Способ получения астаксантина путем ферментации

Способ получения астаксантина путем ферментации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения каротиноидов, включая астаксантин, путем ферментации микроорганизмов.

Предшествующий уровень техники

Каротиноиды представляют собой природные пигменты, которые могут быть использованы в качестве кормовых добавок, пищевых добавок, фармацевтических средств и т.п. Примерами каротиноидов являются астаксантин, кантаксантин, зеаксантин, β-криптоксантин, ликопен, β-каротин, феникоксантин, адониксантин, эхиненон, астероиденон и 3-гидроксиэхиненон.

Из этих каротиноидов, астаксантин используется в качестве пищевых добавок, например, в качестве агента, улучшающего окраску искусственно разводимых рыб, таких как лосось, форель и морской лещ, или в качестве агента, улучшающего окраску желтка яиц домашней птицы. Кроме того, астаксантин является в высокой степени ценным сырьем для производства безопасных натуральных пищевых добавок и диетического питания.

Очевидно, что адониксантин и феникоксантин также, как и астаксантин, могут быть использованы в качестве кормовых добавок, пищевых добавок, фармацевтических средств и т.п. после того, как будут разработаны способы их промышленного производства. β-Каротин используется в качестве кормовых добавок, пищевых добавок, фармацевтических средств и т.п.; кантаксантин используется в качестве кормовых добавок, пищевых добавок, косметических средств и т.п., а зеаксантин используется в качестве пищевых добавок, кормовых добавок и т.п. Кроме того, в качестве кормовых добавок, пищевых добавок и т.п. могут быть также использованы и другие каротиноиды, такие как ликопен, эхиненон, β-криптоксантин, 3-гидроксиэхиненон и астероиденон. Известными методами получения таких каротиноидов являются методы химического синтеза, методы экстракции из природных источников и методы продуцирования с использованием микроорганизмов.

Известными методами химического синтеза астаксантинов являются метод превращения β-каротина (непатентный документ 1) и метод синтеза из соли C15-фосфония (непатентный документ 2). Астаксантин, продуцируемый указанными методами химического синтеза, выпускаются промышленностью в качестве кормовой добавки. Кроме того, поскольку астаксантин присутствует у рыб, таких как морской лещ и лосось, а также у ракообразных, таких как креветки, крабы и криль, то указанный астаксантин может быть также экстрагирован из указанных организмов.

Описанными в литературе методами получения астаксантина с использованием микроорганизмов являются метод культивирования с использованием зеленых водорослей Haematococcus pluvialis (патентный документ 1), метод ферментации с использованием красных дрожжей Phaffia rhodozyma (патентный документ 2) и метод ферментации с использованием бактерий, принадлежащих к роду Paracoccus (иногда называемых здесь «бактериями Paracoccus»).

Примерами астаксантин-продуцирующих бактерий Paracoccus являются штаммы E-396 и A-581-1 (патентный документ 3 и непатентный документ 3). Примерами других астаксантин-продуцирующих бактерий Paracoccus являются штамм MH1 Paracoccus marcusii (патентный документ 4), штамм BC74171 Paracoccus haeundaensis (непатентный документ 4), бактериальный штамм N-81106 Paracoccus (патентный документ 5) и штамм PC-1 Paracoccus sp. (патентный документ 6).

Вышеупомянутые методы продуцирования каротиноидов имеют ряд недостатков. Так, например, применение методов химического синтеза вызывают некоторое беспокойство у потребителей с точки зрения их безопасности. Экстракция из природных источников, таких как креветки и крабы, требует значительных производственных затрат. Кроме того, производство с использованием зеленых водорослей или дрожжей является низкопродуктивным и сталкивается с проблемами, связанными с экстракцией каротиноидов из этих водорослей или дрожжей и обусловленными большой плотностью клеточных стенок.

В связи с этим следует отметить, что бактерии, принадлежащие к роду Paracoccus, имеют те преимущества, что они быстро размножаются и дают высокий выход каротиноидов, и эти каротиноиды могут быть легко экстрагированы из указанных бактерий и т.п. В литературе описано несколько методов культивирования этих бактерий. Так, например, в патентном документе 7 описан метод, проводимый путем добавления соли железа во время культивирования. В патентном документе 8 описан метод, проводимый путем ограничения концентрации источника углерода. Однако, такие методы культивирования связаны с определенными проблемами, заключающимися в том, что во время продуцирования астаксантина наблюдается накопление больших количеств кантаксантина.

Кантаксантин может быть использован в качестве кормовой добавки для улучшения цветового оттенка мяса лосося и куриного яичного желтка, причем, в Европе, его ADI (допустимое суточное потребление) ограничено количеством 0,03 мг/кг массы тела, а верхние пределы количества кантаксантина, приемлемые для включения в корм, предположительно составляют 25 мг/кг и 8 мг/кг для лосося и кур-несушек, соответственно (непатентный документ 5). Таким образом, при продуцировании астаксантина с использованием микроорганизмов, необходимо поддерживать содержание кантаксантина на низком уровне. В патентном документе 9 описан метод, в котором уровень продуцирования кантаксантина снижают путем регуляции концентрации растворенного кислорода. Однако, такой метод также дает значительное снижение концентрации продуцируемого астаксантина, а поэтому он является нерациональным с точки зрения производственных затрат.

Список цитируемой лителатуры

Патентная литература

Патентный документ 1: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2007-97584 A

Патентный документ 2: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 11-69969 A (1999)

Патентный документ 3: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 7-79796 A (1995)

Патентный документ 4: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2001-512030 A

Патентный документ 5: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2007-244205 A

Патентный документ 6: WO 2005/118812

Патентный документ 7: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2007-143492 A

Патентный документ 8: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2008-167665 A

Патентный документ 9: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2001-352995 A

Непатентная литература

Непатентный документ 1: Erich Widmer et al., «Pure Appl. Chem.» 1985, vol. 57, pp. 741-752.

Непатентный документ 2: Erich Widmer et al., «Helv. Chim. Acta» 1981, vol. 64, pp. 2436-2446.

Непатентный документ 3: Akira Tsubokura et al., «International Journal of Systematic Bacteriology», 1999, vol. 49, pp. 277-282.

Непатентный документ 4: Jae Hyung Lee et al., «International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology», 2004, vol. 54, pp. 1699-1702.

Непатентный документ 5: Official Journal of the European Communities L 22/28-30, 25.1,2003.

Описание сущности изобретения

Проблемы, которые могут быть решены с применением настоящего изобретения

Настоящее изобретение было создано в целях решения вышеизложенных проблем. Целью настоящего изобретения является разработка способа микробиологического продуцирования астаксантина в высокой концентрации при низких материальных затратах и с пониженным уровнем продуцирования кантаксантина.

Способы решения таких проблем

В результате проведения крупномасштабных исследований для достижения вышеупомянутой цели, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что продуцирование астаксантина в высокой концентрации может быть достигнуто при сохранении концентрации продуцируемого кантаксантина на низком уровне путем добавления биотина в среду во время культивирования бактерии, которая одновременно продуцирует астаксантин и кантаксантин. Этот вывод был положен в основу осуществления настоящего изобретения.

Настоящее изобретение включает притязания по следующим пунктам:

(1) Способ продуцирования каротиноидов, в том числе и астаксантина, включающий культивирование бактерии, которая одновременно продуцирует астаксантин и кантаксантин, в среде, содержащей биотин, где отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования в этой среде, является более низким, чем соответствующее отношение в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования в среде, не содержащей биотина.

(2) Способ по п.(1), где концентрация биотина в среде составляет 0,001 мг/л - 50 мг/л.

(3) Способ по п.(1), где отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 25% масс. или менее.

(4) Способ по п.(1), где концентрация продуцируемой глюконовой кислоты в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 30 г/л или менее.

(5) Способ по п.(1), где концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования составляет 1 м.д. или более и поддерживается на этом уровне в процессе всего культивирования.

(6) Способ по п.(1), где содержание поли-β-гидроксибутирата (далее обозначаемого «PHB») в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, в расчете на сухие клетки, составляет 30% масс. или менее.

(7) Способ по п.(1), где концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования составляет 1 м.д. или более и поддерживается на этом уровне в процессе всего культивирования, а отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 25% масс. или менее.

(8) Способ по п.(1), где концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования составляет 2 м.д. или более и поддерживается на этом уровне в процессе всего культивирования, а отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 8% масс. или менее.

(9) Способ по п.(1), где концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования увеличивается постадийно или непрерывно в процессе культивирования.

(10) Способ по п.(1), где исходная концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования поддерживается на уровне 1-2,5 м.д. в промежуточной фазе культивирования, а концентрация растворенного кислорода увеличивается постадийно или непрерывно, и где отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 25% масс. или менее.

(11) Способ по п.(1), где исходная концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования поддерживается на уровне 2-3,5 м.д. в промежуточной фазе культивирования, а концентрация растворенного кислорода увеличивается постадийно или непрерывно, и где отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 8% масс. или менее.

(12) Способ по п.(1), где указанной бактерией является бактерия, принадлежащая к роду Paracoccus.

(13) Способ по п.(1), где указанной бактерией является мутантный штамм, обладающий пониженной способностью к продуцированию PHB.

(14) Способ по п.(1), где указанной бактерией является мутантный штамм, обладающий пониженной способностью к продуцированию глюконовой кислоты.

(15) Способ по п.(1), где указанной бактерией является бактерия, в которой нуклеотидная последовательность ДНК, соответствующая последовательности рибосомной РНК 16S, по существу гомологична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.

(16) Способ по п.(15), где указанной бактерией является бактерия штамма E-396 (FERM BP-4283) или A-581-1 (FERM BP-4671) или их мутантного штамма.

(17) Каротиноидная композиция для приготовления корма, содержащая каротиноиды, включая астаксантин, и полученная способом по п.(1), где отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина в продуцируемых каротиноидах составляет 25% масс. или менее.

(18) Каротиноидная композиция для приготовления корма по п.(17), где содержание PHB в продуцируемых каротиноидах, включая астаксантин, составляет 30% масс. или менее.

(19) Каротиноидная композиция для приготовления пищевого продукта, содержащая каротиноиды, включая астаксантин, и полученная способом по п.(1), где отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина в продуцируемых каротиноидах составляет 8% масс. или менее.

Настоящее изобретение включает составную часть или все содержание и/или графический материал заявки на патент Японии No. 2010-057321, которая представляет собой приоритетный документ настоящей заявки.

Эффекты настоящего изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, астаксантин в высокой концентрации может быть получен недорогостоящими методами микробиологии, которые позволяют поддерживать концентрацию кантаксантина на низком уровне. Каротиноиды, полученные в настоящем изобретении, могут быть использованы в качестве кормовых и пищевых продуктов.

Варианты осуществления настоящего изобретения

Более подробное описание настоящего изобретения приводится ниже. Объем настоящего изобретения не ограничивается приведенным ниже описанием и проиллюстрированными вариантами его осуществления, и в него могут быть внесены соответствующие изменения, не выходящие за рамки существа изобретения.

Настоящее изобретение относится к способу продуцирования каротиноидов, включая астаксантин, путем культивирования бактерии, которая одновременно продуцирует астаксантин и кантаксантин (иногда называемой далее «каротиноид-продуцирующей бактерией» или «астаксантин-продуцирующей бактерии») в среде, содержащей биотин (этот способ далее называется «способом согласно изобретению»). В соответствии со способом настоящего изобретения, отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования в среде, содержащей биотин, является более низким, чем соответствующее отношение в продукте культивирования, полученном с использованием аналогичной каротиноид-продуцирующей бактерии, после завершения культивирования в среде, не содержащей биотина. В соответствии со способом согласно изобретению, астаксантин в высокой концентрации может быть продуцирован недорогостоящим методом, заключающимся в добавлении биотина в среду и снижении концентрации продуцируемого кантаксантина.

Бактерией, используемой в способе согласно изобретению, является любая бактерия при условии, что она будет одновременно продуцировать астаксантин и кантаксантин. Однако, предпочтительно, использовать бактерии, принадлежащие к роду Paracoccus. Из бактерий, принадлежащих к роду Paracoccus, предпочтительно использовать Paracoccus carotinifaciens, Paracoccus marcusii и Paracoccus haeundaensis, а наиболее предпочтительно, Paracoccus carotinifaciens. Конкретными примерами бактериальных штаммов, принадлежащих к роду Paracoccus, являются бактериальный штамм Paracoccus carotinifaciens E-396 (FERM BP-4283) и бактериальный штамм Paracoccus A-581-1 (FERM BP-4671) (патентный документ 3 и непатентный документ 3). Эти бактериальные штаммы могут быть также предпочтительно использованы в способе согласно изобретению.

В качестве бактерии, продуцирующей каротиноид, предпочтительно использовать бактерию, в которой нуклеотидная последовательность ДНК, соответствующая рибосомной РНК 16S, по существу, гомологична нуклеотидной последовательности E-396, представленной в SEQ ID NO:1. Используемый здесь термин «по существу, гомологичные» означает, что нуклеотидные последовательности, после секвенирования ДНК, являются гомологичными предпочтительно на 95% или более, более предпочтительно, на 96% или более, еще более предпочтительно, на 97% или более, еще более предпочтительно, на 98% или более, а наиболее предпочтительно, на 99% или более и т.п., с учетом частоты встречаемости ошибок. Гомология может быть определена, например, с помощью компьютерной программы для анализа генов Clustal W.

Выражение «нуклеотидная последовательность ДНК, соответствующая последовательности рибосомной РНК 16S» означает нуклеотидную последовательность, полученную путем замены U (урацила) в этой нуклеотидной последовательности рибосомной РНК 16S основанием T (тимином).

В последнее время, классификация микроорганизмов на основе гомологии нуклеотидной последовательности рибосомной РНК 16S становится ведущим направлением. Поскольку стнадартная классификация микроорганизмов основана на общеизвестных микологических свойствах, таких как подвижность, ауксотрофия и утилизация сахаров, то в случае изменения их свойств, обусловленного спонтанной мутацией или т.п., микроорганизмы могут быть неправильно классифицированы. С другой стороны, нуклеотидные последовательности рибосомной РНК 16S являются достаточно стабильными на генетическом уровне, а поэтому классификация на основе их гомологии, по сравнению со стандартными методами классификации, является значительно более надежной.

Гомология между нуклеотидной последовательностью рибосомной РНК 16S штамма Paracoccus carotinifaciens E-396 и нуклеотидными последовательностями рибосомных РНК 16S других бактерий, продуцирующих каротиноид, то есть, штамма Paracoccus marcusii DSM 11574 (International Journal of Systematic Bacteriology (1998), 48, 543-548), бактериального штамма Paracoccus N-81106 (патентный документ 5), штамма Paracoccus haeundaensis BC 74171 (непатентный документ 4), бактериального штамма Paracoccus A-581-1, и штамма Paracoccus sp. PC-1 (патентный документ 6) составляет 99,7%, 99,7%, 99,6%, 99,4% и 95,4%, соответственно, что указывает на то, что эти штаммы являются в наивысшей степени близкородственными по своей таксономии. В соответствии с этим, указанные штаммы могут рассматриваться как одна группа бактерий, продуцирующих каротиноид. Таким образом, эти бактериальные штаммы могут быть, предпочтительно, использованы в способе согласно изобретению для эффективного продуцирования астаксантина.

В соответствии со способом настоящего изобретения, могут быть также использованы мутантные штаммы, обладающие повышенной способностью продуцировать астаксантин. Примерами таких мутантных штаммов являются штаммы, описанные в публикации выложенной заявки на патент Японии No. 2001-95500 A, и штаммы, описанные в патентном документе 9.

Альтернативно, мутантные штаммы, обладающие повышенной способностью продуцировать астаксантин, могут быть получены путем введения мутаций и скрининга. Метод введения мутаций не имеет ограничений, при условии, что он будет обеспечивать индуцирование мутации. Так, например, могут быть применены химические методы с использованием мутагена, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) или этилметансульфонат (EMS); физические методы, такие как облучение ультрафиолетом и облучение рентгеновскими лучами, и биологические методы, такие как рекомбинация генов и введение транспозона. Кроме того, мутантными штаммами могут быть штаммы, образующиеся благодаря природной мутации. Что касается свободного доступа или безопасности микроорганизма для исследований, то предпочтительно, использовать микроорганизм, который не является генетически рекомбинантным.

Способ скрининга мутантного штамма, имеющего повышенную способность продуцировать астаксантин, не имеет конкретных ограничений, и таким методом может быть, например, метод, в котором представляющий интерес мутантный штамм выбирают в соответствии с цветовым оттенком колонии на агаровой среде, или метод, в котором мутантный штамм культивируют в тест-пробирке, в колбе, в ферментере или т.п., и метод, в котором представляющий интерес мутантный штамм выбирают в соответствии с анализом на каротиноидный пигмент, проводимом с помощью абсорбционной хроматографии, высокоразрешающей жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии или т.п.

Такие стадии введения мутации и скрининга могут быть осуществлены один раз, либо они могут быть повторены два или более раз; так, например, мутантные штаммы могут быть получены путем мутагенеза и скрининга, а затем они могут быть дополнительно подвергнуты другому способу введения мутаций и скрининга, в результате чего может быть получен мутантный штамм, обладающий повышенной способностью продуцировать астаксантин.

В способе согласно изобретению может быть использован мутантный штамм, обладающий пониженной способностью продуцировать PHB (поли-β-гидроксибутират). Так, например, такой мутантный штамм может быть получен из бактериального штамма Paracoccus E-396 или A-581-1, описанных выше, или т.п. Известно, что бактерии, продуцирующие астаксантин, накапливают PHB внутри клеток в качестве запасного источника углерода. Аккумуляция РНВ приводит к дефициту источника углерода в среде. Таким образом, для снижения производственных затрат, предпочтительно, минимизировать аккумуляцию PHB. То есть, желательно получить такой мутантный штамм, который аккумулировал бы небольшое количество PHB или вообще не аккумулировал бы PHB при введении мутации и при скрининге. Конкретным примером способа получения штамма, характеризующегося низким уровнем продуцирования РНВ, является способ, в котором осуществляют введение мутации как описано выше; затем каждый мутантный штамм культивируют в тест-пробирке, в колбе, в агаровой среде или т.п., после чего определяют количество PHB, и отбирают мутантный штамм, характеризующийся низким уровнем продуцирования РНВ.

В способе согласно изобретению может быть также использован мутантный штамм, обладающий пониженной способностью продуцировать глюконовую кислоту. Так, например, такой мутантный штамм может быть получен из бактериального штамма Paracoccus E-396 или A-581-1, описанных выше, или т.п. При продуцировании глюконовой кислоты происходит истощение источника углерода в среде. Кроме того, аккумуляция большого количества глюконовой кислоты приводит к ингибированию роста бактерий или продуцирования каротиноидов. Таким образом, для продуцирования каротиноидов, желательно минимизировать продуцирование глюконовой кислоты. Конкретным примером способа получения штамма, характеризующегося низким уровнем продуцирования глюконовой кислоты, является способ, в котором осуществляют введение мутации как описано выше, затем каждый мутантный штамм культивируют в тест-пробирке, в колбе или т.п., и определяют рН каждой полученной культутральной жидкости для отбора мутантных штаммов с подтвержденным небольшим снижением значения рН в культуральной жидкости, после чего определяют количество глюконовой кислоты в культуральной жидкости каждого отобранного мутантного штамма, и, наконец, отбирают мутантный штамм, характеризующийся низким уровнем продуцирования глюконовой кислоты.

Мутантные штаммы, которым необходимо сообщить предпочтительные свойства, такие как мутантный штамм, обладающий повышенной способностью продуцировать астаксантин, мутантный штамм, обладающий пониженной способностью продуцировать РНВ, и мутантный штамм, обладающий пониженной способность продуцировать глюконовую кислоту, описанные выше, могут быть получены отдельно. Альтернативно, введение мутации и скрининг могут быть проведены повторно с получением мутантного штамма, имеющего два или более из указанных свойств. Может быть также получен мутантный штамм, которому два или более свойства были одновременно сообщены с применением комбинации из двух или более методов скрининга с введением одной мутации. В способе согласно изобретению может быть также использован мутантный штамм, имеющий два или более предпочтительных свойства.

Штамм E-396, представляющий собой каротиноид-продуцирующую бактерию, используемую в способе согласно изобретению, был депонирован как международный депозит в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов (IPOD), в Национальном институте передовых промышленных наук и технологий (AIST) и в депозитариях, указанных ниже.

Международная ассоциация депозитариев:

Международный депозитарий патентованных микроорганизмов (IPOD), Национальный институт передовых промышленных наук и технологий (AIST) (бывший Национальный институт биологических наук и технологий, Комитет по научно-техническим исследованиям, Министерство международной торговли и промышленности)

Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan

Идентификационный номер: E-396

Регистрационный номер №: FERM BP-4283

Дата исходного депозита: 27 апреля, 1993.

Штамм A-581-1, представляющий собой каротиноид-продуцирующую бактерию, используемую в способе согласно изобретению, был депонирован как международный депозит, в соответствии с авторизацией, описанной ниже.

Идентификационный номер: A-581-1

Регистрационный номер №: FERM BP-4671

Дата исходного депозита: 20 мая, 1994.

Примерами каротиноидов, не являющихся астаксантином и кантаксантином, и полученных в способе согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, адониксантин, феникоксантин, β-каротин, эхиненон, астероиденон, 3-гидроксиэхиненон, зеаксантин, β-криптоксантин и ликопен. Предпочтительными примерами являются адониксантин и адонирубин. Каротиноид одного типа или комбинация каротиноидов многих типов могут быть получены способом согласно изобретению.

Ниже также описан метод культивирования вышеописанных бактерий, применяемый в способе согласно изобретению. Используемый здесь термин «продукт культивирования» не ограничивается культуральной жидкостью, и в объем этого термина могут входить твердое вещество, полутвердое вещество или т.п.

Средой для продуцирования астаксантина, используемого для культивирования в способе согласно изобретению, может быть любая среда, при условии, что она содержит биотин и способствует росту астаксантин-продуцирующей бактерии, а также продуцированию астаксантина. Предпочтительно использовать среду, содержащую источник углерода, источник азота, неорганическую соль, и если это необходимо, витамин или т.п. То есть, в соответствии со способом согласно изобретению, биотин добавляют в среду, которая способствует росту астаксантин-продуцирующей бактерии и продуцированию астаксантина.

Примерами источников углерода являются: сахара, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, трегалоза, манноза, маннит и мальтоза; органические кислоты, такие как уксусная кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота, пропионовая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота и пировиноградная кислота; спирты, такие как этанол, пропанол, бутанол, пентанол, гексанол, изобутанол и глицерин; а также масла и жиры, такие как соевое масло, масло из рисовых отрубей, оливковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло и льняное масло, при этом, предпочтительными являются глюкоза или сахароза. Так, например, могут быть использованы один или несколько типов указанных источников углерода. Количество источников углерода, добавляемых в предкультуральную среду (исходную среду) может варьироваться в зависимости от типа источника углерода, и может быть соответствующим образом скорректировано, но обычно оно составляет 1-100 г, а предпочтительно 2-50 г на 1 л среды. Источник углерода может быть добавлен не только в исходную среду, но также, предпочтительно, он может быть введен во время культивирования либо последовательно, либо непрерывно.

Примерами неорганических источников азота являются: соли аммония, такие как нитрат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония; нитраты, такие как нитрат калия; аммиак и мочевина. При этом могут быть использованы один или несколько типов указанных неорганических источников азота. Количество добавляемых неорганических источников азота может варьироваться в зависимости от типа источника азота, и может быть соответствующим образом скорректировано, но обычно оно составляет 0,1-20 г, а предпочтительно 0,2-10 г на 1 л среды.

Примерами органических источников азота являются раствор из выжимок кукурузы (включая отфильтрованные продукты), фармацевтические средства, соевый крахмал, соевая мука, арахисовая мука, моноглутамат натрия, растворимые вещества барды и сухие дрожжи. При этом, могут быть использованы один или несколько типов указанных органических источников азота. Концентрация добавляемых органических источников азота может варьироваться в зависимости от типа источника азота, и может быть соответствующим образом скорректирована, но обычно она составляет 0-80 г, а предпочтительно 0-30 г на 1 л среды.

Неорганический источник азота и органический источник азота обычно добавляют в исходную среду, однако, предпочтительно, они могут быть также введены либо последовательно, либо непрерывно.

Примерами неорганических солей являются: фосфаты, такие как дигидрофосфат калия, бифосфат калия и бифосфат натрия; соли магния, такие как сульфат магния и хлорид магния; соли железа, такие как сульфат железа и хлорид железа; соли кальция, такие как хлорид кальция и карбонат кальция; соли натрия, такие как карбонат натрия и хлорид натрия; соли марганца, такие как сульфат марганца; соли кобальта, такие как хлорид кобальта; соли меди, такие как сульфат меди; соли цинка, такие как сульфат цинка; соли молибдена, такие как молибдат натрия; соли никеля, такие как сульфат накеля; соли селена, такие как селенат натрия; борная кислота и иодид калия. При этом, могут быть использованы один или несколько типов указанных неорганических солей. Количество добавляемых неорганических солей может варьироваться в зависимости от типа неорганической соли и может быть соответствующим образом скорректировано, но обычно оно составляет 0,0001-15 г на 1 л среды. Концентрация фосфата, соли магния, соли кальция, соли натрия или соли железа предпочтительно составляет 0,02-15 г/л среды. При добавлении соли марганца, соли кобальта, соли меди, соли цинка, соли молибдена, соли никеля, соли селена, борной кислоты, иодида калия или т.п., их концентрация предпочтительно, составляет 0,1-15 мг/л. Неорганическую соль обычно добавляют в исходную среду, однако, она может быть также введена либо последовательно, либо непрерывно.

Примерами используемых витаминов, не относящихся к биотину, являются цианокобаламин, рибофлавин, пантотеновая кислота, пиридоксин, тиамин, аскорбиновая кислота, фолиевая кислота, ниацин, п-аминобензойная кислота, инозит и холин. Количество добавляемого витамина может варьироваться в зависимости от типа витамина, однако, оно может быть соответствующим образом скорректировано, но обычно оно составляет 0,001-1000 мг, а предпочтительно, 0,01-100 мг на 1 л среды. Витамин обычно добавляют в исходную среду, однако, он может быть также добавлен либо последовательно, либо непрерывно.

Способ согласно изобретению отличается тем, что он включает культивирование астаксантин-продуцирующей бактерии в среде, в которую был добавлен биотин. При культивировании астаксантин-продуцирующей бактерии в среде, в которую был добавлен биотин, может быть продуцирован астаксантин в высокой концентрации, но концентрация кантаксантина будет оставаться на низком уровне.

Биотином, используемым в способе согласно изобретению, может быть DL-биотин или D-биотин. При этом, предпочтительно использовать D-биотин. Биотин обычно добавляют в исходную среду, однако, он может быть также добавлен либо периодически, либо непрерывно во время культивирования. Альтернативно, биотин может быть добавлен в исходную среду, а затем, он может быть добавлен периодически или непрерывно во время культивирования. Биотин может быть смешан с базальной средой, а затем такая среда может быть стерилизована. Альтернативно, биотин может быть отдельно стерилизован, а затем добавлен в базальную среду. Способ стерилизации биотина не имеет конкретных ограничений, и таким способом может быть тепловая стерилизация или стерилизация на фильтре.

Нижний предел концентрации биотина, добавляемого в среду, не имеет конкретных ограничений, но, предпочтительно, он составляет 0,001 мг/л, более предпочтительно, 0,005 мг/л, еще более предпочтительно, 0,01 мг/л, а особенно предпочтительно, 0,02 мг/л. Верхний предел концентрации биотина, добавляемого в среду, не имеет конкретных ограничений, но предпочтительно, он составляет 50 мг/л, более предпочтительно, 20 мг/л, еще более предпочтительно, 10 мг/л, особенно предпочтительно, 5 мг/л, а наиболее предпочтительно, 2 мг/л.

В способе согласно изобретению предпочтительно использовать пеногаситель для предотвращения образования пузырьков в продукте культивирования. При этом, может быть использован пеногаситель любого типа, при условии, что он будет предотвращать образование пузырьков или удалять образовавшиеся пузырьки, но при этом, не будет оказывать ингибирующее действие на астаксантин-продуцирующую бактерию. Примерами пеногасителей являются пеногасители на основе спирта, пеногасители на основе полиэфира, пеногасители на основе сложного эфира, пеногасители на основе жирной кислоты, пеногасители на основе кремния и пеногасители на основе сульфоновой кислоты. Количество добавляемого пеногасителя может варьироваться в зависимости от типа пеногасителя и может быть соответствующим образом скорректировано, но обычно оно составляет 0,01-10 г на 1 л среды.

Пеногаситель обычно добавляют в исходную среду перед стерилизацией. Он может быть также добавлен непрерывно или периодически во время культивирования. Примерами методов добавления пеногасителя во время культивирования являются метод, в котором, после обнаружения пузырьков с помощью датчика, автоматически добавляется пеногаситель; метод, в котором пеногаситель добавляется через определенные интервалы времени, запрограммированные на таймере; и метод, в котором пеногаситель смешивают с источником углерода, источником азота, рН-корректирующим агентом или т.п. с последующей подачей этой смеси так, чтобы ее добавление происходило в ответ на изменение скорости роста. При этом, пеногасителем, добавляемым в исходную среду, может быть тот же пеногаситель, который был добавлен в продукт культивирования в процессе культивирования. Альтернативно, для достижения нужных эффектов могут быть использованы пеногасители различных типов.

В соответствии со способом согласно изобретению, рН среды в начале культивирования доводят до значений 2-12, предпочтительно, 6-9, а более предпочтительно, 6,5-8,0. Во время культивирования, предпочтительно, чтобы рН составлял в пределах указанных значений. Предпочтительным методом поддержания нужного рН является метод, в котором pH культуральной жидкости измеряют он-лайн с использованием pH-электрода, установленного внутри ферментера с автоматической подачей щелочи. Примерами pH-корректирующих агентов являются: водный раствор гидроксида натрия, водный раствор гидроксида калия, водный раствор карбоната натрия, аммиачная вода, газообразный аммиак, водный раствор серной кислоты и их смесь.

Среду, используемую в способе согласно изобретению, стерилизуют перед ее применением для культивирования бактерий. Стерилизация может быть соответствующим образом осуществлена специалистом в данной области. Так, например, среда в подходящем контейнере может быть подвергнута тепловой стерилизации в автоклаве. Альтернативно, стерилизация путем фильтрации может быть осуществлена с помощью стерилизующего фильтра. В другом случае, стерилизация может быть осуществлена путем нагрева через рубашку и паровой инжекции. Если источник углерода, такой как глюкоза, подвергают тепловой стерилизации вместе с другими компонентами среды, то этот источник приобретает коричневатый оттенок, а поэтому, он может быть стерилизован отдельно. Витамин или небольшое количество металла могут быть подвергнуты тепловой стерилизации вместе с базальной средой, либо они могут быть стерилизованы отдельно для предотвращения дезактивации или осаждения.

В соответствии со способом согласно изобретению, астаксантин-продуцирующую бактерию инокулируют в биотин-содержащую среду, полученную как описано выше, а затем культивируют в предварительно определенных условиях. Инокуляцию осуществляют путем соответствующего культивирования бактериального штамма в посевной культуре в тест-пробирке, в колбе, в ферментере или т.п., и добавления полученного продукта культивирования в биотин-содержащую среду для продуцирования астаксантина. Среда, испо