Вакцины с живыми бактериальными изолятами для системного введения

Вакцины с живыми бактериальными изолятами для системного введения

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к вакцинам для системного введения, которые содержат живой аттенуированный бактериальный изолят. Это изобретение относится также к получению таких вакцин и способам вакцинации субъектов-животных.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) является высокоинфекционной грамотрицательной бактерией, которая может эффективно колонизировать здоровую реснитчатую респираторную мукозу (слизистую оболочку) с вызыванием респираторных инфекций в широком диапазоне видов-хозяев. Таким образом, B. bronchiseptica является этиологическим агентом как в атрофическом рините в свиньях, так и в псовом кашле у собак.

Однако следует отметить, что люди с гораздо большей вероятностью инфицируются более известным видом Bordetella pertussis (B. pertussis), для которой люди являются единственной природной мишенью (см., Stevenson and Roberts, FEMS Immunology and Medical Microbiology 37:121-128 (2003)). Кроме того, в отличие от B. pertussis, B. bronchiseptica не экспрессирует коклюшный токсин. Кроме того, в то время как нет данных о том, что инфекции B. pertussis приводят к продолжительной колонизации верхних дыхательных путей, B. bronchiseptica вызывает хроническую инфекцию в верхних дыхательных путях в ряде различных видов животных.

В соответствии с этим, в то время как системное введение живой вакцины B. pertussis было недавно предложено для субъектов-людей (см., U.S. Publication No. 2009/0246222 A1), до сих пор живые аттенуированные вакцины B. bronchiseptica конструировали для местного интраназального введения в животных (за исключением людей), например, Nobivac^®KC and Intra-Trac II (доступные из Merck Animal Health), Recombitek^® KC2 (доступный из Merial) и Bronchi-Shield III (доступный из Fort Dodge).

Одним конкретным путем генерирования живой аттенуированной бактерии является модификация одного или нескольких ключевых генов этой бактерии. Во многих микроорганизмах хоризмат является критическим промежуточным продуктом в биосинтезе важных ароматических соединений, включающих в себя фолиевую кислоту и три ароматических аминокислоты, фенилаланин, тирозин и триптофан (Moat et al., Microbial Physiology (2002) Wiley-Liss, Chapter 15, pgs. 525-527). Таким образом, для генерирования живых аттенуированных бактерий использовали ген в биосинтетическом пути хоризмата, такой как aroA. Таким образом, конструировали значительное количество бактерий, содержащих делецию в их генах aroA, в том числе: Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Hemophilus somnus (см., например, Briggs, and Tatum, Applied and Environmental Microbiology, 71 (11) 7187-7195 (2005); Tatum and Briggs, Applied and Environmental Microbiology, 71 (11) 7196-7202. (2005); патент США № 5840556), Salmonella typhimurium (Dougan et al., Molecular and General Genetics, 207(2-3) 402-405 (1987), и B. pertussis (Roberts et al., Infectious Immunology 58:732-739 (1990)). Однако до сих пор вакцины, содержащие такие aroA-мутантные бактерии, показывали, в большинстве случаев, минимальный успех, если был какой-либо успех, см., например, абзац (0133) публикации США № 2009/0246222 A1, которая конкретно ссылается на довольно ограниченный успех вакцин, содержащих B. pertussis с делецией aroA, и которая рекомендует вместо этого применение живых конструктов B. pertussis с мутацией в гене, кодирующем один из трех главных токсинов B. pertussis.

Был также сконструирован штамм B. bronchiseptica с делецией aroA (делетант aroA) (Stevenson and Roberts, Vaccine 20, 2325-2335 (2002)). Эти исследователи использовали их штамм B. bronchiseptica с делецией aroA только в интраназальной вакцине. Однако интраназальные вакцины являются не пригодными для введения, особенно взрослым животным, таким как псовые или кошачьи, которые часто сопротивляются введению любого вещества в их ноздри. Введение таких интраназальных вакцин часто создает риск, заключающийся в том, что количество вакцины, принятой этим животным, будет значимо меньшим, чем доза, показанная как защитная, если это животное чихает во время введения. С другой стороны, до сих пор системное введение живых вакцин не рассматривалось в качестве безопасного выбора, так как известно, что системное введение живой B. bronchiseptica, даже аттенуированной, может приводить к серьезному образованию абсцессов (см., например, Toshach et al., J Am Anim Hosp Assoc 33:126-128 (1997)).

Несколько убитых цельноклеточных и субъединичных вакцин B. bronchiseptica были также описаны для парентерального введения собакам, в том числе убитая цельноклеточная вакцина B. bronchiseptica Bronchicine^®CAe, которая доступна из Pfizer Animal Health. К сожалению, имеются некоторые недостатки таких убитых вакцин B. bronchiseptica. Например, грамотрицательным бактериям свойственны липополисахариды (LPS), и, следовательно, системное введение убитой вакцины B. bronchiseptica может приводить к эндотоксическому шоку вследствие LPS. Таким образом, убитые вакцины должны быть высокоочищенными для минимизации количества LPS. Такая очистка делает получение этой вакцины более сложным, часто приводящим к потере эффективных антигенов и тем самым увеличивающим общую стоимость производства. Таким образом, остается потребность в получении вакцины для системного введения, которая является безопасной и эффективной, против B. bronchiseptica.

Цитирование любой ссылки здесь не должно пониматься как признание того, что такая ссылка является доступной в качестве известного «прототипа» изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для преодоления недостатков существующих вакцин, приведенных в качестве примеров выше, изобретение относится к новым вакцинам против бактериальных инфекций, а также их соответствующие иммуногенные композиции. Настоящее изобретение относится также к способам введения таких вакцин животному. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам предотвращения заболевания у животного посредством введения вакцины по изобретению. В частных вариантах осуществления это животное является представителем семейства псовых. В других вариантах осуществления это животное является представителем семейства кошачьих. В других вариантах осуществления это животное является представителем свиней.

В частных вариантах осуществления эта вакцина содержит живую aro-мутантную бактерию, которая находится в форме, подходящей для системного введения. В некоторых вариантах осуществления эта живая aro-мутантная бактерия является живой aroA-мутантной бактерией. В частных вариантах осуществления этой бактерией является B. bronchiseptica. В некоторых вариантах осуществления этого типа эта вакцина содержит живой aroA-мутантный штамм B. bronchiseptica. В частных вариантах по изобретению вакцина может способствовать защите животного и/или защищать это животное от нарушения и/или клинического заболевания, возникающего из инфекции B. bronchiseptica.

Вакцины по изобретению могут содержать живую aro-мутантную бактерию и ароматическую добавку. В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит тирозин. В некоторых вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит триптофан. В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фенилаланин. В некоторых вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит пара-аминобензойную кислоту. В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит 2,3-дигидробензойную кислоту. В некоторых вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фолиевую кислоту. В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит энтеробактин.

В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит множественные ароматические соединения. Варианты любой комбинации двух или более таких ароматических соединений могут содержаться в ароматической добавке вакцины по изобретению. В некоторых вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фенилаланин и триптофан. В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фенилаланин и тирозин. В некоторых вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит тирозин и триптофан. В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фенилаланин, тирозин и триптофан.

В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит пара-аминобензойную кислоту и 2,3-дигидроксибензойную кислоту. В некоторых вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит 2,3-дигидроксибензойную кислоту и фолиевую кислоту. В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фолиевую кислоту и энтеробактин. В некоторых вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит пара-аминобензойную кислоту и энтеробактин.

В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фенилаланин, тирозин, триптофан и пара-аминобензойную кислоту. В некоторых вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фенилаланин, тирозин, триптофан и фолиевую кислоту. В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фенилаланин, тирозин, триптофан и 2,3-дигидроксибензойную кислоту. В некоторых вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фенилаланин, тирозин, триптофан и энтеробактин. В частных вариантах осуществления ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фенилаланин, тирозин, триптофан, пара-аминобензойную кислоту и 2,3-дигидроксибензойную кислоту.

В некоторых вариантах осуществления вакцина по изобретению содержит адъювант. В частных вариантах этого типа этим адъювантом является соль алюминия. В некоторых вариантах осуществления эта соль алюминия является фосфатом алюминия. В других вариантах осуществления эта соль алюминия является гидроксидом алюминия. В дополнительных вариантах осуществления эта соль алюминия является сульфатом алюминия-калия. В частных вариантах осуществления вакцина по изобретению содержит как ароматическую добавку, так и адъювант. В частных вариантах осуществления вакцина по изобретению содержит фенилаланин, тирозин, триптофан и пара-аминобензойную кислоту, а адъювантом является гидроксид алюминия. В одном конкретном варианте осуществления этого типа ароматическая добавка вакцины по изобретению содержит фенилаланин, тирозин, триптофан, пара-аминобензойную кислоту и 2,3-дигидроксибензойную кислоту, а адъювант является гидроксидом алюминия.

Настоящее изобретение относится к также поливалентным вакцинам. Что касается всех вакцин по изобретению, поливалентные вакцины по изобретению могут содержать ароматическую добавку и/или адъювант. В некоторых вариантах осуществления эта вакцина содержит живую aroA-мутантную B. bronchiseptica и антиген вируса парагриппа псовых (CPI). В частных вариантах осуществления этот антиген вируса парагриппа является модифицированным живым вирусом парагриппа. В некоторых вариантах осуществления эта вакцина содержит живую aroA-мутантную B. bronchiseptica и антиген вируса гриппа псовых (CIV). В частных вариантах осуществления этот антиген вируса гриппа псовых является убитым вирусом гриппа псовых. В некоторых вариантах осуществления эта вакцина содержит живую aroA-мутантную B. bronchiseptica и как антиген вируса гриппа псовых, так и антиген вируса парагриппа псовых. В частных вариантах осуществления этого типа антиген вируса гриппа псовых является убитым вирусом гриппа псовых и антиген вируса парагриппа псовых является модифицированным живым вирусом парагриппа.

Особые поливалентные вакцины по изобретению могут содержать живой aroA-мутант B. bronchiseptica, который содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая кодирует чужеродный антиген (например, антиген из другого патогена). Эта гетерологичная нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, позволяя тем самым этому aroA-мутанту B. bronchiseptica экспрессировать этот чужеродный антиген. В некоторых вариантах осуществления этого типа эта гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует вирусный антиген. В частных вариантах осуществления этого типа этот вирусный антиген является антигеном вируса гриппа. В родственных вариантах осуществления этот антиген вируса гриппа является антигеном из вируса гриппа псовых. В других вариантах осуществления этот антиген вируса гриппа является антигеном из вируса гриппа кошачьих. В других вариантах осуществления этот антиген вируса гриппа является антигеном из вируса гриппа свиней. В некоторых вариантах осуществления этот антиген вируса гриппа является гемагглютинином. В других вариантах осуществления этот антиген вируса гриппа является нейраминидазой.

В более частных вариантах осуществления этот вирусный антиген является гемагглютинином Н3 вируса гриппа псовых. В других вариантах осуществления эта гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует антигенный фрагмент гемагглютинина Н3 вируса гриппа псовых. В других вариантах осуществления эта гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует нейраминидазу N8 вируса гриппа псовых. В других вариантах осуществления эта гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует нейраминидазу N2 вируса гриппа псовых. В других вариантах осуществления aroA-мутант B. bronchiseptica содержит множественные гетерологичные нуклеиновые кислоты. В одном конкретном варианте этого типа aroA мутант B. bronchiseptica aroA содержит как гетерологичнную нуклеиновую кислоту, кодирующую гемагглютинин H3 вируса гриппа псовых, так и гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую нейраминидазу N8 вируса гриппа псовых. В других вариантах осуществления этого типа эта гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует как гемагглютинин Н3, так и нейраминидазу N2 вируса гриппа псовых.

В более частных вариантах осуществления такие поливалентные вакцины содержат ароматическую добавку и/или адъювант в виде соли алюминия. В одном таком варианте осуществления эта поливалентная вакцина содержит ароматическую добавку и/или адъювант в виде соли алюминия и живой aroA-мутант B. bronchiseptica, содержащий гемагглютинин Н3 вируса гриппа псовых, который функционально связан с промотором. В некоторых вариантах осуществления такие поливалентные вакцины дополнительно содержат модифицированный живой вирус парагриппа.

Все вакцины по изобретению могут быть лиофилизированы и/или имеют их лиофилизированную часть (например, фракцию). В частных вариантах осуществления эта лиофилизированная вакцина или ее часть находится в форме лиофилизированного фильтровального осадка. В других вариантах осуществления эта лиофилизированная вакцина или ее часть находится в форме лиофилизированной сферы. В других вариантах осуществления эта лиофилизированная вакцина или ее часть находится в форме лиофилизированного овала и/или эллипсоида.

Таким образом, вакцины по изобретению могут быть получены в двух или более различных частях (например, фракций) по меньшей мере с одной, являющейся лиофилизированной фракцией. В одном родственном варианте осуществления этого типа по меньшей мере одна другая часть является жидкостью. В некоторых вариантах осуществления этого типа по меньшей мере одна часть является лиофилизированной и по меньшей мере одна другая является жидким разбавителем. В частных вариантах осуществления лиофилизированная часть поливалентной вакцины по изобретению содержит один или несколько антигенов, тогда как разбавитель содержит один или несколько других антигенов. В более частных вариантах осуществления этого типа лиофилизированная часть поливалентной вакцины содержит живую aroA-мутантную B. bronchiseptica. В частных вариантах осуществления этого типа лиофилизированная часть поливалентной вакцины содержит живую aroA-мутантную B. bronchiseptica вместе с модифицированным живым вирусом парагриппа псовых. В родственных вариантах осуществления этот разбавитель содержит убитый вирус гриппа псовых. В частных вариантах осуществления этот разбавитель содержит ароматическую добавку и/или адъювант. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированная часть поливалентной вакцины дополнительно содержит ароматическую добавку и/или адъювант. В частных вариантах осуществления как лиофилизированная часть поливалентной вакцины, так и разбавитель содержат ароматическую добавку и/или адъювант. В частных вариантах осуществления лиофилизированная часть поливалентной вакцины содержит живую aroA-мутантную B. bronchiseptica и вирус парагриппа псовых вместе с ароматической добавкой, тогда как разбавитель содержит убитый вирус гриппа псовых и адъювант. В более частных вариантах осуществления этим адъювантом является 2-5% гидроксид алюминия.

Настоящее изобретение также относится к способам поддержки защиты животного (в том числе человека) против клинического заболевания, которое возникает из инфекции B. bronchiseptica. В частных вариантах осуществления этот способ включает системное введение вакцины по изобретению животному. В некоторых вариантах осуществления этого типа это животное является млекопитающим. В частных вариантах осуществления это млекопитающее является свиньей. В других вариантах осуществления это млекопитающее является представителем семейства псовых. В других вариантах осуществления это млекопитающее является представителем семейства кошачьих. В некоторых вариантах осуществления системное введение вакцины по изобретению выполняют подкожной вакцинацией.

Настоящее изобретение также относится к применению живой aro-мутантной B. bronchiseptica для получения вакцины для защиты животного против клинического заболевания, возникающего из инфекции B. bronchiseptica. Предпочтительно эта вакцина находится в форме, подходящей для системного введения. В некоторых вариантах осуществления этого типа эта вакцина содержит адъювант. В частных вариантах осуществления этот адъювант является солью алюминия. В более частных вариантах осуществления соль алюминия является гидроксидом алюминия. В других вариантах осуществления соль алюминия является фосфатом алюминия. В других вариантах осуществления соль алюминия является сульфатом алюминия-калия.

В некоторых вариантах осуществления эта вакцина дополнительно содержит ароматическую добавку. В частных вариантах осуществления эта вакцина содержит как адъювант, так и ароматическую добавку. В более частных вариантах осуществления этот адъювант является гидроксидом алюминия и ароматическая добавка содержит фенилаланин, тирозин, триптофан, пара-аминобензойную кислоту и 2,3-дигидроксибензойную кислоту.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут более понятными со ссылкой на следующее подробное описание.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В отличие от убитых антигенов живые aro-мутантные бактерии по изобретению являются аттенуированными. В результате, следует соблюдать осторожность при приготовлении вакцины для поддержания титра аттенуированной бактерии на уровне, который является достаточно более низким, чем уровень, который может привести к значимому вредному эффекту. Однако достижение такого безопасного уровня часто приводит к существенному уменьшению эффективности живой аттенуированной вакцины. Настоящее изобретение позволило преодолеть эту проблему увеличением эффективности вакцины без увеличения титра живого аттенуированного бактериального антигена, добавляемого к вакцине. Кроме того, настоящее изобретение относится к средству для снижения стоимости производства этих вакцин, обеспечиваемому значительным уменьшением количества живых аттенуированных бактерий, необходимых для получения безопасной и эффективной вакцины.

Таким образом, настоящее изобретение относится к безопасным и эффективным вакцинам, которые содержат живую aro-мутантную бактерию в форме, подходящей для системного введения. В одном аспекте настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей живую aro-мутантную бактерию и ароматическую добавку. В частных вариантах осуществления эта живая аро-мутантная бактерия является aroA-мутантной бактерией. Неожиданно было обнаружено, что эффективность вакцины, содержащей живую aroA-мутантную бактерию, значимо увеличивалась при добавлении ароматической добавки к этой композиции вакцины, без вызывания неприемлемых реакций сайта инъекции.

В другом аспекте это изобретение относится к живым аттенуированным вакцинам, которые обнаруживают более высокую эффективность вследствие присутствия адъюванта. Часто такое улучшение эффективности, достигаемое добавлением адъюванта, резко увеличивает отрицательные побочные эффекты. Таким образом, неожиданно было обнаружено, что эффективность вакцины, содержащей aro-мутантную Bordetella bronchiseptica, могла быть улучшена добавлением адъюванта при сохранении все еще ее безопасности на приемлемом уровне. Этот результат приводит, inter alia, к увеличению диапазона эффективных доз для таких вакцин.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к живым aro-мутантным бактериальным вакцинам, которые обнаруживают более высокую эффективность вследствие присутствия как адъюванта, так и ароматической добавки, при сохранении все еще безопасности этой вакцины на приемлемом уровне.

Кроме того, это изобретение относится к способам применения живой аро-мутантной B. bronchiseptica для получения вакцины для системного введения для защиты животного против клинического заболевания, возникающего из инфекции B. bronchiseptica. Настоящее изобретение относится также к способу защиты животного против клинического заболевания, возникающего из инфекции B. bronchiseptica infection, который предусматривает системное введение вакцины, содержащей живой aro-мутантный штамм B. bronchiseptica.

В рамках изобретения следующие термины имеют определения, приведенные ниже.

В рамках изобретения «вакцина» является композицией, которая пригодна для введения животному (в том числе в некоторых вариантах осуществления людям), содержащей один или несколько антигенов, обычно объединенных с фармацевтически приемлемым носителем, таким как жидкость, содержащая воду, которая после введения животному индуцирует иммунную реакцию достаточно сильно, чтобы минимально содействовать защите от клинического заболевания, возникающего из инфекции микроорганизмом дикого типа, т.е. достаточно сильно для содействия в предотвращении клинического заболевания и/или предотвращения, уменьшения симптомов или излечения этого клинического заболевания.

В рамках изобретения «поливалентная вакцина» является вакциной, которая содержит два или более различных антигена. В одном конкретном варианте осуществления этого типа поливалентная вакцина стимулирует иммунную систему реципиента против двух или более различных патогенов.

В рамках изобретения термины «защита» или «обеспечение защиты от» и «содействует защите» не требуют полной защиты от любого показания инфекции. Например, «содействует защите» может означать, что эта защита является достаточной, так что после иммунизации симптомы лежащей в основе инфекции являются по меньшей мере уменьшенными, и/или что одна или несколько лежащих в основе клеточных, физиологических или биохимических причин или механизмов, вызывающих эти симптомы, уменьшаются или элиминируются. Понятно, что термин «уменьшенные» в этом контексте означает уменьшенные относительно состояния этой инфекции, в том числе молекулярного состояния инфекции, а не только физиологического состояния этой инфекции.

В рамках изобретения термин «фармацевтически приемлемые» используется здесь в виде прилагательного для обозначения, что модифицированное существительное является подходящим для применения в фармацевтическом продукте. При применении его, например, для описания эксципиента в фармацевтической вакцине, он характеризует этот эксципиент как являющийся совместимым с другими ингредиентами этой композиции и не является невыгодно вредным для имеющегося в виду реципиента.

Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которыми вводят это соединение. Фармацевтически приемлемыми носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и/или масла, в том числе масла из нефти, животные масла, растительные или синтетические масла, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода или водные солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина могут быть использованы в качестве носителей, в частности, для инъекционных растворов.

В рамках изобретения «адъювант» является веществом, которое способно благоприятствовать каскаду или усиливать каскад иммунологических событий, в конечном счете приводящим к улучшенной иммунологической реакции, т.е. интегрированной соматической реакции на антиген. Адъювант обычно не требуется для осуществления иммунологической реакции, но благоприятствует этой реакции или усиливает эту реакцию.

В рамках изобретения «системное введение» является введением в сердечно-сосудистую систему организма (содержащую сердечно-сосудистую и лимфатическую систему), влияющим на организм в целом, а не на специфический локус, такой как желудочно-кишечный тракт (например, через пероральное или ректальное введение), и респираторную систему (например, через интраназальное введение). Системное введение может выполняться, например, введением в мышечную ткань (внутримышечно), в дерму (интрадермально, трансназально или супраназально), под кожу (подкожно), под мукозу (субмукозно), в вены (внутривенно) и т.д.

«Парентеральное введение» включает подкожные инъекции, субмукозные инъекции, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, интрадермальные инъекции и инфузию.

В рамках изобретения термин «псовые» включает всех домашних собак, Canis lupus familiaris или Canis familiaris, если нет другого указания.

В рамках изобретения термин «кошачьи» относится к любому члену семейства кошачьих. Члены этого семейства включают диких членов, зоо- и домашних членов, таких как член подсемейств Feline, например, кошек, львов, тигров, пум, ягуаров, леопардов, снежных барсов, пантер, львов Североамериканских гор, гепардов, рысей, рыжих рысей, каракалов или любых из их кроссбредов. Кошки включают в себя также домашних кошек, чистопородных и/или нечистокровных кошек-компаньонов, шоу-кошек, лабораторных кошек, клонированных кошек и диких или одичавших кошек.

В рамках изобретения «генетическое изменение» гена в бактерии может быть обусловлено мутацией, и/или делецией гена, и/или инсерцией в этот ген и может включать в себя генетические события, которые осуществляются природно и/или в лабораторных условиях, и конструирование, например, посредством пассирования клеток и/или посредством одного или нескольких рекомбинантных генетических способов.

В рамках изобретения «aro-мутантная» бактерия является бактерией, которая либо не может синтезировать хоризмат, либо синтезирует значимо меньше хоризмата, чем соответствующая бактерия дикого типа, что приводит в результате к значительному ингибированию и/или блокированию роста этой бактерии в средах без добавок, окружающей среде или окружении. aroA-мутантная бактерия может происходить из генетического изменения гена в хоризматном биосинтетическом пути и/или посттрансляционной дисфункции, которая приводит к сравнимому ингибированию и/или инактивации соответствующего продукта гена (т.е. фермента, кодируемого этим геном).

В рамках изобретения «aroA-мутантная» бактерия является aro-мутантной бактерией, в которой это генетическое изменение находится в гене aroA и/или обусловлено посттрансляционной дисфункцией, которая приводит к сходному ингибированию и/или инактивации соответствующего продукта гена aroA.

В рамках изобретения «ароматическая добавка» является композицией, которая содержит одно или несколько ароматических соединений, которые могут компенсировать, по меньшей мере частично, неэффективный рост aro-мутантной бактерии (например, aroA-мутанта). Таким образом, присутствие ароматической добавки в средах, окружающей среде и/или окружении позволяет aro-мутантной бактерии расти более эффективно. Таким образом, ароматическая добавка может содержать один или несколько конечных продуктов биосинтетического пути, в котором хоризмат является промежуточным продуктом (например, ароматической аминокислотой, такой как фенилаланин) и/или промежуточным продуктом, который мог бы быть в противном случае биосинтезирован после хоризмата в биосинтетическом пути, который включает в себя хоризмат (например, пара-бензойную кислоту, которая является промежуточным продуктом в биосинтетическом пути фолиевой кислоты). Ароматическая добавка может также содержать альтернативный источник для хоризмата и/или альтернативный источник для одного или нескольких промежуточных продуктов в биосинтетическом пути хоризмата, которые подвергались вредному воздействию в aro-мутантной бактерии.

Хоризматный путь : Хоризмат является центральным промежуточным продуктом в биосинтезе фенилаланина, тирозина, триптофана, фолиевой кислоты, убихинона и энтеробактина (сидерофора) (см. Moat et al., Microbial Physiology (2002) Wiley-Liss, Chapter 15, pgs. 525-527). Реагенты, гены, кодирующие релевантные ферменты и продукты метаболического пре-хоризматного биосинтетического пути, начинающегося от комбинации D-эритроза-4-фосфата с фосфоэнолпируватом и заканчивающегося биосинтезом хоризмата, представлены ниже:

где:

PEP обозначает фосфоенолпируват;

DAHP обозначает 7-фосфат 3-гидрокси-L-арабиногептулозоната;

3-P-шикимат обозначает 3-фосфошикимат; и

EEPK обозначает 3-еноилпирувил-3-фосфошикимат.

Реагенты (реагенты)	Ген (гены)	Продукт (продукты)
D-эритрозо-4-фосфат + РЕР	-- aro (F, G, H)- →	DAHP
DAHP	-- aro B - →	3-дигидрохинат
3-дигидрохинат	-- aro D - →	3-дигидрошикимат
3-дигидрошикимат	-- aro E - →	шикимат
Шикимат + АТФ	-- aro (K, L)- →	3-P-шикимат + АДФ
3-P-шикимат + PEP	-- aro A - →	EEPK
EEPK	-- aro C - →	Хоризмат

Как можно видеть, следующий порядок aroA-генов (кодирующих изоферменты из F, G, H), B, D, E (кодирующих изоферменты из K, L), A и C участвуют в синтезе хоризмата в B. bronchiseptica. По-видимому, нет обходных путей в биосинтезе хоризмата в B. bronchiseptica. Таким образом, инактивация любого из этих aro-генов или соответствующих продуктов генов должна приводить к идентичной блокаде в биосинтезе ключевых ароматических соединений.

В частных вариантах осуществления эта aro-мутантная бактерия B. bronchiseptica является aroA-мутантом, хотя делеция в других aro-генах B. bronchiseptica может приводить к такой же блокаде в синтезе хоризмата, как отмечалось выше, и, следовательно, к тому же самому фенотипу этой мутантной бактерии.

Вакцины

Настоящее изобретение относится к безопасным и эффективным вакцинам, которые содержат живые аттенуированные бактерии, для системного введения. Следует понимать, что такие вакцины могут дополнительно содержать один или несколько обычных фармацевтически приемлемых носителей, включающих адъюванты (см. ниже), другие энхансеры иммунной реакции и/или наполнители (вместе называемые «эксципиентами»). Такие эксципиенты обычно выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с активным ингредиентом (активными ингредиентами) в вакцине. Применение эксципиентов обычно известно специалистам в области разработки вакцин.

Компоненты-стабилизаторы могут включать: сахара и сахароспирты (такие как сахароза, декстроза, трегалоза, сорбит), желатин, гидролизаты белков (гидролизат лактальбумина, NZ-Amine), сывороточный альбумин (бычий сывороточный альбумин, овальбумин) и буферные соединения. Необязательно и/или в дополнение другие вещества, такие как стабилизаторы и модификаторы вязкости, могут быть добавлены к вакцине в зависимости от предполагаемого использования или требуемых свойств этой вакцины. Многие формы вакцин пригодны для системной вакцинации, например, жидкие препараты с растворенными, эмульгированными или суспендированными антигенами, и твердые препараты, такие как имплантаты, или твердый носитель антигена, суспендированный в жидкости. Системная вакцинация и подходящие физические формы вакцин для такой вакцинации были известны в течение многих лет.

Также следует понимать, что эта вакцина может быть высушена замораживанием (лиофилизирована) или иным образом уменьшена в объеме для хранения и затем воспроизведена в жидком разбавителе перед введением или в момент введения. Такое воспроизведение может достигаться, например, с использованием воды со степенью чистоты, требуемой для вакцин. В некоторых вариантах осуществления, иллюстрируемых в примерах ниже, лиофилизированная часть поливалентной вакцины может содержать один или несколько антигенов, тогда как растворитель может содержать один или несколько других антигенов.

В частных вариантах осуществления вакцина по изобретению может находиться в лиофилизированной форме. Примеры таких лиофилизированных форм включают: фильтровальные лепешки, таблетки, сферы и/или эллипсоиды, причем три последние формы могут быть получены по способу, описанному в WO 2010/125084, включенном здесь посредством ссылки в его полном виде. В частности, можно привести примеры от страницы 15, строки 28, до страницы 27, строки 9 WO 2010/125084, в которых описан способ получения таких быстродезинтегрирующихся таблеток/сфер/эллипсоидов. Такие лиофилизированные формы могут быть легко растворены в разбавителе для обеспечения возможности системного введения этой вакцины. Такие разбавители могут дополнительно содержать один или несколько дополнительных активных компонентов этой вакцины.

Адъюванты : Как указано выше, вакцины по изобретению могут включать адъювант. В более частных вариантах осуществления этот адъювант содержит соль алюминия. Использование солей алюминия хорошо известно в области разработки вакцин. Соли алюминия были разработаны, в частности, для вакцин на основе токсоидов, но использовались также вместе с другими субъединичными вакцинами и вакцинами, содержащими инактивированные (цельные) микроорганизмы. Использование солей алюминия вместе с живыми вирусными вакцинами также описано, хотя соли алюминия обычно не используются для улучшения эффективности живых бактериальных вакцин. Однако неожиданно тот факт, что соли алюминия могут связывать живую B. brochiseptica, по-видимому, не оказывает отрицательного действия на адъювантные свойства этих солей в отношении живого aro-мутантного штамма B. bronchiseptica. Это в комбинации с хорошо известной регистрацией безопасности таких адъювантов делает их применение предпочтительным в сравнении с другими адъювантами, такими как углеводородные масла, сапонины и т.д. В одном улучшенном варианте осуществления соль алюминия выбирают из группы, состоящей из фосфата алюминия, фосфата алюминия-калия и гидроксида алюминия.

Оптимальное количество адъюванта для добавления к конкретной вакцине по изобретению может варьировать в зависимости от ряда переменных, таких как антигены, присутствующие в этой вакцине, и подлежащие вакцинации виды, но может быть легко определено специалистом в области разработки вакцин с использованием настоящего раскрытия. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения количество гидроксида алюминия, сульфата алюминия-калия и/или фосфата алюминия в этой вакцине может составлять от 0,5 до 15%. В более частных вариантах осуществления количество гидроксида алюминия, сульфата алюминия-калия и/или фосфата алюминия может составлять от 1,0 до 10% и в более частных вариантах осуществления количество гидроксида алюминия, сульфата алюминия-калия и/или фосфата алюминия в этой вакцине может составлять от 1,5 до 7,5%. Как иллюстрируется ниже, количество гидроксида алюминия и/или фосфата алюминия в этой вакцине составляет приблизительно 2% или альтернативно приблизительно 5%.

aroA-смесь: Как указано выше, aro-мутантные бактериальные вакцины по изобретению могут включать в себя ароматическую добавку. Эта ароматическая добавка может содержать одно или несколько ароматических соединений. Примеры таких ароматических соединений вкл