Композиция, содержащая очищенный экстракт, выделенный из pseudolysimachion rotundum var. subintegrum, содержащий большое количество активного компонента, или соединения, выделенные из него, в качестве активного компонента, для профилактики или лечения хронической обструктивной болезни легких (хобл) и ее применение

Композиция, содержащая очищенный экстракт, выделенный из pseudolysimachion rotundum var. subintegrum, содержащий большое количество активного компонента, или соединения, выделенные из него, в качестве активного компонента, для профилактики или лечения хронической обструктивной болезни легких (хобл) и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей очищенный экстракт, выделенный из Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum, содержащий большое количество активного компонента, или соединения, выделенные из него, в качестве активного компонента, для профилактики или лечения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и ее применению.

Уровень техники

Как правило, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) представляет собой одну из болезней легких, вызванную атипичным воспалительным заболеванием легких, приводящим к обструкции дыхательных путей. ХОБЛ приводит к одышке, возникающей в результате затруднения прохождения потока выдыхаемого воздуха, и характеризуется различными симптомами, например, слабо обратимым ограничением прохождения воздуха в дыхательных путях или обструкцией дыхательных путей, прогрессирующим развитием в соответствии со временем от начала заболевания и т.д., отличными от общих симптомов, характерных для астмы, и может быть классифицирована как легочная эмфизема и хронический обструктивный бронхит (Barnes P.J. 20014, Mediators of chronic obstructive pulmonary disease, Pharmacol. Rev. 56:515-548).

Сообщалось, что ХОБЛ может быть одним из факторов риска сердечнососудистой заболеваемости и смертности, и что ХОБЛ была пятой по значимости причиной смерти в мире в 2001 году. Распространенность хронической обструктивной болезни легких по данным Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких (GOLD) (отношение ОФВ1 к ФВС менее 0,7) составила 17,2% (у мужчин 25,8%; у женщин 9,6%) среди корейцев старше 45 лет (Dong Soon Kim, Young Sam Kim, Ki-Suck Jung, Jung Hyun Chang, Chae-Man Lim, Jae Ho Lee, Soo-Taek Uh, Jae Jeong Shim и Woo Jin Lew, on behalf of the Kopean Academy of Tuberculosis and Respiratory Diseases, Am J Respir Crit Care Med Vol 172. pp 842-847, 2005; Don D. Sin and S.F. Paul Man, Chronic Obstructive Pulmonary Disease as a Risk Factor for Cardiovascular Morbidity and Mortality, Proc Am Thorac Soc Vol 2. pp 8-11, 2005; A Sonia Buist, Mary Ann McBurnie, William M Vollmer, Suzanne Gillespie, Peter Burney, David M Mannino, Ana M В Menezes, Sean D Sullivan, Todd A Lee, Kevin В Weiss, Robert L Jensen, Guy В Marks, Amund Gulsvik, Ewa Nizankowska-Mogilnicka, International variation in the prevalence of COPD (The BOLD Study): a population-based prevalence study, Lancet, Vol 370; 741-750, September 1, 2007).

У большинства пациентов с ХОБЛ наблюдаются все три патологических механизма (хронический обструктивный бронхит, эмфизема и закупорка слизью), которые вызваны курением, но они могут различаться соотношением между эмфиземой и обструктивным бронхитом. В развитых странах курение сигарет является на сегодняшний день наиболее распространенной причиной ХОБЛ, но есть и другие факторы риска, включая загрязнение воздуха (в частности, загрязнение воздуха внутри помещений в результате сжигания топлива), плохое питание и профессиональное воздействие. ХОБЛ характеризуется увеличением темпов естественного снижения легочной функции с возрастом. Медленно прогрессирующее ограничение скорости воздушного потока приводит к дееспособности и преждевременной смерти, и довольно сильно отличается от переменной обструкции дыхательных путей и симптомов при астме, для которых редко наблюдается прогрессирование степени тяжести.

Сообщалось, что патофизиологическое действие и комплекс симптомов ХОБЛ принципиально отличаются от таковых при астме. Хотя и при ХОБЛ и при астме наблюдается воспаление в дыхательных путях, существуют заметные различия в характере воспалительного процесса - различия в воспалительных клетках, медиаторах, ответе на воспаление, анатомическом распространении и ответе на противовоспалительную терапию, например, (a) касательно воспалительных клеток, тучных клеток, эозинофилов, D4 + клеток (Th2), макрофагов и т.д., они главным образом влияют на возникновение астмы, в то время как на возникновение ХОБЛ главным образом влияют нейтрофилы, CD8+ (Tc) и т.д.; (b) касательно медиаторов воспаления, лейкотриенов B, гистамина, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13, эотаксина, RENTES, окислительного стресса и т.д., они главным образом участвуют в возникновении астмы, в то время как в возникновении ХОБЛ главным образом участвуют ФНО-альфа, ИЛ-8, GRO-альфа и т.д.; (c) касательно воспалительного комплекса симптомов, астма показывает воспалительный комплекс симптомов путем воздействия на весь легочный тракт в раннем возрасте, например, AHR (гиперреактивность дыхательных путей), эпителиальный шеддинг, фиброз, непаренхимальное вовлечение, секреция слизи, относительно обратимая обструкция дыхательных путей, кашель, чихание, одышка и т.д., в отличие от ХОБЛ, которая возникает в результате воздействия на периферические дыхательные пути у взрослых и характеризуется различными симптомами, такими как эпителиальная метаплазия, разрушение паренхимы, относительно необратимая обструкция дыхательных путей, хронический бронхит, эмфизема и т.д. (Barnes PJ (2000b) Mechanisms in COPD: differences from asthma. Chest 117 (Suppl): 10S-14S.; Saetta M, Turato G, Maestrelli P, Mapp CE, and Fabbri LM (2001) Cellular and structural bases of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163:1304-1309).

Гистопатологические исследования ХОБЛ показывают преобладающее участие периферических дыхательных путей (бронхиол) и легочной паренхимы, в то время как астма включает воспаление во всех дыхательных путях, но без вовлечения легочной паренхимы. Присутствует обструкция бронхиол с фиброзом и инфильтрацией макрофагами и Т-лимфоцитами. Присутствует разрушение паренхимы легких, а так же увеличение числа макрофагов и CD8 (цитотоксических) Т-лимфоцитов (Saetta М, Di Stefano A, Turato G, Facchini FM, Corbino L, Mapp CE, Maestrelli P, Ciaccia A, and Fabbri LM (1998) CD8T-lymphocytes in peripheral airways of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:822-826.). Бронхиальная биопсия показывает, что у больных с тяжелой ХОБЛ наблюдаются аналогичные изменения с инфильтрацией макрофагами и CD8 клетками и увеличенное число нейтрофилов (Di Stefano A, Capelli A, Lusuardi М, BALBo Р, Vecchio С, Maestrelli Р, Mapp CE, Fabbri LM, Donner CF, and Saetta M (1998) Severity of airflow limitation is associated with severity of airway inflammation in smokers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158:1277-1285.).

В отличие от астмы, эозинофилы не повышены, исключая период обострения или когда у пациента имеется сопутствующая астма (Fabbri L, Beghe В, Caramori G, Papi A, and Saetta M (1998) Similarities and discrepancies between exacerbations of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Thorax 53:803-808; Fabbri LM, Romagnoli M, Corbetta L, Casoni G, Busljetic K, Turato G, Ligabue G, Ciaccia A, Saetta M, and Papi A (2003) Differences in airway inflammation in patients with fixed airflow obstruction due to asthma or chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167:418-424.).

Соответственно, терапевтический подход к лечению хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) должен отличаться от подхода к лечению астмы, однако существующая в настоящее время терапия направлена на неспецифическое лечение обоих заболеваний. Таким образом, не существует противовоспалительной терапии, специально одобренной для ХОБЛ, и имеющиеся противовоспалительные методы терапии были первоначально разработаны для лечения астмы. Задачи, стоящие перед исследованиями ХОБЛ, разноплановы; необходимо раскрыть механизмы, лежащие в основе сложной и гетерогенной патологии этого заболевания; необходимо подтвердить роль воспаления в прогрессировании заболевания (Hele Dj, Belvisi MG, 2003. Novel therapies for the treatment of inflammatory airway disease, Expert. Opino. Invest. Drug, 12:5-18; J Craig Fox and Mary F Fitzgerald; The role of animal models in the pharmacological evaluation of emerging anti-inflammatory agents for the treatment of COPD, Current Opinion in Pharmacology 2009, 9:231-242).

Постоянно разрабатываются улучшенные методы терапии, используемые для лечения астмы, с применением более длительно действующих агонистов, более безопасных стероидов и комбинаций терапий, и антихолинергические средства обеспечивают облегчение симптомов для ХОБЛ. Стероиды используют для лечения обострений, но до сих пор ни для одного метода лечения не было показано, что он может в значительной степени влиять на прогрессирующее снижение функции легких при ХОБЛ или развитие астмы.

Соответственно, до настоящего времени было проведено много исследований, направленных на разработку новых лекарственных средств, способных обеспечивать эффективное и специфическое лечение ХОБЛ.

Особое внимание авторы настоящего изобретения уделяли разработке активного безопасного и эффективного лекарственного средства, полученного из природных источников, таких как растения, животные и т.д., обладающего сильной ингибирующей активностью на образование воспалительных клеток и, наконец, было обнаружено, что экстракт Pseudolysimachion longifolium проявляет высокую противовоспалительную, противоаллергическую и противоастматическую активность (патент Кореи №10-860080), и различные соединения, выделенные из него, такие как верпрозид (6-O-3,4-дигидроксибензоилкаталпол), пикрозид II (6-O-4-гидрокси-3-метоксибензоилкаталпол), верминозид (6-O-3,4-дигидроксициннамоилкаталпол), 6-O-вератроилкаталпол (6-O-3,4-диметоксибензоилкаталпол), минекозид (6-O-3-гидрокси-4-метоксициннамоилкаталпол), каталпол и т.п., также показали высокую противовоспалительную, противоаллергическую и противоастматическую активность (публикация патента Кореи №10-2006-125499).

Pseudolysimachion rotundum var subintegrum представляет собой многолетнее травянистое растение, распространенное в Корее, Китае, Японии, на острове Сахалин и в России.

На основании предыдущих исследований по противовоспалительной, противоаллергической и противоастматической активности экстракта Pseudolysimachion longifolium, описанного в патенте Кореи №10-860080, авторы настоящего изобретения пытались разработать более эффективный способ получения более активных компонентов и в более высоких количествах, выделенных из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum и проявляющих противовоспалительную, противоаллергическую и противоастматическую активность.

Тем не менее, не сообщалось и не был раскрыт эффективный способ получения более активных компонентов и в более высоких количествах, выделенных из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, проявляющих более высокую и специфическую активность против ХОБЛ, чем описанные в цитируемой выше литературе, раскрытие которых включено в данное описание с помощью ссылок.

Соответственно, авторы настоящего изобретения разработали новый промышленный способ получения очищенного экстракта, содержащего более высокие количества активных компонентов, таких как производные каталпола, из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, и очищенный экстракт или соединения, выделенные из него, показали высокую активность против ХОБЛ без агонистического эффекта на бета-2-рецепторы в различных исследованиях in vivo с использованием самцов мышей BALB/c, например, в исследовании ингибирования пролиферации и активности воспалительных иммуноцитов и рекрутинга нейтрофилов в легкие, вызванных заболеванием ХОБЛ; исследовании ингибирования воспроизводства хемокинов, вовлеченных в разрушение пневмоцитов, таких как МИП-2/CXCL-2, ФНО-альфа, KC/CXCL-1 (хемокины Gro-альфа), CXCL-8 и т.д.; эффект снижения высвобождения ИЛ-1 бета, ИЛ-6, ФНО-альфа и экспрессии ММП-9 за счет уменьшения активации NF-каппаВ в исследованиях на животных с применением СПФ (свободных от специфической патогенной микрофлоры) крыс линии Спрег-Доули, а также в исследовании in vitro, например, в исследовании ингибирования экспрессии гена MUC5AC (олигомерного слизь/гель-образующего), индуцирующий эффект на экспрессию ИЛ-4 Th2 клетками в исследовании анализа изменений молекулярной экспрессии и т.д.

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция и полезный для здоровья пищевой продукт, содержащие новый очищенный экстракт, содержащий активные компоненты, такие как производные каталпола, из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, или по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из вератровой кислоты, верпрозида, каталпозида, пикрозида II, изованиллоил каталпола и 6-O-вератроил каталпола, для лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Согласно настоящему изобретению также предложено применение нового очищенного экстракта, содержащего активные компоненты, такие как производные каталпола, из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, или по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из вератровой кислоты, верпрозида, каталпозида, пикрозида II, изованиллоил каталпола и 6-O-вератроил каталпола, для лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения или профилактики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества нового очищенного экстракта, содержащего активные компоненты, такие как производные каталпола, из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, или по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из вератровой кислоты, верпрозида, каталпозида, пикрозида II, изованиллоил каталпола и 6-O-вератроил каталпола, совместно с их фармацевтически приемлемым носителем.

Решение задачи

Соответственно, задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции или полезного для здоровья функционального пищевого продукта, содержащего новый очищенный экстракт, содержащий активные компоненты, такие как производные каталпола, из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, или по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из вератровой кислоты, верпрозида, каталпозида, пикрозида II, изованиллоил каталпола и 6-O-вератроил каталпола, для лечения или профилактики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

В настоящем описании термин "производные каталпола" включает верпрозид, каталпозид, пикрозид II, изованиллоил каталпол и 6-O-вератроил каталпол и т.д.

В настоящем описании термин "Pseudolysimachion rotundum var subintegrum" включает культивированное или выросшее в естественных условиях растение и коммерчески доступное растение, но не ограничивается перечисленным в настоящем документе.

В настоящем описании термин "новый очищенный экстракт" включает (a) очищенный экстракт, фракционированный с помощью бутанола (обозначенный как "ATC1" в дальнейшем) и (b) экстракт, очищенный с помощью вторичного фракционирования (обозначенный как "ATC2" в дальнейшем).

Конкретно, термин "очищенный экстракт, фракционированный с помощью бутанола (ATC1)" характеризуется содержанием 15-50% (масс./масс.) верпрозида, 0,3-10% (масс./масс.) вератровой кислоты, 0,5-10% (масс./масс.) каталпозида, 0,3-10% (масс./масс.) пикрозида II, 0,3-10% (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 0,3-10% (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола в расчете на массу общего экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; предпочтительно 20-25% (масс./масс.) верпрозида, 0,5-5% (масс./масс.) вератровой кислоты, 1-5% (масс./масс.) каталпозида, 0,5-5% (масс./масс.) пикрозида II, 0,5-5% (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 1-5% (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола в расчете на массу общего экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum;

и/или характеризуется содержанием 12,3-47% (масс./масс.) производных каталпола в общем экстракте (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, при этом массовое соотношение (масс./масс.) производных каталпола в экстракте является следующим: 15,0-18,0 частей (масс./масс.) верпрозида, 2,10-2,60 частей (масс./масс.) каталпозида, 1 часть (масс./масс.) пикрозида II, 1,00-1,30 частей (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 2,00-2,30 частей (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола; предпочтительно 16,0-17,0 частей (масс./масс.) верпрозида, 2,20-2,50 частей (масс./масс.) каталпозида, 1 часть (масс./масс.) пикрозида II, 1,10-1,20 частей (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 2,10-2,20 частей (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола; более предпочтительно 16,20-16,99 частей (масс./масс.) верпрозида, 2,40-2,45 частей (масс./масс.) каталпозида, 1 часть (масс./масс.) пикрозида II, 1,10-1,19 частей (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 2,10-2,19 частей (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола.

Более конкретно, термин "очищенный экстракт, фракционированный с помощью бутанола (ATC1)" приготовлен по способу, включающему: добавление на первой стадии по меньшей мере одного экстрагирующего растворителя, выбранного из воды, низшего C1-C4 спирта, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д. или их смесей, предпочтительно смеси воды и этанола, более предпочтительно 30-80% (масс./масс.) этанола в воде, для высушивания Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; осуществление на второй стадии по меньшей мере одного способа экстракции, выбранного из экстракции горячей водой в колбе с обратным холодильником, экстракции холодной водой, ультразвуковой или обычной экстракции, предпочтительно экстракции холодной водой, с последующей экстракцией в колбе с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 10 до 100°C, предпочтительно от 20 до 90°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, более предпочтительно экстракции холодной водой при температуре в диапазоне от 10 до 60°C, предпочтительно от 20 до 50°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, и затем экстракции в колбе с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 40 до 120°C, предпочтительно от 60 до 90°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, многократно, с получением первичного экстракта; суспендирование на 3 стадии первичного экстракта в примерно 0,5-10 кратном объеме (об./об.), предпочтительно примерно 1-5 кратном объеме (об./об.) воды с получением суспендированного экстракта; и добавление примерно 0,5-20 кратного объема (об./об.), предпочтительно примерно 1-10 кратного объема (об./об.) бутанола, разделение на водный слой и слой бутанола, и отбор слоя бутанола с получением фракционированного с помощью бутанола очищенного экстракта (ATC1), содержащего 15-50% (масс./масс.) верпрозида, 0,3-10% (масс./масс.) вератровой кислоты, 0,5-10% (масс./масс.) каталпозида, 0,3-10% (масс./масс.) пикрозида II, 0,3-10% (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 0,3-10% (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола в расчете на массу общего экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Соответственно, согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ получения очищенного экстракта, фракционированного с помощью бутанола (ATC1), выделенного из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, который включает следующие стадии: добавление на первой стадии по меньшей мере одного экстрагирующего растворителя, выбранного из воды, низшего C1-C4 спирта, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д. или их смесей, предпочтительно смеси воды и этанола, более предпочтительно 30-80% (масс./масс.) этанола в воде, для высушивания Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; осуществление на второй стадии по меньшей мере одного способа экстракции, выбранного из экстракции горячей водой в колбе с обратным холодильником, экстракции холодной водой, ультразвуковой или обычной экстракции, предпочтительно экстракции холодной водой, с последующей экстракцией в колбе с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 10 до 100°C, предпочтительно от 20 до 90°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, более предпочтительно экстракции холодной водой при температуре в диапазоне от 10 до 60°C, предпочтительно от 20 до 50°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов и затем экстракции в колбе с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 40 до 120°C, предпочтительно от 60 до 90°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, многократно, с получением первичного экстракта; суспендирование на 3 стадии первичного экстракта в примерно 0,5-10 кратном объеме (об./об.), предпочтительно примерно 1-5 кратном объеме (об./об.) воды с получением суспендированного экстракта; и добавление примерно 0,5-20 кратного объема (об./об.) бутанола, предпочтительно примерно 1-10 кратного объема (об./об.) бутанола, разделение на водный слой и слой бутанола, и отбор слоя бутанола с получением фракционированного с помощью бутанола очищенного экстракта (ATC1), содержащего 15-50% (масс./масс.) верпрозида, 0,3-10% (масс./масс.) вератровой кислоты, 0,5-10% (масс./масс.) каталпозида, 0,3-10% (масс./масс.) пикрозида II, 0,3-10% (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 0,3-10% (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола в расчете на массу общего экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Конкретно, термин "экстракт, очищенный с помощью вторичного фракционирования (ATC2)" содержит 30-60% (масс./масс.) верпрозида, 0,5-10% (масс./масс.) вератровой кислоты, 2-20% (масс./масс.) каталпозида, 1-10% (масс./масс.) пикрозида II, 1-10% (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 2-20% (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола в расчете на массу общего экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; предпочтительно 40-50% (масс./масс.) верпрозида, 1-5% (масс./масс.) вератровой кислоты, 3-10% (масс./масс.) каталпозида, 2-5% (масс./масс.) пикрозида II, 2-8% (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 3-8% (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола в расчете на массу общего экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum;

и/или содержит 36,5-91% (масс./масс.) производных каталпола в общем экстракте (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, при этом массовое соотношение (масс./масс.) производных каталпола в экстракте является следующим: 13,0-16,0 частей (масс./масс.) верпрозида, 2,20-2,50 частей (масс./масс.) каталпозида, 1 часть (масс./масс.) пикрозида II, 1,10-1,40 частей (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 2,00-2,20 частей (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола; предпочтительно 14,0-15,0 частей (масс./масс.) верпрозида, 2,30-2,45 частей (масс./масс.) каталпозида, 1 часть (масс./масс.) пикрозида II, 1,20-1,35 частей (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 2,00-2,10 частей (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола; более предпочтительно 14,0-14,99 частей (масс./масс.) верпрозида, 2,35-2,43 частей (масс./масс.) каталпозида, 1 часть (масс./масс.) пикрозида II, 1,25-1,34 частей (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 2,01-2,09 частей (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола.

Более конкретно, термин "экстракт, очищенный с помощью вторичного фракционирования (ATC2)" приготовлен по способу, включающему: добавление на первой стадии по меньшей мере одного экстрагирующего растворителя, выбранного из воды, низшего C1-C4 спирта, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д. или их смесей, предпочтительно смеси воды и этанола, более предпочтительно 30-80% (масс./масс.) этанола в воде, для высушивания Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; осуществление на второй стадии по меньшей мере одного способа экстракции, выбранного из экстракции горячей водой в колбе с обратным холодильником, экстракции холодной водой, ультразвуковой или обычной экстракции, предпочтительно экстракции холодной водой с последующей экстракцией в колбе с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 10 до 100°C, предпочтительно от 20 до 90°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, более предпочтительно экстракции холодной водой при температуре в диапазоне от 10 до 60°C, предпочтительно от 20 до 50°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, и затем экстракции в колбе с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 40 до 120°C, предпочтительно от 60 до 90°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, многократно, с получением первичного экстракта; суспендирование на 3 стадии первичного экстракта в примерно 0,5-10 кратном объеме (об./об.) воды, предпочтительно примерно 1-5 кратном объеме (об./об.) воды, с получением суспендированного экстракта; добавление примерно 0,5-20 кратного объема (об./об.), предпочтительно примерно 1-10 кратного объема (об./об.) бутанола, разделение на водный слой и слой бутанола, и отбор слоя бутанола с получением фракционированного с помощью бутанола (ATC1) очищенного экстракта; и осуществление по меньшей мере одного способа очистки очищенного экстракта, фракционированного с помощью бутанола (ATC1), при этом способ очистки выбран из группы, состоящей из обращенно-фазовой распределительной хроматографии, нормально-фазовой распределительной хроматографии, ионообменной хроматографии и гель-хроматографии, с получением экстракта, очищенного с помощью вторичного фракционирования (ATC2), содержащего 30-60% (масс./масс.) верпрозида, 0,5-10% (масс./масс.) вератровой кислоты, 2-20% (масс./масс.) каталпозида, 1-10% (масс./масс.) пикрозида II, 1-10% (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 2-20% (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола в расчете на массу общего экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для лечения или профилактики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Соответственно, согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ получения нового экстракта, очищенного с помощью вторичного фракционирования (ATC2), выделенного из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, который включает следующие стадии: добавление на первой стадии по меньшей мере одного экстрагирующего растворителя выбранного из воды, низшего C1-C4 спирта, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д. или их смесей, предпочтительно смеси воды и этанола, более предпочтительно 30-80% (масс./масс.) этанола в воде, для высушивания Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; осуществление на второй стадии по меньшей мере одного способа экстракции, выбранного из экстракции горячей водой в колбе с обратным холодильником, экстракции холодной водой, ультразвуковой или обычной экстракции, предпочтительно экстракции холодной водой с последующей экстракцией в колбе с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 10 до 100°C, предпочтительно от 20 до 90°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, более предпочтительно экстракции холодной водой при температуре в диапазоне от 10 до 60°C, предпочтительно от 20 до 50°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, и затем экстракции в колбе с обратным холодильником при температуре в диапазоне от 40 до 120°C, предпочтительно от 60 до 90°C, в течение периода времени от 30 минут до 72 часов, предпочтительно от 6 до 48 часов, многократно, с получением первичного экстракта; суспендирование на 3 стадии первичного экстракта в примерно 0,5-10 кратном объеме (об./об.), предпочтительно примерно 1-5 кратном объеме (об./об.) воды с получением суспендированного экстракта; добавление примерно 0,5-20 кратного объема (об./об.), предпочтительно примерно 1-10 кратного объема (об./об.) бутанола, разделение на водный слой и слой бутанола, отбор слоя бутанола с получением фракционированного с помощью бутанола (ATC1) очищенного экстракта; и осуществление по меньшей мере одного дополнительного способа очистки очищенного экстракта, фракционированного с помощью бутанола (ATC1), при этом способ очистки выбран из группы, состоящей из обращенно-фазовой распределительной хроматографии, нормально-фазовой распределительной хроматографии, ионообменной хроматографии и гель-хроматографии, с получением экстракта, очищенного с помощью вторичного фракционирования (ATC2), содержащего 30-60% (масс./масс.) верпрозида, 0,5-10% (масс./масс.) вератровой кислоты, 2-20% (масс./масс.) каталпозида, 1-10% (масс./масс.) пикрозида II, 1-10% (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 2-20% (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола в расчете на массу общего экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для лечения или профилактики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Конкретно, термин "дополнительный способ очистки" выбран из (i) обращенно-фазовой распределительной хроматографии, (ii) нормально-фазовой распределительной хроматографии, (iii) ионообменной хроматографии или (iv) гель-хроматографии, предпочтительно обращенно-фазовой распределительной хроматографии, или любого вида хроматографии с применением любой смолы в качестве неподвижной фазы, которая может удерживать неполярное вещество с элюированием полярного вещества, например, смола сефадекс, такая как сефадекс, сефадекс LH20, сефадекс G-25, сефадекс G-10, сефароза, супердекс, смола метилкрилата, карбоксиметилцеллюлоза, сульфопропилцеллюлоза, карбоксиметил сефадекс, сульфопропил сефадекс, карбоксиметил сефароза, сульфопропил сефароза и т.п.; полимерная смола с обращенной фазой, полученная с применением сополимера стирола-дивинилбензола, такого как полимер X, HP20, PRP-h1 полимер и т.п., или метакрилатная смола-носитель и т.д.; силикагель с нормальной фазой, такой как продукт BPC (хроматография на неподвижной фазе), продукт силикагеля, производимый YMC Co. Ltd, продукт силикагеля, производимый DAISO Co. Ltd, продукт силикагеля, производимый ASAHI Co. Ltd, продукт силикагеля, производимый COSMOSYL Co. Ltd и т.п., продукт ОДС, служащий наполнителем для ВЭЖХ, такой как продукт ОДС, производимый YMC Co. Ltd, продукт ОДС, производимый DAISO Co. Ltd, продукт ОДС, производимый ASAHI Co. Ltd, продукт ОДС, производимый CHEMCO Co. Ltd, продукт ОДС, производимый Merck Co. Ltd, продукт ОДС, производимый COSMOSYL Co. Ltd, продукт ОДС, производимый FUJI Co. Ltd и т.п.

В предпочтительном варианте реализации, в котором применяют (i) обращенно-фазовую распределительную хроматографию в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению, "неподвижной фазой в вышеописанной обращенно-фазовой распределительной хроматографии" может быть любая неподвижная фаза, такая как вещество с обращенной фазой, которое способно удержать неполярное вещество и при этом элюироваться полярное вещество, предпочтительно неподвижная фаза на основе силикагеля, неподвижная фаза на основе полимера, такого как полистирол и т.д. и т.п., более предпочтительно производные силикагеля C2, C4, C6, C8, C10, C12, 14, C16, C18 и т.п.; или неподвижная фаза на основе полимера, такая как PS-2, Oasis HLB и т.п., и наиболее предпочтительно продукт на основе силикагеля с обращенной фазой (C18(IV)-D), ODS-A/ODS-AQ, производимый YMC Co. Ltd., продукт SP-C-ODS, производимый CHEMCO Co. Ltd., продукт SP-ODS-RPS, производимый DAISO Co. Ltd., продукт 5C18, производимый COSMOSYL Co. Ltd, продукт Хроматорекс (Chromatorex), производимый FUJI Co. Ltd и т.п.

В предпочтительном варианте реализации, в котором в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению применяют (i) обращенно-фазовую распределительную хроматографию, "подвижной фазой в вышеописанной (i) обращенно-фазовой распределительной хроматографии" может быть по меньшей мере один растворитель, выбранный из воды, ацетонитрила, низшего спирта, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д., тетрагидрофуран (ТГФ) или их смесь, предпочтительно вода, низший спирт, такой как метанол, этанол, бутанол и т.д. или их смесь, более предпочтительно смесь растворителя из воды и метанола, наиболее предпочтительно смесь растворителя из воды и метанола с градиентом от 90:10 (об./об.) до 60:40 (об./об.), для элюирования полярного вещества.

В предпочтительном варианте реализации, в котором в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению применяют (ii) нормально-фазовую распределительную хроматографию, "неподвижной фазой в вышеописанной нормально-фазовой распределительной хроматографии" может быть любая неподвижная фаза, такая как вещество с нормальной фазой, которое может удержать полярное вещество и при этом элюироваться неполярное вещество, предпочтительно силикагель, флюоросил или неподвижная фаза на основе окиси алюминия, неподвижная фаза на основе полимера с функциональной группой CN, диол или NH₂ и т.п., более предпочтительно силикагель, флюоросил или неподвижная фаза на основе окиси алюминия и т.д.

В предпочтительном варианте реализации, в котором в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению применяют (ii) нормально-фазовую распределительную хроматографию, "подвижной фазой в вышеописанной (ii) нормально-фазовой распределительной хроматографии" может быть по меньшей мере один растворитель, выбранный из гексана, гептана, этилацетата, этанола, диэтилового эфира, 2-пропанола или их смеси, предпочтительно гексан, гептан, этилацетат или их смесь, для элюирования неполярного вещества.

В предпочтительном варианте реализации, в котором в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению применяют (iii) ионообменную хроматографию, "неподвижной фазой в вышеописанной (iii) ионообменной хроматографии" может быть любая высокомолекулярная неподвижная фаза, такая как неподвижная фаза, которая имеет заряженный мостиковый фрагмент, предпочтительно катионообменная смола, анионообменная смола или синтетический адсорбент и т.п., более предпочтительно сильнокислая катионообменная смола, такая как AG 50W-x8, Amberlite IR-120, Dowex 60W-x8, SKIB и т.д., слабокислая катионообменная смола, такая как Amberlite IRA-67, Dowex 3-х4А и т.д., сильно основная катионообменная смола, такая как DIAION SKIB, DIAION PK216, DIAION CR20, DIAION UBK555 (Mitsubishi Chemical Co.), TRILITE SPC 160H, TRILITE SPC 180H, TRILITE SPC 400JH (Samyang Co. Ltd.), AMBERLITE 200C Na, AMBERLITE CG50, AMBERLITE CR1310 Na, AMBERJET 200H, AMBERLYST 131 WET, ALBERLYST 232 WET (ROHM and HAAS Co. Ltd.), Lewatit VP OC 1800, Lewatit VP OC 1812, Lewatit MDS1368 Na, Lewaitit K1221 (Bayer Co. Ltd.), PUROLITE PCR833CA, PUROLITE С145 (Purolite Co. Ltd.), MFG210, MFG 250 (Finex Co. Ltd.) и т.д.; сильно основная анионообменная смола, такая как SA11A, SA20A, SA21A т.д.; или CaptoQ (GE Healthcare Co. Ltd.), или смола, имеющая аналогичное свойство указанной, такая как Toyopearl QEA (Tosoh Co. Ltd.), Q сефароза FF (GE Healthcare Co. Ltd.), Fractogel EMD, Fractogel TMAE, Fractogel HICAP (Merck KGaA Co. Ltd or Darmstadt Co. Ltd.); наиболее предпочтительно, SA21A; адсорбент, такой как SP207, HP20SS, HP20 и т.д., более предпочтительно HP 20.

В предпочтительном варианте реализации, в котором в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему изобретению применяют (iv) гель-хроматографию, "неподвижной фазой в вышеописанной (iv) гель-хроматографии" может быть любая гелевая неподвижная фаза, такая как неподвижная фаза, которая может разделять молекулы образца по размеру, предпочтительно, гель на основе декстрана, такой как сефадекс (например, сефадекс G-25), гель на основе полиакриламида, такой как сефакрил (например, сефакрил S400), гель на основе агарозы, такой как супероза или сефароза (например, сефароза CL-4B) или их комбинации, такие как комбинация супердекса 200 с декстраном (например, Сефадекс™) или сшитый агарозный гель (Супероза™) и т.п., однако, не ограничивается перечисленными. "Подвижной фазой в вышеописанной (iv) гель-хроматографии" может быть буферный раствор, выбранный из группы, состоящей из натрий-ацетатного буфера, натрий-фосфатного буфера, аммоний-ацетатного буфера, MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота, Бис-Трис[2-Бис(2-гидроксиэтил)амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол], ADA [N-(2-ацетамидо)иминодиацетат)], PIPES [пиперазин-N,N′-Бис(2-этансульфоновая кислота)], BES [N,N′-Бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота), MOPS [3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота)], TES (N-Трис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтансульфоновая кислота], HEPES [N-2-гидроксиэтил-пиперазин-N′-2-этансульфоновая кислота)], и т.п.; предпочтительно натрий-ацетатный буфер, натрий-фосфатный буфер или аммоний-ацетатный буфер.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения может также применяться (v) гель-проникающая хроматография или гель-фильтрационная хроматография в дополнении к (i) обращенно-фазовой распределительной хроматографии, (ii) нормально-фазовой распределительной хроматографии, (iii) ионообменной хроматографии, (iv) гель-хроматографии или их комбинации, в качестве дополнительного способа очистки согласно настоящему описанию.

Согласно настоящему изобретению предложен новый очищенный экстракт, такой как (a) очищенный экстракт, фракционированный с помощью бутанола (обозначенный как "ATC1" в дальнейшем) или (b) экстракт, очищенный с помощью вторичного фракционирования (обозначенный как "ATC2" в дальнейшем), полученный вышеописанными способами получения.

Согласно настоящему изобретению также предложен новый очищенный экстракт, фракционированный с помощью бутанола (ATC1), из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, полученный вышеописанными способами получения, который содержит 12,3-47% (масс./масс.) производных каталпола в общем экстракте (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, при этом указанные производные каталпозида состоят из 15-50% (масс./масс.) верпрозида, 0,3-10% (масс./масс.) вератровой кислоты, 0,5-10% (масс./масс.) каталпозида, 0,3-10% (масс./масс.) пикрозида II, 0,3-10% (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 0,3-10% (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола, предпочтительно 20-25% (масс./масс.) верпрозида, 0,5-5% (масс./масс.) вератровой кислоты, 1-5% (масс./масс.) каталпозида, 0,5-5% (масс./масс.) пикрозида II, 0,5-5% (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 1-5% (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола в расчете на массу общего экстракта (100%) Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.

Согласно настоящему изобретению также предложен новый очищенный экстракт, фракционированный с помощью бутанола (ATC1), из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, полученный вышеописанными способами получения, при этом массовое соотношение (масс./масс.) производных каталпозида в экстракте является следующим: 15,0-18,0 частей (масс./масс.) верпрозида, 2,10-2,60 частей (масс./масс.) каталпозида, 1 часть (масс./масс.) пикрозида II, 1,00-1,30 частей (масс./масс.) изованиллоил каталпола и 2,00-2,30 частей (масс./масс.) 6-O-вератроил каталпола, предпочтительно 16,0-17,0 частей (масс./масс.) верпрозида, 2,20-2,50 частей (масс./масс.) каталпозида, 1 часть (масс./масс.) пикрозида II, 1,10-1,20 частей (масс./масс.) изованиллоил каталп