Антитела против tnf-α и их применения

Антитела против tnf-α и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

1. ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №61/170053, поданной 16 апреля 2009 года, содержание которой включено сюда посредством ссылки во всей ее полноте.

2. ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, одновременно поданный с настоящим документом, включен сюда посредством ссылки.

3. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам против TNF-α, фармацевтическим композициям, содержащим антитела против TNF-α, и терапевтическим применениям таких антител.

4. ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) представляет собой провоспалительный цитокин, который высвобождается клетками иммунной системы и взаимодействует с клетками иммунной системы. Было показано, что TNF-α подвергается позитивной регуляции при некоторых человеческих заболеваниях, включая хронические заболевания, такие как ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит и рассеянный склероз. Например, повышенные уровни TNF-α обнаруживаются в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом и играют важную роль как при патологическом воспалении, так и при разрушении суставов, что является признаками ревматоидного артрита.

Человеческий TNF-α представляет собой 17 кДа белок, и активная форма существует в виде гомотримера (Pennica et al., 1984, Nature 312:724-729; Davis et al., 1987, Biochemistry 26:1322-1326; Jones et al., 1989, Nature 338:225-228). TNF-α оказывает свои биологические эффекты путем взаимодействия с двумя структурно родственными, но функционально отличными рецепторами клеточной поверхности, р55 и р75, которые коэкспрессируются на большинстве типов клеток (Loetscher et al., 1990, Cell 61:351-9; Smith et al., 1990, Science 248(4958):1019-23). р55 также известен как p55R; p55TNFR; CD120a; TNFR I; TNFR I и TNFRSFIa. p75 также известен как p75R; p75TNFR; CD120b; TNFR II; TNFR 2 и TNFRSFIb. Оба рецептора также протеолитически высвобождаются в виде растворимых молекул, способных к связыванию TNF-α.

Ингибирование активности TNF-α как способ лечения заболевания, в частности ревматоидного артрита, было достигнуто несколькими разными способами с использованием ингибиторов, таких как антитела и растворимые рецепторы. Примеры включают этанерцепт, поставляемый на рынок Immunex Corporation как ENBREL®, который представляет собой рекомбинантный слитый белок, содержащий два домена растворимого TNF-рецептора p75, связанных с Fc-частью человеческого иммуноглобулина. Инфликсимаб, поставляемый на рынок Centocor Corporation как REMICADE®, представляет собой химерное антитело, имеющее мышиные вариабельные домены антитела против TNF-α и константные домены человеческого IgG₁. Другие ингибиторы включают полученные посредством генной инженерии молекулы TNF-α, которые образуют тримеры с нативным TNF-α и предотвращают связывание рецептора (Steed et al., 2003, Science 301:1895-1898; WO 03/033720; WO 01/64889). В этих современных способах ингибирования активности TNF-α блокируют связывание TNF-α и с р55, и с p75 рецепторами (смотрите, например, Mease, 2005, Expert Opin. Biol. Therapy 5(11):1491-1504). Адалимумаб, поставляемый на рынок Abbott Laboratories как HUMIRA®, представляет собой рекомбинантное, полностью человеческое антитело против TNF-α (Tussirot and Wendling, 2004, Expert Opin. Pharmacother. 5:581-594). Адалимумаб специфически связывается с TNF-α и блокирует его взаимодействие с рецепторами TNF-α клеточной поверхности р55 и p75. Адалимумаб также лизирует in vitro клетки, экспрессирующие TNF-α на поверхности, путем комплементзависимой цитотоксичности ("CDC") и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности ("ADCC"). Адалимумаб не связывается с лимфотоксином (TNF-p) или не инактивирует его. Адалимумаб также модулирует биологические ответы, которые индуцирует или регулирует TNF, включая изменения в уровнях молекул адгезии, ответственных за миграцию лейкоцитов (ELAM-1, VCAM-1 и 1САМ-1 с ИК₅₀ 1-2×10^-10 М).

Несмотря на то, что адалимумаб является человеческим антителом, он может вызывать иммунный ответ при введении людям. Такой иммунный ответ может приводить к клиренсу антител или фрагментов из кровообращения, опосредованному иммунным комплексом, и делает повторное введение неподходящим для терапии, тем самым уменьшая терапевтическую пользу для пациента и ограничивая повторное введение антитела.

Соответственно, существует потребность в предоставлении улучшенных антител против TNF-α или фрагментов, которые решают одну или более чем одну из этих проблем, например путем создания вариантов с более высокой аффинностью, чем адалимумаб, которые можно вводить при пониженных дозировках, или вариантов с пониженной иммуногенностью по сравнению с адалимумабом.

Цитирование или идентификация любой ссылки в разделе 4 или в любом другом разделе этой заявки не следует истолковывать как признание того, что такая ссылка подходит в качестве предшествующего уровня техники по отношению к настоящему описанию.

5. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к вариантам антитела против TNF-α D2E7 с улучшенным связыванием с TNF-α и/или с пониженной иммуногенностью по сравнению с D2E7. D2E7 имеет три CDR (гипервариабельный участок) тяжелой цепи, именуемые здесь (в порядке от амино- до карбоксильного конца) как CDR-H1 (SEQ ID NO:5), CDR-H2 (SEQ ID NO:6), и CDR-Н3 (SEQ ID NO:7), и три CDR легкой цепи, именуемые здесь (в порядке от амино- до карбоксильного конца) как CDR-L1 (SEQ ID NO:8), CDR-L2 (SEQ ID NO:9), и CDR-L3 (SEQ ID NO:10). Антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по описанию обычно имеют по меньшей мере одну аминокислотную замену в по меньшей мере одном CDR по сравнению с D2E7.

В определенных аспектах по меньшей мере одна аминокислотная замена или комбинация замен выбрана из Таблицы 11, Таблицы 12 и/или Таблицы 25. Дополнительные мутации (включая замены, делеции или вставки) могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 13-25.

В определенных аспектах настоящее изобретение относится к вариантам антитела против TNF-α D2E7 с улучшенными свойствами связывания, например улучшенной аффинностью по отношению к TNF-α по сравнению с D2E7. В определенных воплощениях антитела по изобретению имеют большую аффинность, чем D2E7 в отношении TNF-α, например, улучшенную K_D при измерении BIAcore и/или улучшенную аффинность при измерении конкурентным ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).

В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают по меньшей мере одну замену, выбранную из S3K в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), S3R в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), S3N в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4H в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4Q в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4V в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4F в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4W в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4Y в CDR-L2 (SEQ ID NO:9); L5R в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), L5K в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), Q6K в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), Q6R в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), D1G в CDR-H1 (SEQ ID NO:5), Y2H в CDR-H1 (SEQ ID NO:5); A3G в CDR-H1 (SEQ ID NO:5) и T3N в CDR-H2 (SEQ ID NO:6). Дополнительными мутациями, которые могут быть включены в вариант антител против TNF-α с улучшенной аффинностью и анти-TNF-α-связывающих фрагментов с улучшенной аффинностью, могут быть деиммунизирующие замены, такие как замены, описанные в Таблице 11, а также другие мутации, например замены, которые не нарушают способность антител против TNF-α и анти-TNF-α-связывающих фрагментов связываться с TNF-α, включая известные мутации, описанные в Таблицах 13-24, или мутации, описанные в Таблице 25, но не ограничиваясь ими.

В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают по меньшей мере одну замену, выбранную из T4F в CDR-L2, T4W в CDR-L2, T4Y в CDR-L2, L5R в CDR-L2, L5K в CDR-L2, Q6R в CDR-L2, Y2H в CDR-H1, A3G в CDR-H1 и T3N в CDR-H2. Дополнительные мутации или комбинации мутаций, которые могут быть включены в такие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11 и 13-25.

В определенных других аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают по меньшей мере одну замену, выбранную из T4F в CDR-L2, T4W в CDR-L2, T4Y в CDR-L2, L5R в CDR-L2, L5K в CDR-L2, Q6R в CDR-L2, Y2H в CDR-H1, A3G в CDR-H1 и T3N в CDR-H2. Дополнительные мутации или комбинации мутаций, которые могут быть включены в такие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11 и 13-18.

В других аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают замены G5S+A11S или G5S+A11G в CDR-L1. Дополнительные мутации или комбинации мутаций, которые могут быть включены в такие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11-25.

В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают замены, выбранные из S3N в CDR-L2, T4V в CDR-L2, Q6K в CDR-L2 и D1G в CDR-H1, в комбинации с по меньшей мере одной заменой, выбранной из Таблиц 11, 12 и 25. Дополнительные мутации или комбинации мутаций, которые могут быть включены в такие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11-24.

В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают замены, выбранные из S3N в CDR-L2, T4V в CDR-L2, Q6K в CDR-L2 и D1G в CDR-H1, в комбинации по меньшей мере с одной заменой, выбранной из S3K в CDR-L2, S3R в CDR-L2, Т4Н в CDR-L2, T4Q в CDR-L2, T4F в CDR-L2, T4W в CDR-L2, T4Y в CDR-L2, L5R в CDR-L2, L5K в CDR-L2, Q6R в CDR-L2, Y2H в CDR-H1, A3G в CDR-H1, и T3N в CDR-H2.

В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают комбинации замен, выбранные из по меньшей мере одной из S3K, Т4Н, L5R и Q6R; S3K, T4Q, L5R и Q6K; S3K, T4Y и L5K; S3K и T4Y; S3N, T4V, L5R и Q6K; S3N, T4W, L5R и Q6R; S3R, T4F и L5R; S3R, T4F, L5R и Q6R; S3R, Т4Н и Q6K; S3R, T4W, L5K и Q6R; Т4Н, L5K и Q6K; Т4Н, L5K и Q6R; T4W, L5R и Q6R; и T4Y и L5R в CDR-L2, где шесть CDR в совокупности имеют вплоть до 17 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR антитела D2E7. Антитела против TNF-α или анти-TNF-α-связывающие фрагменты возможно включают одну или более чем одну дополнительную мутацию или одну или более чем одну дополнительную комбинацию мутаций, которые могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11-24.

В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают одну или более чем одну замену или одну или более чем одну комбинацию замен, выбранные из S3K, S3R, S3N, T4F, T4W, T4Y, Т4Н, T4Q, T4V, L5R, L5K, Q6R и Q6K в CDR-L2. Дополнительные мутации или комбинации мутаций, которые могут быть включены в такие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11-24.

В других аспектах настоящее изобретение относится к вариантам антитела против TNF-α D2E7 с пониженной иммуногенностью по сравнению с D2E7. В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают по меньшей мере одну замену или по меньшей мере одну комбинацию замен в CDR-L1 (SEQ ID NO:8), выбранную из R7Q; A11S; R7Q+A11S; N8T; N8T+A11S; I6T; A11G; I6T+A11G; Q4G; Q4G+A11S; Q4G+A11G; Q4H; Q4H+A11S; Q4R; Q4R+A11S; G5S; G5S+A11S; N8S+A11S; I6T+A11S; и N8T+AUG. Дополнительные мутации, которые могут быть включены в антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты с пониженной антигенностью, включают замены, которые улучшают свойства связывания с TNF-α, такие как мутации, описанные в Таблице 12 и/или Таблице 25, а также другие мутации, например замены, которые не нарушают способность антител против TNF-α и анти-TNF-α-связывающих фрагментов связываться с TNF-α, включая известные мутации, описанные в Таблицах 13-25, но не ограничиваясь ими.

В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по изобретению имеют последовательности VH и VL, имеющие 80%-99% идентичности последовательности с последовательностями VH и VL D2E7 и включают по меньшей мере одну аминокислотную замену в по меньшей мере одном CDR по сравнению с D2E7. В конкретных воплощениях процент идентичности последовательности для тяжелой цепи и легкой цепи по сравнению с последовательностями VH и VL D2E7 в каждом случае независимо выбран из по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности последовательности.

В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по изобретению имеют вплоть до 17 аминокислотных замен в их CDR по сравнению с CDR D2E7. Варианты антител с 17 аминокислотными заменами, которые сохраняют свою способность к связыванию мишени, были описаны Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-14. Антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по изобретению также могут иметь вплоть до 16, вплоть до 15, вплоть до 14, вплоть до 13, вплоть до 12, вплоть до 11, вплоть до 10, вплоть до 9, вплоть до 8, вплоть до 7, вплоть до 6, вплоть до 5 или вплоть до 4 аминокислотных замен в их CDR по сравнению с последовательностями CDR антитела D2E7.

В конкретных воплощениях антитело против TNF-α или анти-TNF-α-связывающий фрагмент по изобретению независимо имеют:

- вплоть до одной или вплоть до двух, или вплоть до трех замен в CDR-Н1 по сравнению с соответствующим CDR D2E7;

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех, вплоть до четырех, вплоть до пяти или вплоть до шести замен в CDR-H2 по сравнению с соответствующим CDR D2E7;

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех, вплоть до четырех или вплоть до пяти замен в CDR-H3 по сравнению с соответствующим CDR D2E7;

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех или вплоть до четырех замен в CDR-L1 по сравнению с соответствующим CDR D2E7;

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех или вплоть до четырех замен в CDR-L2 по сравнению с соответствующим CDR D2E7; и

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех или вплоть до четырех замен в CDR-L3 по сравнению с соответствующим CDR D2E7.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены фармацевтические композиции, содержащие модифицированные антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, имеющие повышенную аффинность к TNF-α и/или пониженную иммуногенность по сравнению с D2E7.

В определенных аспектах антитело против TNF-α или анти-TNF-α-связывающий фрагмент по изобретению могут представлять собой биспецифичное антитело или TNF-α-связывающий фрагмент биспецифичного антитела. Биспецифичное антитело может быть специфичным к TNF-α и другому провоспалительному цитокину (такому как, например, лимфотоксин, интерферон-γ или интерлейкин-1).

Здесь предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по изобретению, также как и векторы, содержащие нуклеиновые кислоты. Дополнительно, здесь предложены прокариотические и эукариотические клетки-хозяева, трансформированные вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело против TNF-α или анти-TNF-α-связывающий фрагмент, а также эукариотические (такие как клетки млекопитающих) клетки-хозяева, сконструированные для экспрессии нуклеотидных последовательностей. Также предложены способы получения антител против TNF-α и анти-TNF-α-связывающих фрагментов путем культивирования клеток-хозяев.

Антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по изобретению являются полезными при лечении иммунных расстройств, например системной красной волчанки, ревматоидного артрита, тиреоидита, болезни «трансплантат против хозяина», склеродермии, сахарного диабета, болезни Грейвса, саркоидоза, хронического воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита или болезни Крона.

Следует отметить, что неопределенные артикли «а» и «an» и определенный артикль «the» используются в настоящей заявке, как обычно в заявках на патент, для обозначения одного или более чем одного, если контекст ясно не диктует иное. Далее, термин «или» используются в настоящей заявке, как обычно в заявках на патент, для обозначения разделительного «или» или соединительного «и».

Все публикации, упомянутые в этом описании, являются включенными сюда посредством ссылки. Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, статей или тому подобного, которые были включены в это описание изобретения, приведено исключительно в целях предоставления контекста для настоящего изобретения. Не следует принимать как допущение, что любой или все из этих объектов образуют часть основы уровня техники или были обычными общедоступными сведениями в области, имеющей отношение к настоящему описанию, как оно существовало где угодно до даты приоритета настоящей заявки.

Признаки и преимущества изобретения станут еще более очевидными из следующего подробного описания его воплощений.

6. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ТАБЛИЦ И ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Таблица 1 показывает пептиды VH D2E7 и пептиды VL D2E7, соответственно, которые тестировали на иммуногенность.

Таблица 2 показывает идентифицированные области эпитопов CD4+ Т-клеток в D2E7. Участки CDR подчеркнуты.

Таблица 3 показывает ассоциации HLA (главный комплекс гистосовместимости человека) класса II и относительный риск ответа на пептидные эпитопы области VL D2E7.

Таблица 4 показывает последовательности вариантов эпитопов CDR1 VL D2E7. Всего тестировали 99 доноров. Число респондеров, процент респондеров и средний индекс стимуляции показаны для каждого протестированного пептида.

Таблица 5 показывает мутации-кандидаты в CDR-L1 для снижения иммуногенности D2E7. Нумерация аминокислот в Таблице 5 соответствует положениям в контексте легкой цепи D2E7.

Таблица 6 показывает результаты BIAcore и EL1SA для замен в CDR-L1, которые не приводят к значительному ослаблению связывания по сравнению D2E7. Нумерация аминокислот в Таблице 6 соответствует положениям в контексте легкой цепи D2E7. Улучшение K_D (измеренной BIAcore) и ИК₅₀ связывания (измеренной ELISA) показано посредством "WT/x". CV% относится к стандартному отклонению как доле в процентах от величины общего значения.

Таблица 7 показывает результаты анализа Т-клеток для всех одиночных и двойных мутаций эпитопа D2E7. Пептид 1 представляет собой родительский пептид. Модификации родительского пептида выделены жирным шрифтом.

Таблица 8 показывает предпочтительные варианты пептидов эпитопов, основанные только на результатах анализа Т-клеток. Нумерация аминокислот в Таблице 8 соответствует положениям в контексте легкой цепи D2E7.

Таблица 9 показывает антипролиферативную биоактивность антител, сконструированных так, чтобы они содержали предпочтительные варианты пептидов эпитопов. Родительским является немодифицированное антитело D2E7. Нумерация аминокислот в Таблице 9 соответствует положениям в контексте легкой цепи D2E7.

Таблица 10 показывает кинетику связывания D2E7 и вариантов D2E7 против TNF-α, проанализированную BIAcore. Нумерация аминокислот в Таблице 10 соответствует положениям в контексте легкой цепи D2E7.

Таблица 11 показывает замены CDR-L1 или комбинации замен, которые могут быть включены в антитела, родственные D2E7, для снижения их иммуногенности.

Таблица 12 показывает аминокислотные замены CDR вне CDR-L1, приводящие к улучшенной K_D (проанализированной BIAcore), аффинности (измеренной ELISA) или им обеим по сравнению с D2E7. Нумерация аминокислот в Таблице 12 соответствует положениям в контексте легкой и тяжелой цепей D2E7. Улучшение K_D (измеренной BIAcore) и ИК₅₀ связывания (измеренной ELISA) показано посредством "WTx". CV% относится к стандартному отклонению как доле в процентах от величины общего значения, и «НС» обозначает «не сделано».

Таблица 13 показывает известные мутации в CDR-H1, которые могут быть включены в антитела по изобретению.

Таблица 14 показывает известные мутации в CDR-H2, которые могут быть включены в антитела по изобретению. Включение 2 аминокислот в одну ячейку указывает на вариант CDR, который включает добавление к CDR или вставку в CDR. Штриховка ячейки указывает на вариант CDR, который не имеет заштрихованных аминокислотных остатков.

Таблица 15 показывает известные мутации в CDR-H3, которые могут быть включены в антитела по изобретению.

Таблица 16 показывает известные мутации в CDR-L1, которые могут быть включены в антитела по изобретению. Включение 2 аминокислот в одну ячейку указывает на вариант CDR, который включает добавление к CDR или вставку в CDR.

Таблица 17 показывает известные мутации в CDR-L2, которые могут быть включены в антитела по изобретению. Включение 2 аминокислот в одну ячейку указывает на вариант CDR, который включает указанную дополнительную N-концевую аминокислоту в CDR.

Таблица 18 показывает известные мутации в CDR-L3, которые могут быть включены в антитела по изобретению. Включение 2 аминокислот в одну ячейку указывает на вариант CDR, который включает указанную дополнительную N-концевую аминокислоту в CDR.

Таблица 19 показывает дополнительные известные мутации в CDR-H1, которые могут быть включены в антитела по изобретению.

Таблица 20 показывает дополнительные известные мутации в CDR-H2, которые могут быть включены в антитела по изобретению.

Таблица 21 показывает дополнительные известные мутации в CDR-H3, которые могут быть включены в антитела по изобретению.

Таблица 22 показывает дополнительные известные мутации в CDR-L1, которые могут быть включены в антитела по изобретению.

Таблица 23 показывает дополнительные известные мутации в CDR-L2, которые могут быть включены в антитела по изобретению.

Таблица 24 показывает дополнительные известные мутации в CDR-L3, которые могут быть включены в антитела по изобретению.

Таблица 25 показывает комбинации точечных мутаций в CDR-L2, приводящие к улучшению K_D (проанализированной BIAcore), аффинности (измеренной ELISA) или обоих показателей по сравнению с D2E7. Точечные мутации можно включать в антитела по изобретению поодиночке или в комбинации.

Фиг.1А-1Д. Фиг.1А показывает аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей D2E7 с областями CDR, выделенными жирным, подчеркнутым текстом. Фиг.1Б показывает последовательности CDR и соответствующие идентификаторы последовательностей D2E7. Фиг.1 В показывает таблицу соответствия между нумерацией CDR тяжелой цепи и нумерацией тяжелой цепи по Kabat. Фиг.1Г показывает таблицу соответствия между нумерацией CDR легкой цепи и нумерацией легкой цепи по Kabat. Фиг.1Д показывает нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей D2E7 (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3 соответственно), как опубликовано в патенте США №6090382.

Фиг.2 показывает процент ответов (внизу) и средние индексы стимуляции (наверху) пептидов VL D2E7.

Фиг.3 показывает средние индексы стимуляции (наверху) и процент ответов (внизу) на пептиды VH D2E7. Пептид №27 имел аномальный индекс стимуляции у одного донора и показан более темной штриховкой.

Фиг.4 показывает пептидные варианты эпитопа CDR1 VL D2E7. Незакрашенные значки показывают многочисленные повторные анализы немодифицированного родительского пептида в пределах набора данных. Закрашенные значки представляют уникальные пептидные варианты по аланиновому сканированию. Указана последовательность вариантов, индуцирующих наиболее сниженный ответ.

Фиг.5 показывает пептидные варианты эпитопа CDR1 VL D2E7. Незакрашенные значки показывают многочисленные повторные анализы немодифицированного родительского пептида в пределах набора данных. Закрашенные значки представляют уникальные пептидные варианты. Варианты, индуцирующие наиболее сниженный ответ, показаны кружком. Фиг.5 графически представляет данные из Таблицы 7.

Фиг.6 показывает результаты конкурентного ELISA вариантов антитела D2E7. Планшеты ELISA покрывали TNF-α. Биотинилированное D2E7 включали во все лунки в единственной концентрации и вариант антитела титровали в них. Значения HKso рассчитывали для каждого антитела. Эксперимент проводили три раза. Ось Y показывает средние результаты как процент связывания родительского антитела.

7. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

7.1 АНТИТЕЛА ПРОТИВ TNF-α

Согласно настоящему изобретению предложены антитела против TNF-α. Если не указано иное, термин «антитело» (Ab) относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывается с конкретным антигеном или является иммунологически реакционноспособной в отношении конкретного антигена и включает поликлональные, моноклональные, сконструированные посредством генной инженерии и иным способом модифицированные формы антител, включая химерные антитела, гуманизированные антитела, гетероконъюгатные антитела (например биспецифические антитела, диатела, триатела и тетратела), и антигенсвязывающие фрагменты антител, включая, например, фрагменты Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, rIgG и scFv, но не ограничиваясь ими. Кроме того, если не указано иное, подразумевается, что термин «моноклональное антитело» (mAb) включает как интактные молекулы, так и фрагменты антитела (такие как, например, фрагменты Fab и F(ab')₂), которые способны специфически связываться с белком. Фрагменты Fab и F(ab')₂ не имеют фрагмента Fc интактного антитела, быстрее выводятся из кровообращения животного или из растения и могут иметь меньшее неспецифичное связывание в ткани, чем интактное антитело (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316).

Термин «scFv» относится к одноцепочечному Fv антителу, в котором вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи от традиционного антитела были соединены с образованием одной цепи.

Ссылки на "VH" относятся к вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина антитела, включая тяжелую цепь Fv, scFv или Fab. Ссылки на "VL" относятся к вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, включая легкую цепь Fv, scFv, dsFv или Fab. Антитела (Ab) и иммуноглобулины (Ig) представляют собой гликопротеины, имеющие такие же структурные характеристики. В то время как антитела демонстрируют специфичность связывания в отношении специфической мишени, иммуноглобулины включают как антитела, так и другие антителоподобные молекулы, которые не имеют специфичности в отношении мишени. Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Дальтон, составленные из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая тяжелая цепь имеет на амино конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд рядом константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на амино конце (VL) и константный домен на карбокси конце.

Антитела против TNF-α по изобретению связываются с человеческим TNF-α и ингибируют активность рецептора TNF-α в клетке. Не будучи связанными какой-либо теорией, авторы изобретения считают, что данные антитела уменьшают связывание TNF-α как с низкоаффинным рецептором TNF-α (р75), так и с высокоаффинным рецептором TNF-α (р55).

Антитела против TNF-α по изобретению содержат области, определяющие комплементарность, (CDR), которые являются родственными CDR антитела D2E7 (также известного как адалимумаб или HUMIRA®) по последовательности.

CDR также известны как гипервариабельные участки в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасом (FR). Как известно в данной области, положение аминокислоты/граница, очерчивающая гипервариабельный участок антитела, может варьировать, в зависимости от контекста и разных определений, известных в данной области. Некоторые положения в пределах вариабельного домена можно рассматривать как гибридные гипервариабельные положения из-за того, что эти положения могут считаться находящимися в пределах гипервариабельной области при одном наборе критериев, при этом считаясь находящимися вне гипервариабельной области при другом наборе критериев. Одно или более чем одно из этих положений также может находиться в расширенных гипервариабельных областях. Согласно описанию предложены антитела, содержащие модификации в этих гибридных гипервариабельных положениях. Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелой и легкой цепей содержат четыре FR области, главным образом, вследствие принятия конфигурации β-листа, соединенные тремя CDR, которые образуют петли, соединяющие структуру β-листа (и в некоторых случаях образующие ее часть). CDR в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости посредством FR областей в порядке FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 и с CDR из другой цепи, способствуя образованию сайта связывания мишени антител (смотрите Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987)). Нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулинов, как она используется здесь, осуществляется согласно системе нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулинов Kabat et al., если не указано иное.

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи D2E7 представлены SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, соответственно, и кодируются SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3, соответственно. Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи также показаны на Фиг.1А. Последовательности CDR D2E7 и их соответствующие идентификаторы представлены на Фиг.1Б. Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи D2E7 (как опубликовано в патенте США №6090382) показаны на Фиг.1В. Любые нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, можно использовать в композициях и способах по настоящему изобретению.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены фрагменты антител против TNF-α, содержащие последовательности CDR, которые являются родственными последовательностям CDR D2E7. Термин «фрагмент антитела» относится к части полноразмерного антитела, обычно к области, связывающей мишень, или к вариабельной области. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv. Фрагмент "Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания мишени. Эта область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной, нековалентной ассоциации (димер VH-VL). Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя сайт связывания мишени на поверхности димера VH-VL. Часто шесть CDR придают антителу специфичность связывания в отношении мишени. Однако в некоторых случаях даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичные в отношении мишени) может иметь способность распознавать и связывать мишень. Фрагменты антитела «одноцепочечный Fv» или «scFv» содержат домены VH и VL антитела в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменом VH и VL, который обеспечивает образование scFv желательной структуры для связывания мишени. «Однодоменные антитела» состоят из одиночных доменов VH или VL, которые демонстрируют достаточную аффинность в отношении TNF-α. В конкретном воплощении однодоменное антитело представляет собой антитело представителей сем. Верблюдовые (смотрите, например, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).

Фрагмент Fab - содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH₁) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена CH₁ тяжелой цепи, включая один или более чем один цистеин из шарнирной области антитела. Фрагменты F(ab') продуцируются расщеплением дисульфидной связи между цистеинами шарнирной области F(ab')₂-продукта расщепления пепсином. Дополнительные химические связи фрагментов антител известны специалистам в данной области.

В определенных воплощениях антитела против TNF-α по изобретению представляют собой моноклональные антитела. Термин «моноклональное антитело», как он здесь используется, не ограничен антителами, продуцируемыми посредством гибридомной технологии. Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, которое происходит из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу, посредством которого оно продуцируется. Моноклональные антитела, полезные в связи с настоящим изобретением, могут быть получены с использованием целого ряда методик, известных в данной области, включая использование гибридомных, рекомбинантных технологий и технологий фагового дисплея или их комбинаций. Антитела против TNF-α по изобретению включают химерные, приматизированные, гуманизированные или человеческие антитела.

Антитела против TNF-α по изобретению могут быть химерными антителами. Термин «химерное» антитело, как он используется здесь, относится к антителу, имеющему вариабельные последовательности, происходящие из нечеловеческого иммуноглобулина, такого как крысиное или мышиное антитело, и константные области человеческого иммуноглобулина, типично выбранные из матрицы (template) человеческих иммуноглобулинов. Способы продукции химерных антител известны в данной области. Смотрите, например, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; патенты США №5807715, 4816567 и 4816397, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.

Антитела против TNF-α по изобретению могут быть гуманизированными. «Гуманизированные» формы нечеловеческих (например мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие связывающие мишень субдомены антител), которые содержат минимальные последовательности, происходящие из нечеловеческого иммуноглобулина. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из участков CDR соответствуют участкам CDR нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все из областей FR представляют собой области FR с последовательностью человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), типично часть консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Способы гуманизации антител известны в данной области. Смотрите, например, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; патенты США №:5530101, 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, выданные Queen et al.; EP 239400; публикация РСТ WO 91/09967; патент США №5225539; ЕР592106; ЕР 519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka etal., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; и патент США №5565332, которые все тем самым включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.

Антитела против TNF-α по изобретению могут быть человеческими антителами. Полностью «человеческие» антитела против TNF-α могут быть желательными для терапевтического лечения пациентов-людей. Термин «человеческие антитела», как он здесь используется, включает антитела, имеющие аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и включает антитела, выделенные из библиотек человеческих иммуноглобулинов или из животных, трансгенных в отношении одного или более чем одного человеческого иммуноглобулина, и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины. Человеческие антитела можно сделать рядом способов, известных в данной области, включая способы фагового дисплея с использованием библиотек антител, происходящих из последовательностей человеческого иммуноглобулина. Смотрите патенты США №4444887 и 4716111; и публикации РСТ WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741, каждая из которых включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте. Человеческие антитела также можно получить с использованием трансгенных мышей, которые не способны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены человеческих иммуноглобулинов. Смотрите, например, публикации РСТ WO 98/24893, WO 92/01047, WO 96/34096, WO 96/33735; патенты США №5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318, 5885793, 5916771 и 5939598, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте. Кроме того, у компаний, таких как Medarex (Princeton, NJ), Astellas Pharma (Deerfield, IL), Amgen (Thousand Oaks, CA) и Regeneron (Tarrytown, NY) можно заказать производство человеческих антител, направленных против выбранного антигена, с использованием технологии, аналогичной технологии, описанной выше. Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, можно получать с использованием методики, называемой «направляемая (guided) селекция». В этом подходе выбранное нечеловеческое моноклональное антитело, например мышиное антитело, используют для направления селекции полностью человеческого антитела, распознающего тот же самый эпитоп (Jespers etal., 1988, Biotechnology 12:899-903).

Антитела против TNF-α по изобретению могут быть приматизированными. Термин «приматизированное антитело» относится к антителу, содержащему обезьяньи вариабельные области и человеческие константные области. Способы продукции приматизированных антител известны в данной области. Смотрите, например, патенты США №5658570, 5681722 и 5693780, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.

Антитела против TNF-α по изобретению могут быть биспецифичными антителами. Биспецифичные антитела являются моноклональными, часто человеческими или гуманизированными антителами, которые обладают специфичностью связывания в отношении по мень