относительной нечувствительности к материнским антителам (MDA) против MDV2 или HVT; MDA у цыплят представляют собой антитела, полученные из яиц от матерей, которых планово вакцинируют против типичных патогенов домашних птиц. Таким образом, вакцины npMDV можно вводить птенцам через сутки после их вылупления из яйца (первые сутки) или даже до вылупления, внутри яйца. Последний подход, который называют 'вакцинация in ovo', представляет собой форму пренатальной вакцинации, которую обычно применяют на 18-е сутки эмбрионального развития (ED), приблизительно за 3 суток до вылупления.

Гетерологичный ген, который экспрессируется в живом рекомбинантном векторе, как правило, кодирует белок (или его важную часть), который представляет собой основной защитный иммуноген микроорганизма, против которого проводят вакцинацию; поскольку этот белок или пептид содержит иммунодоминантный эпитоп(ы) такого микроорганизма, он может стимулировать иммунную систему хозяина к выработке нейтрализующих антител и/или клеточного иммунитета, который очищает микроорганизм от вакцинированного животного.

Помимо непосредственного применения в качестве вакцины, HVT также применяют в качестве вакцины на основе вирусного вектора для экспрессии и доставки различных иммуногенных белков домашним птицам, см. WO 87/04463. В векторах HVT экспрессировали несколько генов, кодирующих антигены из патогенов домашних птиц, такие как из: вируса болезни Ньюкасла (NDV) (Sondermeijer et al., 1993, Vaccine, vol. 11, p. 349-358), и вируса инфекционного бурсита (IBDV) (Darteil et al., 1995, Virology, vol. 211, p. 481-490). Также показано, что экспрессия паразитического антигена (Cronenberg et al., 1999, Acta Virol., vol. 43, p. 192-197) и цитокина может влиять на иммунный ответ куриц (WO 2009/156367; Tarpey et al., 2007, Vaccine, vol. 25, p. 8529-8535).

Введение векторной вакцины HVT домашним птицам вызывает иммунный ответ против экспрессирующегося гетерологичного гена, а также против HVT, что предоставляет защиту от MDV. Это применяют в ряде коммерческих векторных вакцин HVT, например: ген белка NDV F: Innovax™-ND (MSD Animal Health) и Vectormune™ HVT-NDV (Ceva); или ген VP2 IBDV: Vaxxitek™ HVT+IBD (Merial; прежнее название: Gallivac™ HVT-IBD) и Vectormune™ HVT-IBD (Ceva);

Геномная нуклеотидная последовательность HVT доступна, например, в Genbank™ под номер AF291866 (штамм FC-126). Описаны несколько способов встраивания гетерологичных нуклеиновых кислот в HVT, такие как посредством применения гомологичной рекомбинации (Sondermeijer et al., выше), космидная регенерация (US 5961982) или бакмид (бактериальные искусственные хромосомы) (Baigent et al., 2006, J. of Gen. Virol., vol. 87, p. 769-776).

Изучены многие генетические сайты для встраивания гетерологичной генетической конструкции в геном HVT, и известны несколько подходящих, не относящихся к незаменимым, локусов, например, в уникальном коротком регионе геноме HVT (EP 431668); или в уникальном длинном регионе HVT (EP 794257).

Для стимулирования экспрессии гетерологичного гена в экспрессирующих кассетах для HVT применяли различные промоторы, такие как: промотор PRV gpX (WO 87/04463); промотор вируса саркомы Рауса LTR, промотор ранних генов SV40 и промотор предранних генов цитомегаловируса человека (hCMV IE1) (EP 719,864); или промотор гена бета-актина курицы (EP 1298139).

Аналогично, геномные нуклеотидные последовательности штаммов MDV2 доступны в Genbank™: HQ840738 (SB1) и AB049735 (HPRS24). Геномная организация MDV2 очень сходна с геномной организацией HVT, в частности, в отношении наличия региона Us, идентичного региону HVT (Kingham et al., 2001, J. of Gen. Virol., vol. 82, p. 1 123; Spatz & Schat, 201 1, Virus genes, vol. 42, p. 331). Описаны клонирование и трансфекция вируса MDV2 (Petherbridge et al., выше).

Для конструирования рекомбинантных векторов гетерологичная конструкция, которая подлежит встраиванию в векторный геном, как правило, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую, по меньшей мере, один (гетерологичный) ген или кодирующую область, которая должна быть способна к кодированию (по меньшей мере иммуногенная часть) антигенного белка.

Также конструкция может содержать промоторную последовательность для стимулирования экспрессии гетерологичного гена.

В последнем случае конструкцию часто называют "экспрессирующей кассетой".

Окончательный эффект встраивания экспрессирующей кассеты в векторный геном может различаться, поскольку этот геном может стать больше или меньше по размеру или сохранить прежний размер в зависимости от того, подвергается ли геном вставке, замене или удалению генетического материала. Также может различаться местоположение встроенного материала: он может помещаться внутри кодирующей или некодирующей области генома; и может помещаться внутри или между генами вектора или регуляторными участками. Эти альтернативные варианты определяют итоговую композицию экспрессирующей кассеты и ее воздействие на вектор и в конечном счете на животное, подлежащее вакцинации.

Вне зависимости от конкретной композиции конструкции, предпочтительная экспрессирующая кассета должна позволять живому рекомбинантному вирусному вектору преодолевать ряд биологических воздействий на его стабильность и эффективность: во-первых, на способность к размножению после встраивания гетерологичного материала. Это указывает на то, что рекомбинантный вирус является жизнеспособным, несмотря на встраивание в геном. Во-вторых, способность к репликации in vitro в клеточной линии хозяина в течение многих циклов с сохранением репликации и экспрессии гетерологичной вставки. Это указывает на то, что рекомбинант не был аттенуирован в результате встраивания, и вставка стабильно воспроизводится и экспрессируется. В-третьих, репликация и экспрессия in vivo. Это указывает на то, что рекомбинантный вирус может преодолевать сильное давление отбора в живом животном, такое как возникающее вследствие активации его иммунной системы. В таких условиях утрата экспрессии чужеродного гена благоприятствует более быстрой репликации в животном; такие "ускользнувшие" мутанты приобрели мутации или крупные делеции в чужеродном гене или его регуляторной области и имеют преимущество по сравнению с интактными вирусными векторами. Наконец, что наиболее важно, репликация вектора и экспрессия гетерологичного гена в животном должна обеспечивать иммунный ответ, достаточно эффективный для того, чтобы вакцинированное животное было защищено от инфекции и/или заболевание, которые в противном случае вызывались бы микроорганизмами, которые являются донорами гетерологичной вставки, экспрессирующейся в векторе.

Таким образом, полученный рекомбинантный вектор должен предоставлять стабильную интеграцию экспрессирующей кассеты в его геном; хорошую репликацию полученного рекомбинантного вектора, как in vitro, так и in vivo; и эффективную экспрессию гетерологичного гена(ов) in vivo, предпочтительно на высоком уровне и устойчивую во времени, для обеспечения и поддержания защитного иммунного ответа.

Такое сочетание свойств позволяет проводить значительное количество циклов репликации in vitro, необходимых для крупномасштабного производства, а также для продолжительной экспрессии и представления иммунной системе хозяина встроенного чужеродного гена, когда векторная вакцина реплицируется в вакцинированном животном. Кроме того, такая стабильность репликации и экспрессии необходима для того, чтобы векторная вакцина соответствовала очень высоким стандартам безопасности и биологической стабильности, которые требуются от рекомбинантного вируса, подлежащего применению в данной области в качестве коммерческого продукта после получения лицензии на продажу от органов государственной власти.

Болезнь Ньюкасла и инфекционный бурсит представляют собой важные заболевания домашних птиц, встречающиеся по всему миру, и могут приводить к тяжелым негативным последствиям в птицеводстве, касающимся благополучия животных и минимизации затрат (см.: Disease of poultry, 12th ed., 2008, Y. Saif ed., Iowa State Univ. press, ISBN-10: 0813807182).

Вирусы болезни Ньюкасла относятся к отряду Mononegavirales, в частности, к семейству Paramyxoviridae, и разделяются на различные патотипы в зависимости от их вирулентности; непатогенный лентогенный тип NDV почти не вызывает симптомов у домашних птиц. Напротив, мезогенный (обладающий средней патогенностью) и велогенный (обладающий высокой патогенностью) штаммы NDV вызывают серьезное заболевание и смертность и, таким образом, являются причиной заболеваний, подлежащих регистрации во многих странах. Симптомы заболевания включают нарушения дыхательной и нервной систем, среди которых наиболее заметными являются затрудненное дыхание и искривление шеи.

В птицеводстве защиту от инфекций и/или заболеваний, вызываемых патогенными штаммами NDV, обеспечивают посредством плановой вакцинации домашних птиц, как правило, на первые сутки после вылупления, живыми лентогенными штаммами NDV, такими как Nobilis™ ND Clone 30 (MSD Animal Health).

NDV содержит несегментированный отрицательно-полярный одноцепочечный РНК-геном, имеющий длину приблизительно 15 т.п.н., и содержит шесть генов, в том числе ген гликопротеина F, иммунодоминантного белка. Белок F участвует в прикреплении NDV к клетке-хозяину и внедрении в нее и может представлять собой основу эффективного иммунного ответа против NDV. Он экспрессируется как нативный белок F, который внеклеточно расщепляется пептидазами на F1 и F2. Расщепление облегчается благодаря аминокислотной последовательности из определенных основных аминокислот, которая находится в сайте расщепления F1/F2, и это обуславливает вирулентность штаммов NDV.

Вирус инфекционного бурсита (IBDV), также известный как вирус болезни Гамборо, является причинной развития инфекционного бурсита и относится к семейству Birnaviridae. Вирусы этого семейства содержат геном, состоящий из двух сегментов (A и B) двухцепочечной РНК. Крупный сегмент A кодирует полипротеин массой 110 кДа, который затем расщепляется посредством аутопротеолиза с образованием зрелых вирусных белков VP2, VP3 и VP4. Из них белки VP2 и VP3 представляют собой структурные белки капсида вириона, а VP2 представляет собой главный защитный иммуноген.

В случае IBDV существуют два серотипа, серотипы 1 и 2. Эти серотипы можно различать посредством реакции нейтрализации вирусов (VN). Показано, что вируса серотипа 1 являются патогенными для куриц, в то время как IBDV серотипа 2 вызывают только подострое заболевание у индеек.

Традиционно к вирусам IBDV серотипа 1 относили только один тип, который известен как "классический" вирус IBD. Недавно появился так называемый "вариантный" штамм IBDV; классический и вариантный штаммы можно идентифицировать и различать посредством реакции нейтрализации вируса с применением панели моноклональных антител или с применением ПЦР в реальном времени; это описано в Wu et al. (2007, Avian Disesases, vol. 51, p. 515-526). Хорошо известные классические штаммы IBDV представляют собой: D78, Faragher 52/70 и STC.

IBDV представляет собой острую высококонтагиозную вирусную инфекцию лимфоидной ткани куриц, которая в первую очередь поражает важнейший иммунный орган птиц: фабрициеву сумку. Заболеваемость в восприимчивых стаях является высокой и приводит к быстрой потере массы тела и от умеренной до высокой смертности. Птенцы, которые восстанавливаются после заболевания, могут приобретать иммунодеифицит вследствие разрушения (участков) фабрициевой сумки. В результате они являются чувствительными к вторичным инфекциям.

В данной области вирулентность циркулирующего вируса IBDV дикого типа постепенно повышается от вирулентных до очень вирулентных штаммов. Это может вызывать необходимость адаптации применяемых вакцин.

Плановую вакцинацию против IBD проводят у цыплят как можно более раннего возраста с применением живых вакцин IBDV, однако это способ можно применять только после того, как уровень MDA против IBDV достиг достаточного уровня, что, как правило, происходит от 7 до 30 суток после вылупления, как правило, от 15 до 20 суток.

Многие живые или инактивированные вакцины IBDV являются коммерчески доступными, например, живая вакцина, такая как Nobilis™ Gumboro D78 (MSD Animal Health).

Общепринятый подход для достижения экономической эффективности заключается в разработке вакцин, которые содержат комбинации антигенов. Таким образом, один сеанс вакцинации позволяет одновременно иммунизировать птиц против ряда заболеваний. Это помогает не только сохранить время и сократить затраты, но и уменьшает у подвергающихся вакцинации животных дискомфорт и стресс, которые в противном случае наблюдались бы вследствие повторных сеансов вакцинации. Самая высокая эффективности в связи с этим достигается в случае вакцинаций, которые проводят не посредством массовых способов, таких как опрыскивание спреем или добавление вакцины в питьевую воду, а посредством индивидуальных инъекций. Примером такого способа является вакцинация куриц-несушек и маточных куриц инактивированной субъединичной вакциной. Этот способ в настоящее время привел к появлению комбинированных вакцин, содержащих до 7 различных антигенов; например, Nobilis™ Cor4+IB+ND+EDS (MSD Animal Health).

Поскольку вакцины, основанные на рекомбинантном npMDV в качестве вирусного вектора, также требуют введения посредством индивидуальной инъекции, применение комбинаций в этом случае является предпочтительным. Возможность получения одновременной защиты от нескольких различных заболеваний (в дополнение к защите от MDV благодаря вектору NPMDV) является огромным преимуществом. Таким образом, многие группы исследовали комбинированную экспрессию и доставку более чем одного гетерологичного антигена посредством вакцинации вектором npMDV.

Самый простой подход заключался в комбинировании известных рекомбинантных векторных вакцин npMDV, каждая из которых содержит одну гетерологичную вставку. Однако ранее было показано, что этот подход не является эффективным, поэтому в информации о продукте в случае рекомбинантных вакцин HVT содержится рекомендация не комбинировать их с другими (чистыми) рекомбинантами HVT.

Возможно, вследствие отбора в организме вакцинированного животного один из рекомбинантных штаммов npMDV был способен приобретать преимущество по сравнению с другим. В результате только один рекомбинантный штамм оказывался способен к эффективной репликации, и иммунная защита вырабатывалась только против одного из существующих патогенов.

Альтернативный подход заключался в конструировании вектора npMDV, который содержит множество гетерологичных вставок в одном рекомбинантном геноме. Этот подход изучали после того, как были получены первые рекомбинантные конструкты npMDV (WO 87/044630), и было описано несколько мультивалентных комбинаций вставок в HVT, например: в WO 93/25665, "двухвалентные вакцины" из Примера 11, конструкты HVT-007, HVT-048 и HVT-096; аналогично, в WO 96/05291, "двухвалентные вакцины" из Примеров 11-14, и даже "тривалентные вакцины" из Примеров 16-17. То же самое относится и к рекомбинантам HVT, как описано в EP 719864.

Хотя большинство этих конструктов пока находятся на стадии разработки, некоторые из описанных векторов с множественными вставками уже были изолированы; некоторые прошли тестирования на курицах SPF (свободных от специфической патогенной микрофлоры).

Однако для большинства этих мультивалентных экспрессирующих конструкций не было опубликовано никаких результатов, касающихся изучения генетической стабильности этих конструктов или динамики экспрессии гетерологичных вставок in vitro или in vivo.

Фактически, из всех известных на сегодня публикаций единственный рекомбинант npMDV с множественными вставками, который был тщательно изучен и характеризуется подтвержденной безопасностью, стабильностью и эффективностью в качестве вакцины, представляет собой конструкт, содержащий гены gD и gl вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), который коммерчески доступен под названием Innovax™-ILT (MSD Animal Health).

Однако даже в этом случае гетерологичные вставки предоставляют только мононвалентную защиту от одного патогена домашних птиц, а именно ILTV. Это связано с тем, что гены ILTV gD/gl в природе перекрываются и для предоставления достаточной иммунизации против ILTV должны экспрессироваться комбинированно. Таким образом, применение множественных вставок не является необходимым для расширения диапазона иммунизации.

Таким образом, до сегодняшнего дня, несмотря на огромные потенциальные преимущества и множество предпринятых попыток, не известно публикаций, описывающих безопасную, стабильную и эффективную рекомбинантную векторную вакцину npMDV, которая обеспечивала бы экспрессию более чем одного гетерологичного гена, каждый из которых был бы получен от разных микроорганизмов, и таким образом позволяла бы получить мультивалентный иммунный ответ (в дополнение к защите от MDV) посредством вакцинации единой рекомбинантной векторной вакциной npMDV.

Целью настоящего изобретения является выполнение данной необходимости и предоставление первой безопасной и стабильной рекомбинантной векторной вакцины npMDV, которая обеспечивает эффективную иммунизацию домашних птиц против более чем одного патогена домашних птиц (в дополнение к защите от MDV).

Неожиданно было обнаружено, что эту задачу выполняет рекомбинантный npMDV по изобретению, который предоставляет экспрессию гетерологичных иммунопротекторных антигенов из более чем одного патогена домашних птиц.

Таким образом, изобретение относится к рекомбинантному непатогенному вирусу болезни Марека (npMDV), содержащему гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, который характеризуется тем, что указанная гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5′-конца к 3′-концу в следующем порядке:

a. коровый промотор предраннего гена 1 цитомегаловируса человека (hCMV-IE1),

b. ген белка слияния (F) вируса болезни Ньюкасла (NDV),

c. терминатор транскрипции,

d. коровый промотор гена бета-актина курицы,

e. ген вирусного белка 2 (VP2) вируса инфекционного бурсита классического типа (IBDV).

Задача вызывала некоторые затруднений, как обнаружили авторы изобретения в ходе экспериментов, поскольку многие рекомбинантные npMDV, описанные на современном уровне техники для бивалентных и тривалентных конструктов, экспрессирующих, помимо прочего, ген белка F NDV или ген VP2 IBDV, имели серьезные недостатки; они либо вовсе не были способны к репликации, либо могли реплицироваться только в течение ограниченного количества циклов, либо не демонстрировали экспрессии гетерологичных вставок in vitro, и только некоторые из них были эффективны in vivo или предоставляли достаточную иммунную защиту. Генетическая стабильность в большинстве случаев была невысокой. Таким образом, большинство из них были неподходящими для получения эффективных вакцин, основанных на рекомбинантных npMDV.

Аналогично, рекомбинантный npMDV, полученный на основе комбинации известных экспрессирующих кассет с генами белка F или VP2, также был неэффективным; он не давал потомства и не демонстрировал экспрессию, или экспрессия быстро прекращалась вследствие нестабильности, что приводило к появлению "ускользнувших" мутантов (см. Пример 1 и фиг. 1).

Для преодоления этих проблем было необходимо делать неочевидный выборы и проводить отбор и модификации, выходящие за рамки рутинной практики, с целью получения рекомбинантного npMDV для экспрессии как белка F NDV, так и белка VP2 IBDV, который демонстрирует желаемую генетическую стабильность, способность к репликации вирусного вектора и стабильную экспрессию гетерологичных генов.

Авторы изобретения обнаружили, что применение слишком сильных промоторов вызывает нестабильность мультивалентной экспрессирующей кассеты полученного вектора npMDV, в то время как слишком слабые промоторы не способны обеспечивать достаточную экспрессию и иммунную защиту. Не связываясь с конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что основные признаки, позволяющие рекомбинантому npMDV проявлять эффективность, превышающую эффективность известных векторов, включают: отбор специфичных промоторов в сочетании модификациями, внесенными в эти промоторы для регуляции их силы, а также определенный порядок расположения гетерологичных генов, экспрессирующихся этими промоторами, в экспрессирующей кассете. Эта сложная и специфическая комбинация признаков позволяет получить рекомбинантный npMDV, содержащий мультивалентную экспрессирующую кассету с оптимальным балансом стабильности, способности к репликации и уровня экспрессии, благодаря чему этот рекомбинантный npMDV может преодолевать все биологические препятствия in vitro и in vivo и при этом оставаться эффективным для иммунизации животного.

В данном изобретении "рекомбинант" представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты или микроорганизм, генетический материал которого был модифицирован с получением генетической конструкции, которую он исходно не содержал.

В данном изобретении "npMDV" представляет собой вирус из семейства вирусов MDV, который не обладает или обладает невысокой патогенностью для домашних птиц. Предпочтительно npMDV представляют собой природные вирусы или вирусы, аттенуированные посредством пассирования, например, для применения в качестве вакцин. В более предпочтительном варианте осуществления npMDV представляют собой вирусы MDV2 или HVT. В зависимости от цели предпочтительным может быть любой из этих вирусов, поскольку они обладают разными преимуществами: MDV2 в природе распространяется более активно, чем HVT, поэтому, когда необходимо быстрое распространение рекомбинантного npMDV по изобретению, предпочтительным родительским вирусом является MDV2, более предпочтительно штамм SB1. С другой стороны, когда наиболее важна безопасность рекомбинантного npMDV по изобретению, предпочтительным родительским вирусом является HVT, более предпочтительно штаммы PB1 или FC-126.

Даже в более предпочтительном варианте осуществления применяют комбинацию рекомбинантного npMDV по изобретению, в которой родительские вирусы для рекомбинантного вектора относятся к разным типам, например, MDV2 и HVT. Преимущество этого варианта осуществления заключается в возможности значительного увеличения количества иммуногенных белков, присутствующих и экспрессирующихся в животном. Каждый вектор может содержать ряд гетерологичных генов, количество которых не должно превышать определенного максимума, по достижении которого ухудшается стабильность, репликация вируса и экспрессия. Таким образом, комбинация векторов может предоставлять больше гетерологичных генов, чем вектор одного типа. Такая комбинация векторов различных типов, таким образом, позволяет преодолевать проблему, наблюдающуюся на известном уровне техники, при которой введение более чем одного вектора одного типа приводит к тому, что преимущество получает один из них, в результате чего иммунизация достигается только в отношении антигенов одного из векторов. Благодаря комбинированию векторов npMDV по изобретению, относящихся к различным типам, такому как комбинирование основанных на MDV2 и HVT векторов, ни один из векторов не получает преимущества по сравнению с другими векторами.

Как применяют в настоящем документе, термин "содержащий" (а также его вариации, такие как "содержит", "содержат" и "содержал") относится ко всем элементам во всех возможных комбинациях, применяемых для изобретения, которые охвачены или включены в раздел текста, абзац, пункт формулы изобретения и т.д., в которых применяется такой термин, даже если такие элементы или комбинации не перечисляются открытым текстом; и не подразумевает исключения любого из таких элементов или комбинаций.

Таким образом, любой такой раздел текста, абзац, пункт формулы изобретения и т.д. может, таким образом, также относиться к одному или нескольким вариантам осуществления, где термин "содержащий" (или его варианты) заменен на такие термины как "состоит из", "состоящий из" или "состоит в основном из".

Ген является "гетерологичным" по отношению к npMDV, в котором он содержится, если этот ген не присутствовал в родительском npMDV, который использовали для получения рекомбинантного вектора npMDV по изобретению.

Термин "ген" применяют для обозначения нуклеиновой кислоты, способной кодировать белок. Ген по изобретению предпочтительно кодирует полный белок, но также может кодировать участок белка, например, кодировать только зрелую форму белка, т.е. белок без "лидерной последовательности", "трансмембранной последовательности" или "сигнальной последовательности". Ген может даже кодировать определенный участок белка, такой как участок, содержащий иммунопротективный эпитоп.

В этом отношении "белок" по изобретению представляет собой молекулярную цепь аминокислот. Белок может быть нативным или зрелым белком, белком-предшественником или пропротеином или функциональным фрагментом белка. В числе прочего, пептиды, олигопептиды и полипептиды также включены в определение белка.

По изобретению, "содержащий гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты" относится к вставке гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты в геном npMDV. Встраивание можно вводить посредством любого доступного способа при условии, что полученный рекомбинантный npMDV способен демонстрировать желаемую безопасность, стабильность и эффективную экспрессию антигенов.

Предпочтительные способы введения вставки представляют собой космидную регенерацию, например, как описано в WO 93/25665, или способ с применением бакмид, как описано в EP 996738. Эти способы обязательно включают применение набора крупных перекрывающихся субгеномных фрагментов генома npMDV для реконструкции полного генома npMDV при трансфекции в клетки-хозяева. Поскольку одна из космид содержит экспрессирующую кассету, она стабильно встраивается в геном (впоследствии рекомбинантного) npMDV.

Схема трансфекции нуклеиновой кислоты по изобретению в геном HVT посредством космидной регенерации показана на фиг. 3.

Термин "в направлении от 5′-конца к 3′-концу", также известный как "в нижележащем направлении", хорошо известен в данной области.

Вместе с термином "в следующем порядке" он указывает на порядок, в котором перечисленные элементы должны располагаться относительно друг друга, и, в отношении ген-экспрессирующих механизмов клетка-хозяина, на порядок, в котором рекомбинантный npMDV по изобретению реплицируется и экспрессируется. Как должно быть ясно специалистам в данной области, этот порядок относится той цепи ДНК двухцепочечного ДНК-генома npMDV, которая является "кодирующей цепью", и относится к закодированной молекуле мРНК, которая находится в "нетранскрибируемой" ориентации.

Однако, не отрицая смысл предыдущего абзаца: в комплементарной цепи двойной спирали ДНК, которая является "матричной" цепью, относительный порядок перечисленных элементов остается таким же, но ориентация цепи ДНК меняется на 3′-5′.

Дополнительно, как должно быть ясно специалистам в данной области, поскольку экспрессирующая кассета представляет собой изолированный экспрессирующий модуль, ориентация всей экспрессирующей кассеты по изобретению относительно генома npMDV не является критичной. Это означает, что молекулу нуклеиновой кислоты в целом можно встраивать в геном npMDV в любой из двух ориентаций. Например, когда молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению встраивают в регион Us генома npMDV, она может быть ориентирована как считывающаяся по направлению к TR или как считаывающаяся по направлению к IR. На фиг. 1 в связи с этим представлена только одна из двух возможных ориентаций.

"Промотор" по изобретению представляет собой функциональный участок генома организма, который направляет транскрипцию нижележащей кодирующей области. Промотор, таким образом, представляет собой участок нуклеиновой кислоты, как правило, ДНК, который расположен выше открытой рамки считывания, как правило, гена.

Промотор инициирует синтез мРНК гена или кодирующей области, которую он контролирует, начиная с "сайта начала транскрипции" (TSS). Полученная мРНК, в свою очередь, транслируется в белок, начиная со стартового кодона гена, который представляет собой первую последовательность ATG в открытой рамке считывания (первая последовательность AUG в мРНК). Как правило, TSS находится в области 30-40 нуклеотидов выше стартового кодона. TSS можно идентифицировать посредством секвенирования 5'-конца мРНК гена, например, посредством RACE.

В основном промоторы находятся в пределах 1000 нуклеотидов выше нуклеотида A стартового кодона, который, как правило, обозначают как A+1, и большинство промоторов находятся между -500 и A+1.

Как правило, промоторы содержат ряд распознаваемых регуляторных областей, таких как энхансерный участок, который участвует в регуляции времени, продолжительности, условий и уровня транскрипции. Центральный участок промотора участвует в связывании факторов транскрипции и направлении РНК-полимеразы. Он, как правило, содержит ряд консервативных последовательностей, таких как TATA-бокс, CAAT-бокс и GC-бокс.

Название промотора, как правило, основано на названии гена, экспрессию которого он контролирует. Например, термин "промотор гена hCMV-IE1" относится к промотору, который в природе контролирует экспрессию гена IE1 hCMV и находится непосредственно выше этого гена. Поскольку ген IE1 является хорошо изученным и хорошо распознаваемым генов, а также поскольку были секвенированы геномы многих вирусов Herpesvirideae (целиком или частично), такой промотор можно легко идентифицировать посредством известных способов. Например, промотор можно отбирать посредством простого субклонирования участка между двумя соседними генами, например, от поли-A-последовательности лежащего выше гена до TSS лежащего ниже гена. Затем промотор идентифицируют посредством применения стандартных тестов: экспрессия маркерного гена субклонированными небольшими или крупными участками предполагаемого промотора.

Таким образом, промотор гена "hCMV-IE1" хорошо известен в данной области, и его можно легко получать из ряда коммерческих источников, таких как поставщики коммерческих плазмид для клонирования и экспрессии. Ген IE1 также называют главным геном IE. Как правило, этот промотор гена hCMV-IE1 имеет длину приблизительно 1,5 т.п.н. и состоит из энхансера, промотора и интрона, где активность промотора затрагивает интрон. Детальное исследование энхансер-промоторного участка hCMV-IE1 описано в Koedood et al. (1995, J. of Virol., vol. 69, p. 2194-2207). Промотор гена hCMV-IE1 можно, например, получать из плазмиды pl17, как описано в Cox et al. (2002, Scand. J. Immunol., vol. 55, p. 14-23), или из экспрессирующих векторов млекопитающих, таких как pCMV (Clontech) или pCMV-MCS (Stratagene; номер доступа в Genbank™ AF369966). Альтернативно, промотор можно получать из генома вируса hCMV вирус, из региона, предшествующего гену IE1, с применением обычных способов молекулярной биологии.

Для данного изобретения известный промотор гена hCMV-IE1 оказался неэффективным, поскольку он не обладал желаемой силой и стабильностью в векторе npMDV и в экспрессирующей кассете, в составе которой экспрессировался другой гетерологичный ген. Неожиданно было показано, что посредством применения определенного центрального участка промотора гена hCMV-IE1, "корового" промотора (элемент a.), были получены желаемые характеристики. В конкретном варианте осуществления длина этого корового промотора составляет всего приблизительно 361 п.н., и он представлен в SEQ ID NO:1.

Однако для корового промотора гена hCMV-IE1 известны многие варианты, демонстрирующие высокое сходство; например, поиск в NCBI′s Genbank™ с применением выравнивания Blast с SEQ ID NO:1 в качестве запроса выдает около 60 сходных промоторных последовательностей, идентичность которых находится в пределах 95%. Эти гомологи и варианты промотора hCMV-IE1 в равной степени пригодны в изобретении с учетом применения такого же корового участка этого промотора.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления коровый промотор гена hCMV-IE1 по изобретению представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты длиной приблизительно 361 пар оснований, содержащую нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную полноразмерной нуклеотидной последовательности в SEQ ID NO:1. Более предпочтительна идентичность нуклеотидной последовательности, составляющая, по меньшей мере, 96, 97, 98, 99 или даже 100%, в указанном порядке предпочтительности.

Как известно специалистам в данной области, могут возникать некоторые вариации длины корового промотора гена hCMV-IE1, а также других элементов, которые составляют гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, встроенную в рекомбинантный npMDV по изобретению. Это может происходить вследствие различий в конкретных условиях, при которых проводят клонирование и конструирование; например, вследствие применения различных участков распознавания рестрикционных ферментов, праймеров для ПЦР или различных условий для модификации концов молекул, подвергающихся клонированию. Таким образом, могут возникать некоторые вариации длины составных элементов.

Таким образом, по изобретению "приблизительно 361" представляет собой: 361±25%, предпочтительно ±20, 15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или даже 0%, в указанном порядке предпочтительности.

Это, однако, верно при условии, что такие изменения длины не влияют на стабильность и эффективность полной встроенной гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, и в таком случае изменения длины являются несущественными и должны рассматривать как часть изобретения.

Промотор для экспрессии гетерологичного гена в (вирусном) векторе должен быть способен эффективно контролировать транскрипцию нижележащей кодирующей области. Эту способность, как правило, обозначают как свойство промотора быть "функционально связанным" с геном или: ген находится "под контролем" промотора. Это, как правило, означает, что в составе экспрессирующей кассеты промотор и ген связаны с одной и той же ДНК, находятся в эффективной близости и не содержат сигналов или последовательностей между ними, которые бы мешали эффективной транскрипции и трансляции.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления коровый промотор гена hCMV-IE1 по изобретению является "функционально связанным" с нижележащим геном белка F NDV.

"Ген белка F NDV" по изобретению (элемент b.) кодирует слитый белок вируса NDV. Такие гены хорошо известны, и их последовательности широко доступны на современном уровне техники благодаря ряду общедоступных плазмидных конструкций. Альтернативно, их можно получать из изолированного природного NDV с применением общеизвестных способов работы с РНК-вирусами. Вирус NDV можно легко идентифицировать с применением сер