Способ получения химического вещества

Способ получения химического вещества

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения химического вещества путем непрерывной ферментации с использованием исходного сырья для ферментации, содержащего гексозу и пентозу.

Уровень техники

Поскольку актуальными являются проблема выбросов диоксида углерода в атмосферу и энергетическая проблема, то все большее внимание привлекают получаемые из биомассы химические вещества, представленные биоразлагаемыми полимерными материалами, такими как молочная кислота, и биотопливами, такими как этанол, так как эти вещества характеризуются устойчивым потреблением и обладают определенным эксплуатационным ресурсом (LCA). Указанные биоразлагаемые полимерные материалы и биотопливо обычно получают из микроорганизмов как продукты ферментации с использованием глюкозы, представляющей собой гексозу, в качестве исходного сырья для ферментации, которую выделяют из пригодной в пищу биомассы, такой как кукуруза. Однако использование пригодной в пищу биомассы вызывает рост ее стоимости из-за конкуренции с пищевыми продуктами, что приводит к нестабильному поступлению исходного сырья. В связи с этим предпринимались попытки использовать сахара, выделяемые из не пригодной в пищу биомассы, такой как рисовая солома, в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами (см. патентный документ 1).

В тех случаях, когда в качестве исходного сырья для

ферментации используют сахар, выделенный из не пригодной в пищу биомассы, целлюлоза, гемицеллюлоза и т.п., содержащиеся в не пригодной в пищу биомассе, разлагаются на сахара под действием осахаривающего фермента. В этом способе получают не только гексозы, такие как глюкоза, но и пентозы, такие как ксилоза и, таким образом, если в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами используют сахар, полученный из не пригодной в пищу биомассы, то в качестве исходного сырья для ферментации используют смешанные сахара гексоз и пентоз (см. патентный документ 1). В тех случаях, когда используют смешанные сахара пентоз и гексоз, необходимо использовать микроорганизмы, имеющие не только метаболический путь для гексоз, но и метаболический путь для пентоз. В качестве метаболического пути для пентоз известен метаболический путь с использованием редуктазы пентозы и пентолдегидрогеназы, и известно, что в данном метаболическом пути на первой стадии редуктаза пентозы действует на гексозу с образованием пентола, а затем на второй стадии пентолдегидрогеназа действует на пентол. Однако пентол, образующийся на первой стадии, не попадает на метаболический путь второй и последующих стадий, а накапливается в культуральной жидкости, что приводит к низкому выходу, вызывая проблемы.

В качестве способа ферментации, где в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами используют сахар, который получают из не пригодной в пищу биомассы и который представляет собой смешанные сахара гексоз и пентоз, может быть применена непрерывная ферментация, однако выход ферментации, который на самом деле достигается при непрерывной ферментации, не исследовался (см. патентный документ 1). С другой стороны, как известно из области техники, в том случае, когда проводят непрерывную ферментацию с использованием в качестве сырья для ферментации смеси сахаров гексоз и пентоз, ферментативный выход ниже, чем в случае периодической ферментации (см. внепатентный документ 1).

Таким образом, в соответствии с обычными технологическими принципами, ранее полагали, что для улучшения выхода ферментации при проведении непрерывной ферментации, когда смесь сахаров гексоз и пентоз используют в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами, имеющими метаболический путь пентозы, в котором используется редуктаза пентоз и пентолдегидрогеназа, то требуется улучшить метаболический путь ксилозы путем введения мутации или путем введения гена.

Документы, известные из области техники

Патентный документ

Патентный документ 1: WO 2010/067785

Непатентный документ

Непатентный документ 1: Susan T. Toon et al., Enhanced Cofermentation of Glucose and Xylose by Recombinant Saccharomyces Yeast Strains in Batch and Continuous Operating Modes, Applied Biochemistry and Biotechnology, (1997), 63-65, 243-255.

Сущность изобретения

Проблемы, которые решает настоящее изобретение

Настоящее изобретение направлено на повышение выхода ферментации при проведении ферментации с использованием смеси сахаров гексоз и пентоз в качестве сырья для ферментации микроорганизмами, имеющими метаболический путь пентоз, в котором используется редуктаза пентоз и пентолдегидрогеназа.

Средства для решения указанных проблем

В результате интенсивных исследований данной проблемы, авторы настоящего изобретения решили проблему путем проведения непрерывной ферментации, используя в качестве сырья для ферментации сырье, содержащее гексозу и пентозу и применяя разделительную мембрану, когда используют микроорганизм, имеющий редуктазу пентоз и пентолдегидрогеназу, с тем, чтобы повысить выход из смеси сахаров гексоз и пентоз, и таким образом было осуществлено настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение описывается приведенными ниже пунктами с (1) по (7).

(1) Способ получения химического вещества путем непрерывной ферментации, при этом указанный способ включает фильтрацию культуральной жидкости микроорганизма(ов) через разделительную мембрану; сохранение не прошедшей через фильтр жидкости в культуральной жидкости или возврат обратным потоком не прошедшей через фильтр жидкости в культуральную жидкость; добавление исходного сырья для ферментации в культуральную жидкость; и извлечение продукта из фильтрата; где указанное исходное сырье для ферментации содержит пентозу и гексозу и где указанный(ые) микроорганизм(ы) представляет(ют) собой микроорганизм(ы), имеющий(ие) метаболический путь, в котором для метаболизма пентозы используется редуктаза пентозы и пентолдегидрогеназа.

(2) Способ получения химического вещества в соответствии с пунктом (1), который включает осуществление непрерывной ферментации в условиях, когда коэффициент переноса кислорода (KLa) равняется от 5 до 300 час^-1.

(3) Способ получения химического вещества в соответствии с пунктом (1) или (2), где отношение пентозы к гексозе, которые содержатся в указанном сырье для ферментации, составляет от 1:9 до 9:1.

(4) Способ получения химического вещества в соответствии с пунктом (1) или (2), где указанное сырье для ферментации представляет собой сахарный сироп, полученный из биомассы.

(5) Способ получения химического вещества в соответствии с любым из пунктов с (1) по (4), где указанной пентозой является ксилоза.

(6) Способ получения химического вещества в соответствии с любым из пунктов с (1) по (5), где указанной редуктазой пентозы является редуктаза ксилозы.

(7) Способ получения химического вещества в соответствии с любым из пунктов с (1) по (6), где указанной пентолдегидрогеназой является дегидрогеназа ксилита.

Полезность изобретения

Применение настоящего изобретения позволяет значительно повысить эффективность и выход при ферментативном получении различных химических веществ с использованием сырья для ферментации, содержащего гексозу и пентозу, с помощью микроорганизмов, имеющих редуктазу пентозы и дегидрогеназу пентозы.

Наилучший вариант осуществления настоящего изобретения

Способ получения химического вещества по настоящему изобретению отличается тем, что указанный способ представляет собой непрерывный способ ферментации, в котором используют исходное сырье для ферментации, содержащее смешанные сахара пентоз и гексоз, при культивировании микроорганизма(ов), имеющего(их) редуктазу пентоз и дегидрогеназу пентоз; культуральную жидкость фильтруют через разделительную мембрану; не прошедшую через фильтр жидкость сохраняют в культуральной жидкости или обратным потоком возвращают в культуральную жидкость; добавляют исходное сырье для ферментации в культуральную жидкость; и продукт извлекают из фильтрата.

Пятиуглеродный сахар, также называемый пентозой, содержит 5 атомов углерода, которые составляют сахар. Пентозу можно подразделить на альдопентозу, которая имеет альдегидную группу в 1-й позиции, и кетопентозу, которая имеет кетонную группы во 2-й позиции. Примеры альдопентозы включают ксилозу, арабинозу, рибозу и ликсозу, а примеры кетопентозы включают рибулозу и ксилулозу. Пентоза, которую используют по настоящему изобретению, может быть любой пентозой, при условии, что она может метаболизироваться микроорганизмом, а с точки зрения наличия в природе, доступности и т.п. предпочтительными являются ксилоза и арабиноза, а более предпочтительной является ксилоза.

Шестиуглеродный сахар, также называемый гексозой, содержит 6 атомов углерода, которые составляют сахар. Гексозу можно подразделить на альдозу, которая имеет альдегидную группу в 1-й позиции, и кетозу, которая имеет кетонную группы во 2-й позиции. Примеры альдозы включают глюкозу, маннозу, галактозу, аллозу, гулозу и талозу, а примеры кетозы включают фруктозу, псикозу и сорбозу. Гексоза, которую используют по настоящему изобретению, может быть любой гексозой, при условии, что она может метаболизироваться микроорганизмом, а с точки зрения наличия в природе, доступности и т.п. предпочтительными являются глюкоза, манноза и галактоза, при этом более предпочтительной является глюкоза.

Смесь сахаров, используемая в настоящем изобретении, специально не ограничивается, и смесь сахаров, предпочтительно, представляет собой сахарный сироп, полученный из содержащей целлюлозу биомассы, поскольку он содержит как гексозу, так и пентозу. Примеры содержащей целлюлозу биомассы включают растительные биомассы, такие как выжимки сахарного тростника, просо, кукурузную солому, рисовую солому и пшеничную солому; и древесные биомассы, такие как деревья и отходы строительных материалов. Содержащие целлюлозу биомассы включают целлюлозу или гемицеллюлозу, которые представляют собой полисахариды, образующиеся при дегидратационной конденсации сахаров. Путем гидролиза подобных полисахаридов можно получить сахарные сиропы, которые могут использоваться в качестве исходного сырья для ферментации. Способ получения сахарного сиропа из содержащей целлюлозу биомассы может быть любым, и примеры раскрытых способов получения подобного сахара включают способ, в котором сахарный сироп получают путем кислотного гидролиза биомассы с использованием концентрированной серной кислоты (патент Японии H11-506934 A, патент Японии 2005-229821 A), и способ, в котором биомассу подвергают гидролизу с помощью разбавленной серной кислоты, а затем подвергают ферментативной обработке целлюлазой и т.п. с получением сахарного сиропа (A. Aden et al., “Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover” NREL Technical Report (2002). Кроме того, примеры раскрытых способов, где кислота не используется, включают способ, в котором биомассу гидролизуют с помощью субкритической воды при температуре от приблизительно 250 до 500°С с получением сахарного сиропа (патент Японии № 2003-212888 A), способ, в котором биомассу подвергают обработке субкритической водой, а затем подвергают ферментативной обработке и получают сахарный сироп (патент Японии № 2001-95597 A), и способ, в котором биомассу подвергают гидролизу горячей водой с температурой от 240 до 280° под давлением, а затем подвергают ферментативной обработке и получают сахарный сироп (патент Японии № 3041380 B). За указанными обработками может последовать очистка полученного сахарного сиропа. Пример указанного способа приведен в WO 2010/067785.

Массовое отношение пентозы и гексозы, содержащихся в смеси сахаров, может быть любым и, предпочтительно, представляет собой отношение в диапазоне от 1:9 до 9:1 (пентоза):(гексоза) в терминах массового соотношения пентозы к гексозе в смеси сахарного сиропа. Оно обозначает соотношение сахаров в тех случаях, когда предполагается, что смесь сахаров представляет собой сахарный сироп, полученный из биомассы, содержащей целлюлозу.

Общая концентрация сахара в смеси сахаров, преимущественно, является набольшей в диапазоне, в котором микроорганизм(ы) не испытывает(ют) ингибирование под действием субстрата. В том случае, когда концентрация сахара слишком низкая, эффективность процесса становится низкой, а потому концентрация сахара, предпочтительно, составляет не меньше чем 20 г/л. Предпочтительный интервал общей концентрации сахара составляет от 20 до 500 г/л. С учетом вышесказанного, концентрация пентозы, преимущественно, составляет не менее 5 г/л, а концентрация гексозы, преимущественно, составляет не менее 5 г/л.

Примеры источника азота, содержащегося в сырье для ферментации, включают газообразный аммиак, водный аммиак, соли аммония, мочевину и соли азотной кислоты; и другие органические источники азота, используемые в качестве вспомогательных веществ, такие как жмых, гидролизаты соевых бобов, гидролизаты казеина, другие аминокислоты, витамины, кукурузный экстракт, дрожжи или дрожжевые экстракты, мясной экстракт, пептиды, такие как пептон, и клетки различных используемых для ферментации микроорганизмов и их гидролизаты. Примеры неорганических солей, которые могут быть, соответственно, добавлены, включают соли фосфорной кислоты, соли магния, соли кальция, соли железа и соли марганца.

В тех случаях, когда микроорганизм(ы), используемый(ые) в настоящем изобретении, требует(ют) для своего роста определенное питательное вещество, то указанное питательное вещество добавляют в виде препарата или натурального продукта, содержащего питательное вещество. Если необходимо, добавляют пеногаситель. В настоящем изобретении культуральная жидкость обозначает жидкость, которую получают в результате роста микроорганизма(ов) в сырье для ферментации. Состав добавляемого сырья для ферментации может быть соответствующим образом изменен, по сравнению с составом сырья для ферментации, используемого на начальной стадии выращивания в питательной среде, таким образом, чтобы продуктивность представляющего интерес химического вещества увеличивалась.

Ниже поясняются микроорганизмы, которые могут быть использованы в способе получения химического вещества по настоящему изобретению. Микроорганизм(ы) по настоящему изобретению специально не ограничивается(ются) при условии, что микроорганизм(ы) имеет(ют) редуктазу пентозы или дегидрогеназу пентозы. Кроме того, используемый(ые) микроорганизм(ы) может(могут) быть микроорганизмом(ами), выделенным(ми) из природного окружения, или микроорганизмом(ами), свойства которого(ых) частично модифицированы путем мутации или генетической рекомбинации.

Редуктаза пентозы представляет собой восстанавливающий фермент и обозначает фермент, способный превратить альдопентозу в сахарный спирт при использовании NADH или NADPH в качестве кофермента. Например, EC 1.1.1.307 и EC 1.1.1.21 соответствуют редуктазе ксилозы, которая представляет собой фермент, превращающий ксилозу в ксилит. Например, EC 1.1.1.21 соответствует редуктазе арабинозы, которая представляет собой фермент, превращающий арабинозу в арабит. Ферменты, для которых не установлена категория вышеуказанных значений ЕС, также включены в редуктазу пентозы по настоящему изобретению при условии, что указанные ферменты обладают вышеуказанной активностью.

Пентолдегидрогеназа представляет собой дегидрогеназу и обозначает фермент, который превращает пентол в кетопентозу при использовании NAD+ в качестве кофермента. Например, EC 1.1.1.9 и EC 1.1.1.10 соответствуют дегидрогеназе ксилозы, которая является ферментом, который преобразует ксилит в ксилулозу. Например, EC 1.1.1.11 и EC 1.1.1.12 соответствуют арабитолдегидрогеназе, которая представляет собой фермент, который превращает арабит в рибозу. Ферменты, которые не категорированы как пентолдегидрогеназа, также включены в пентолдегидрогеназу по настоящему изобретению при условии, что ферменты обладают вышеуказанной активностью.

Микроорганизмы, которые могут метаболизировать пентозу, известны как микроорганизмы, имеющие редуктазу пентозы или дегидрогеназу пентозы. Примеры подобных микроорганизмов включают Pichia, Candida, Pachysolen, Kluyveromyces, Hansenula, Torulopsis, Debaryomyces, Issachenkia, Brettanomyces, Lindnera и Wickerhamomyces. Конкретные примеры подобных микроорганизмов включают Pichia stipitis, Pichia mexcana, Candida shehatae, Candida utilis, Candida tropicalis, Candida tenuis, Candida boidinii, Candida sonorensis, Candida diddensiae, Candida intermedia, Candida parapsilosis, Candida methanosorbosa, Candida wickerhamii, Pachysolen tannophilus, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Issachenkia orientalis, Debaryomyces hansenii, Hansenula polymorpha, Torulopsis bombicola, Brettanomyces naardenensis, Lindnera rhodanensis и Wickerhamomyces rabaulensis. Тот факт, что они имеют редуктазу пентозы и дегидрогеназу пентозы может быть легко установлен путем поиска в базах данных, опубликованных в Интернете, таких как KEGG (Киотская энциклопедия генов и геномов) и GenBank.

Кроме того, даже в случае микроорганизмов, информация для которых отсутствует в базах данных, тот факт, что микроорганизмы имеют редуктазу пентозы и дегидрогеназу пентозы, может быть установлен путем измерения ферментативной активности, как описано ниже в [1] и [2].

[1] Определение активности редуктазы пентозы

Активность редуктазы пентозы можно определить, добавляя экстракт клеток из культуры микроорганизмов к 50 мМ фосфатного буфера (900 мкл), дополненного 200 мМ ксилозы (или пентозы, такой как арабиноза) и 100 мкл 1,5 мМ раствора NAD(P)H и отслеживая при температуре 30°С уменьшение поглощения при 340 нм, специфичное для NAD(P)+, образующегося в процессе реакции.

[2] Измерение активности пентолдегидрогеназы

Активность пентолдегидрогеназы можно определить, добавляя экстракт клеток из культуры микроорганизмов к 900 мкл 50 мМ буферного раствора Tris-HCl, дополненного 50 мМ MgCl₂, 300 мМ ксилита (или пентозы, такой как арабиноза) и 100 мкл 10 мМ раствора NAD(P)+ и отслеживая при температуре 35°С увеличение поглощения при 340 нм, специфичное для NAD(P)H, образующегося в процессе реакции.

Кроме того, микроорганизмы, такие как бактерии или пекарские дрожжи, которые изначально не обладают активностью редуктазы пентозы и дегидрогеназы пентозы, также включены в настоящее изобретение в тех случаях, когда их заставляют экспрессировать ферменты путем генетической рекомбинации. Известные примеры микроорганизмов, которые изначально не обладают активностью редуктазы пентозы и дегидрогеназы пентозы, включают Eschrichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Corynebacterium glutamicum, Bacillus coagulans, Bacillus subtillis, Sporolactobacillus laevolacticus, Paenibacillus polymixa, Zymomonas mobilis и Zymobacter palmae. Примеры способа получения микроорганизмов, экспрессирующих ферменты путем генетической рекомбинации, включают способ, раскрытый в патенте Японии № 2009-112289 A.

Кроме того, для микроорганизма, имеющего ферменты, ферментативную способность можно усилить путем введения мутации или генетической рекомбинации или же в микроорганизм можно ввести экзогенный ген, который заставляет микроорганизм продуцировать вещество, которое изначально не продуцируется указанным микроорганизмом. В частности, например, изомеразу ксилозы вводят в дополнение к редуктазе ксилозы и ксилитдегидрогеназе; индуцируют повышенную экспрессию киназы ксилулозы, которая действует на ксилулозу, метаболит, полученный из ксилита; или D-лактатдегидрогеназу вводят в микроорганизм, который не продуцирует D-молочную кислоту.

Далее поясняется пористая мембрана, которую используют в качестве разделительной мембраны по настоящему изобретению.

Пористая мембрана, которую используют по настоящему изобретению, специально не ограничивается, при условии, что она способна отделять от микроорганизма(ов) путем фильтрации культуральную жидкость, получаемую при культивировании микроорганизма(ов) в процессе перемешивания в сосуде для выращивания в питательной среде или в процессе перемешивания в биореакторе. Примеры пористых мембран, которые можно использовать, включают пористые керамические мембраны, пористые стеклянные мембраны, пористые органические полимерные мембраны, ткани из металлических волокон и нетканые материалы. Среди них пористые органические полимерные мембраны и керамические мембраны являются наиболее предпочтительными.

Состав пористой мембраны, которую используют в качестве разделительной мембраны по настоящему изобретению, поясняется ниже. Пористая мембрана, используемая по настоящему изобретению, обладает разделительной способностью и проницаемостью, которая подходит по свойствам и применению для жидкости, обработку которой проводят.

Пористая мембрана, предпочтительно, представляет собой пористую мембрану, имеющую пористый полимерный слой, выбранный с учетом блокирующей способности, проницаемости и разделительной способности, например, сопротивляемости засорению.

Пористая мембрана, включающая пористый полимерный слой, предпочтительно, имеет пористый полимерный слой, который выступает в качестве функционального разделительного слоя на поверхности основного пористого вещества. Основное пористое вещество несет на себе пористый полимерный слой и придает прочность разделительной мембране.

В тех случаях, когда пористая мембрана, которую используют по настоящему изобретению, имеет пористый полимерный слой на поверхности основного пористого вещества, основное пористое вещество может быть импрегнировано пористым полимерным слоем или может не быть импрегнировано пористым полимерным слоем, что можно выбрать в зависимости от применения мембраны.

Средняя толщина основного пористого вещества, предпочтительно, составляет от 50 мкм до 3000 мкм.

Основное пористое вещество состоит из органического вещества и/или неорганического вещества и т.п., и, преимущественно, используют органическое волокно. Предпочтительные примеры основного пористого вещества включают тканые материалы и нетканые материалы, состоящие из органических волокон, таких как целлюлозные волокна, волокна из триацетата целлюлозы, полиэфирные волокна, полипропиленовые волокна и полиэтиленовые волокна. Более предпочтительно, используют нетканый материал, поскольку его плотность относительно легко контролировать; его сравнительно легко получать; и он не является дорогим.

В качестве пористого полимерного слоя, предпочтительно, может быть использована органическая полимерная мембрана. Примеры веществ для органической полимерной мембраны включают полиэтиленовые смолы, полипропиленовые смолы, поливинилхлоридные смолы, поливинилиденфторидные смолы, полисульфоновые смолы, полиэфирсульфоновые смолы, полиакрилонитриловые смолы, смолы на основе целлюлозы смолы и смолы на основе триацетата целлюлозы. Органическая полимерная мембрана может представлять собой смесь смол, содержащую одну или несколько указанных смол в качестве основного компонента. Основной компонент в данном описании означает, что указанный компонент содержится в количестве не менее чем 50% масс., предпочтительно, не менее чем 60% масс. Предпочтительные примеры веществ для органической полимерной мембраны включают такие, которые легко получаются из растворов и обладают превосходной физической прочностью и химической стойкостью, такие как поливинилхлоридные смолы, поливинилиденфторидные смолы, полисульфоновые смолы, полиэфирсульфоновые смолы и полиакрилонитриловые смолы. Наиболее предпочтительно используют поливинилиденфторидную смолу или смолу, содержащую ее в качестве основного компонента.

В качестве поливинилиденфторидной смолы, предпочтительно, используют гомополимер винилиденфторида. Кроме того, в качестве поливинилиденфторидной смолы, предпочтительно, используется также сополимер с виниловыми мономерами, способными к сополимеризации с винилиденфторидом. Примеры виниловых мономеров, способных к сополимеризации с винилиденфторидом, включают тетрафторэтилен, гексафторпропилен и фтортрихлорэтилен.

Особых ограничений на пористую мембрану, которая может использоваться в качестве разделительной мембраны по настоящему изобретению, специально не накладывается, при условии, что микроорганизм(ы), используемый(ые) в процессе ферментации, не может(могут) проходить сквозь мембрану, и мембраны, преимущественно, выбирают из диапазона, в котором секреции из микроорганизма(ов), используемого(ых) в процессе ферментации, или частицы из исходного сырья для ферментации не вызывают закупоривание мембраны, а фильтрационная способность стабильно поддерживается в течение длительного периода времени. Таким образом, средний размер пор пористой разделительной мембраны, предпочтительно, составляет не меньше чем 0,01 мкм и меньше чем 5 мкм. Средний размер пор, более предпочтительно, составляет не меньше чем 0,01 мкм и меньше чем 1 мкм, поскольку в указанном диапазоне может поддерживаться высокая блокирующая способность, которая препятствует утечке микроорганизмов, и высокая проницаемость для воды, при этом проницаемость можно поддерживать с высокой точностью и воспроизводимостью в течение длительного периода времени.

В тех случаях, когда размер пор близок к размеру микроорганизма(ов), поры могут блокироваться микроорганизмом(ами). Поэтому средний размер пор пористой мембраны, предпочтительно, составляет менее 1 мкм. Чтобы предотвратить утечку микроорганизма(ов), т.е. снизить скорость удаления микроорганизма(ов), средний размер пор мембраны, преимущественно, не должен быть слишком большим, по сравнению с размером микроорганизма(ов). В тех случаях, когда используют микроорганизм с малым размером клетки, такой как бактерия, средний размер пор, предпочтительно, составляет не более 0,4 мкм, более предпочтительно, составляет меньше чем 0,2 мкм.

В некоторых случаях микроорганизм(ы) может(могут) продуцировать вещества, отличные от представляющего интерес химического вещества, например, вещества, которые имеют тенденцию к агрегированию, такие как белки и полисахариды. Кроме того, в некоторых случаях отмирание части микроорганизмов в культуральной жидкости может привести к образованию клеточного дебриса. Чтобы предотвратить закупорку пористой мембраны указанными веществами, средний размер пор, еще более предпочтительно, составляет не более 0,1 мкм.

В тех случаях, когда средний размер пор слишком мал, проницаемость пористой мембраны снижается и, таким образом, эффективную работу трудно осуществить даже с чистой мембраной. Поэтому средний размер пор пористой мембраны по настоящему изобретению, предпочтительно, составляет не меньше чем 0,01 мкм, более предпочтительно, не меньше чем 0,02 мкм, а еще более предпочтительно, не меньше чем 0,04 мкм.

Средний размер пор можно определить путем измерения диаметров всех пор, которые можно наблюдать на площади 9,2 мкм × 10,4 мкм в сканирующем электронном микроскопе при 10000-кратном увеличении, а затем усредняя измеренные значения. В качестве альтернативы, средний размер пор можно определить, сделав фотографию поверхности мембраны при 10000-кратном увеличении с помощью сканирующего электронного микроскопа и произвольно выбрав не менее 10 пор, предпочтительно, не менее 20 пор, а затем измерить диаметры указанных пор и рассчитать среднечисловые значения. Если пора не круглой формы, ее размер можно определить с помощью метода, в котором определяют круг (эквивалентный круг), площадь которого равна площади поры, с помощью устройства компьютерной обработки изображений и т.п., и диаметр эквивалентного круга принимают за диаметр поры.

Стандартное отклонение σ от среднего размера пор пористой мембраны, которую используют по настоящему изобретению, предпочтительно, составляет не больше чем 0,1 мкм. Стандартное отклонение σ от среднего размера пор, предпочтительно, должно быть как можно меньшим. Стандартное отклонение σ от среднего размера пор рассчитывают в соответствии с приведенным ниже уравнением 1, где N соответствует числу пор, которые можно наблюдать в пределах указанной выше площади 9,2 мкм × 10,4 мкм, X_k обозначает соответствующие измеренные диаметры, а X(ave) обозначает средний диаметр пор.

[Уравнение 1]

σ = ∑ k = 1 N ( X k − X ( a v e ) ) 2 N

(1)

Одной из наиболее важных характеристик пористой мембраны, которую используют по настоящему изобретению, является проницаемость для ферментативной культуральной жидкости. В качестве показателя проницаемости может быть использован коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды перед использованием мембраны. В настоящем изобретении коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды, предпочтительно, составляет не менее чем 5,6×10^-10 м³/м²/с/Па, если его рассчитывать путем измерения количества водного пермеата при высоте головки 1 м, используя очищенную воду с температурой 25°С, которую получают с помощью обратноосмотической мембраны. В том случае, когда коэффициент проницаемости чистой воды находится в интервале от 5,6×10^-10 м³/м²/с/Па до 6,7×10^-7 м³/м²/с/Па, может быть получено количество пермеата, которое достаточно с практической точки зрения.

Для пористой мембраны, которую используют по настоящему изобретению, шероховатость поверхности представляет собой среднее значение высоты в вертикальном направлении к поверхности. Шероховатость поверхности мембраны, является одним из факторов, которые влияют на то, насколько легко микроорганизм, прикрепившийся к поверхности разделительной мембраны, удаляется с поверхности при отмывке поверхности мембраны под действием потока жидкости, возникающего при перемешивании или с помощью циркуляционного насоса. Шероховатость поверхности пористой мембраны специально не ограничивается, при условии, что она входит в диапазоне, в котором микроорганизм(ы) и другие твердые вещества, прикрепившиеся к мембране, могут быть удалены. Шероховатость поверхности, преимущественно, составляет не более 0,1 мкм. В том случае, когда шероховатость поверхности не больше чем 0,1 мкм, микроорганизм(ы) и другие твердые вещества, присоединенные к мембране, могут быть легко удалены.

Установлено, что операцию, которая не требует избыточной мощности для очистки поверхности мембраны, можно проще осуществить путем использования, что более предпочтительно, пористой мембраны, шероховатость поверхности которой не превышает 0,1 мкм, средний размер пор составляет не меньше чем 0,01 мкм и меньше чем 1 мкм, а коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды составляет не менее 2×10^-9 м³/м²/с/Па. В тех случаях, когда шероховатость поверхности пористой мембраны не превышает 0,1 мкм, силу сдвига, создаваемую на поверхности мембраны при фильтрации микроорганизма(ов), можно снизить и тем самым уменьшить разрушение микроорганизма(ов), а также можно подавить закупоривание пористой мембраны. Таким образом, можно легче осуществить стабильную фильтрацию в течение длительного времени. Кроме того, в тех случаях, когда шероховатость поверхности пористой мембраны не превышает 0,1 мкм, непрерывную ферментацию можно осуществить при меньшей разнице трансмембранного давления. Таким образом, даже в тех случаях, когда произошло закупоривание пористой мембраны, можно добиться лучшего восстановления проницаемости с помощью промывки, по сравнению с теми случаями, когда операцию проводят при большей разнице трансмембранного давления. Поскольку подавление закупорки пористой мембраны позволяет провести устойчивую непрерывную ферментацию, то шероховатость поверхности пористой мембраны, предпочтительно, должна быть как можно меньшей.

Шероховатость пористой мембраны в настоящем изобретении измеряют с помощью атомного силового микроскопа (AFM) в следующих условиях.

- Устройство

Атомно-силовой микроскоп ("Nanoscope IIIa", производитель - Digital Instruments, Inc.)

- Условия

Зонд: консоль из SiN (производитель - Digital Instruments, Inc.)

Режим сканирования:

Контактный режим (измерение на воздухе)

Подводный полуконтактный режим (измерение под водой)

Площадь сканирования:

10 мкм × 25 мкм (измерение на воздухе)

5 мкм × 10 мкм (измерение под водой)

Разрешение сканирования: 512×512

- Приготовление образца

При проведении измерений образец мембраны на 15 мин помещают в этанол при комнатной температуре, а затем замачивают в воде RO на 24 час, чтобы промыть его, а затем сушат на воздухе. Вода RO означает воду, которую получают фильтрацией через обратноосмотическую мембрану (RO мембрану), которая представляет собой разновидность фильтрационной мембраны, с целью удаления примесей, таких как ионы и соли. Размер пор обратноосмотической мембраны составляет не более чем приблизительно 2 нм.

Шероховатость поверхности мембраны d_rough рассчитывают по приведенному ниже уравнению (2) из высоты в каждой точке в направлении оси Z, которую определяют с помощью атомно-силового микроскопа (AFM).

[Уравнение 2]

d r o u g h = ∑ n = 1 N | Z n − Z ¯ | N

(2)

d r o u g h : средняя шероховатость поверхности (мкм)

Z n : высота в направлении оси Z (мкм)

Z ¯ : средняя высота сканированной площади (мкм).

Формой пористой мембраны, используемой по настоящему изобретению, предпочтительно, является плоская мембрана. В том случае, когда формой пористой мембраны является плоская мембрана, ее среднюю толщину выбирают в зависимости от применения. Средняя толщина в том случае, когда формой пористой мембраны является плоская мембрана, предпочтительно, составляет от 20 мкм до 5000 мкм, более предпочтительно, от 50 мкм до 2000 мкм. Кроме того, формой пористой мембраны, используемой по настоящему изобретению, предпочтительно, является мембрана из полого волокна. В том случае, когда пористая мембрана представляет собой мембрану из полого волокна, внутренний диаметр полого волокна, предпочтительно, составляет от 200 мкм до 5000 мкм, а толщина мембраны, предпочтительно составляет от 20 мкм до 2000 мкм. Внутри полых волокон могут содержаться ткани или трикотаж, которым путем формования органических волокон или неорганических волокон придают цилиндрическую форму.

Описанную выше пористую мембрану можно получить, например, по способу получения, описанному в WO 2007/097260.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения разделительная мембрана по настоящему изобретению может быть мембраной, включающей, по меньшей мере, керамику. Керамика в настоящем изобретении означает вещество, которое содержит оксид металла и которое обжигают в процессе тепловой обработки при высокой температуре. Примеры оксида металла включают оксид алюминия, оксид магния, оксид титана и оксид циркония. Разделительная мембрана может быть сформирована только из оксида(ов) металла или может включать в себя оксид кремния, и/или карбид кремния, и/или муллит, и/или кордиерит, которые представляют собой соединения оксида кремния и оксида(ов) металла.

Отличные от керамики компоненты, которые образуют разделительную мембрану, не ограничиваются, при условии, что указанные компоненты могут образовать пористое тело в качестве разделительной мембраны.

Даже в тех случаях, когда разделительная мембрана содержит керамику, форма разделительной мембраны не ограничивается, и она может быть любой из монолитной мембраны, плоской мембраны и трубчатой мембраны и т.п. С точки зрения эффективности упаковки в контейнер, раздели