Гуманизированные антитела к cxcr4 для лечения рака

Гуманизированные антитела к cxcr4 для лечения рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к новому антителу, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу, способному специфически связываться с рецепторами хемокинов (CXCR), а также к амино- и нуклеиновокислотной последовательностям, кодирующим такое антитело. В одном аспекте изобретение относится к новому антителу, производным соединениям или функциональным фрагментам, способным специфически связываться с CXCR4 и имеющим сильную противоопухолевую активность. Изобретение также относится к применению такого антитела в качестве лекарственного средства для профилактического и/или терапевтического лечения рака, а также в процедурах или наборах, связанных с диагностикой рака. Наконец, изобретение относится к композициям, содержащим такое антитело в сочетании или в конъюгации с другим противораковым соединением (соединениями), таким как антитела, токсины, цитотоксические/цитостатические агенты, и к применению их для профилактики и/или лечения некоторых видов рака.

Хемокины представляют собой небольшие секретируемые пептиды, которые контролируют миграцию лейкоцитов по химическому градиенту лиганда, известному как хемокиновый градиент, особенно в иммунных реакциях (Zlotnick A. et al., 2000). Они разделены на два основных подсемейства, СС и СХС, в зависимости от положения их NH₂-концевых остатков цистеина, и связываются с рецепторами, сопряженными с G-белком, два основных подсемейства которых обозначаются как CCR и CXCR. До настоящего времени было обнаружено более 50 человеческих хемокинов и 18 хемокиновых рецепторов.

Многие раки имеют сложную хемокиновую сеть, которая влияет на иммунно-клеточную инфильтрацию опухоли, а также на рост, выживание, миграцию опухолевых клеток и ангиогенез. Иммунные клетки, эндотелиальные клетки и опухолевые клетки сами экспрессируют хемокиновые рецепторы и могут реагировать на хемокиновые градиенты. Исследования образцов биопсии человеческого рака и мышиных моделей рака показали, что экспрессия хемокиновых рецепторов раковыми клетками связана с увеличением метастатического потенциала. Злокачественные клетки от различных типов рака имеют различные профили экспрессии хемокиновых рецепторов, но наиболее распространен хемокиновый рецептор-4 (CXCR4). Клетки по меньшей мере 23 различных типов человеческих раков эпителиального, мезенхимального и гемопоэтического происхождения экспрессируют CXCR4-рецептор (Balkwill F. et al., 2004).

Хемокиновый рецептор-4 (также известный как фузин, CD184, LESTR или HUMSTR) существует в виде двух изоформ, содержащих 352 или 360 аминокислот. Остаток Asn11 гликозилирован, остаток Tyr21 модифицирован путем добавлением сульфатной группы, a Cys109 и Cys186 связаны дисульфидным мостиком на внеклеточной части рецептора (Juarez J. et al., 2004).

Этот рецептор экспрессируется различными видами нормальных тканей, наивными Т-клетки (не Т-клетками памяти), регуляторными Т-клетками, В-клетками, нейтрофилами, эндотелиальными клетками, первичными моноцитами, дендритными клетками, натуральными киллерами, CD34+ гемопоэтическими стволовыми клетками и на низком уровне в сердце, кишечнике, печени, почках и головном мозге. CXCR4 играет ключевую роль в перемещении лейкоцитов, В-клеточном лимфопоэзе и миелопоэзе.

CXCR4-рецептор сверхэкспрессирован в большом числе раков, включая, но не ограничиваясь ими, рак толстой кишки (Ottaiano A. et al., 2004), молочной железы (Kato М. et al., 2003), предстательной железы (Sun Y.X. et al., 2003), легких [мелкоклеточная и немелкоклеточная карцинома (Phillips R.J. et al., 2003)], яичника (Scotton C.J. et al., 2002), поджелудочной железы (Koshiba Т. et al., 2000), почек, головного мозга (Barbero S et al., 2002), глиобластому и лимфомы.

Уникальным лигандом рецептора CXCR4, описанным до настоящего времени, является фактор стромальных клеток-1 (SDF-1) или CXCL12. SDF-1 секретируется в большом количестве в лимфатических узлах, костном мозге, печени, легких и в меньшей степени в почках, головном мозге и коже. CXCR4 также распознается антагонистическим хемокином, вирусным макрофагальным воспалительным белком II (vMIP-II), который кодируется человеческим вирусом герпеса III типа.

CXCR4/SDF-1 ось играет ключевую роль в раке и непосредственно участвует в миграции, инвазии, ведущей к метастазированию. Действительно, раковые клетки экспрессируют CXCR4-рецептор, они мигрируют и входят в системный кровоток. Затем раковые клетки задерживаются в сосудистом русле в органах, которые продуцируют высокие уровни SDF-1, где они пролиферируют, индуцируют ангиогенез и формируют метастатические опухоли (Murphy PM., 2001). Эта ось также участвует в пролиферации клеток через активацию пути внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK) (Barbero S. et al., 2003) и ангиогенезе (Romagnani P., 2004). Действительно, CXCR4-рецептор и его лиганд SDF-1 четко усиливает ангиогенез путем стимуляции экспрессии VEGF-A, который в свою очередь увеличивает экспрессию CXCR4/SDF-1 (Bachelder R.E. et al., 2002). Известно также, что опухоль-ассоциированные макрофаги (ТАМ) накапливаются в гипоксических областях опухолей и стимулируются к воздействию с опухолевыми клетками и усиливают ангиогенез. Было отмечено, что гипоксия селективно повышает экспрессию CXCR4 в различных типах клеток, включая ТАМ (Mantovani А. et al., 2004). Недавно было показано, что ось CXCR4/SDF-1 регулирует перемещение/хоминг CXCR4+гемопоэтических стволовых клеток/клеток-предшественников (HSC) и может играть роль в неоваскуляризации. Данные свидетельствуют о том, что помимо HSC функциональный CXCR4 также экспрессируется на стволовых клетках из других тканей (ранних тканевых стволовых клетках = TCSC), так что SDF-1 может играть ключевую роль в хемотаксисе CXCR4+TCSC, необходимом для регенерации органа/ткани, но эти TCSC могут также быть клеточным источником развития рака (теория раковых стволовых клеток). Происхождение рака из стволовых клеток было продемонстрировано для человеческой лейкемии и недавно для нескольких солидных опухолей, таких как опухоли головного мозга и молочной железы. Есть несколько примеров CXCR4+опухолей, которые могут происходить из нормальных CXCR4+ ткане-/органоспецифичных стволовых клеток, например лейкемии, опухоли головного мозга, мелкоклеточный рак легких, рак молочной железы, гепатобластома, рак яичников и шейки матки (Kucia M. et al., 2005).

Влияние на метастазы рака путем воздействия на рецептор CXCR4 было продемонстрировано in vivo с помощью моноклонального антитела, направленного против рецептора CXCR4 (Muller A. et al., 2001). Вкратце, было показано, что моноклональное антитело, направленное против CXCR4-рецептора (MKA 173 R&D Systems), значительно уменьшает количество метастазов в лимфатических узлах на модели ортотопического рака молочной железы (MDA-MB231) у мышей SCID. Другое исследование (Phillips R.J et al., 2003) также показало важную роль оси SDF-1/CXCR4 в метастазировании на модели ортотопической карциномы легких (А549) с помощью поликлональных антител против SDF-1, но в данном исследовании не было влияния ни на рост опухоли, ни на ангиогенез. Ряд других исследований также описывает ингибирование либо метастазов in vivo с помощью киРНК-дуплексов CXCR4 (Liang Z. et al., 2005), биоустойчивых антагонистов пептида CXCR4 (Tamamura H. et al., 2003), либо опухолевого роста in vivo с использованием низкомолекулярного антагониста CXCR4, такого как AMD 3100 (Rubin J.B. et al., 2003; De Faico V. et al., 2007), или MKA (патент WO 2004/059285 А2). Таким образом, CXCR4 является утвержденной терапевтической мишенью при раках.

Хемокиновый рецептор-2 (CXCR2), другой хемокиновый рецептор, также описывается как интересная мишень в онкологии. Действительно, CXCR2 передает аутокринный клеточный ростовой сигнал в нескольких типах опухолевых клеток и также может влиять на рост опухоли косвенным путем за счет усиления ангиогенеза (Tanaka Т. et al. 2005).

Хемокиновый рецептор CXCR2 включает 360 аминокислот.Он экспрессируется главным образом в эндотелиальных клетках и специфично во время неоваскуляризации. CXCR2-рецептор связывают несколько хемокинов: CXCL5, -6, -7, IL-8, GRO-f, -β и -γ, которые принадлежат к ERL+ проангиогенным хемокинам. CXCR2-рецептор частично имеет гомологичную последовательность с CXCR4-рецептором: 37% идентичной последовательности и 48% гомологичной последовательности. Ось CXCR2/лиганды вовлечена в несколько механизмов опухолевого роста, таких как метастазирование (Singh RK. et а1., 1994), клеточная пролиферация (Owen J.D. et al., 1997) и ERL+ хемокин-опосредованный ангиогенез (Stricter R.M. et al., 2004; Romagnani et al., 2004). Наконец, опухоль-ассоциированные макрофаги и нейтрофилы являются ключевыми элементами индуцированного воспалением опухолевого роста, и хемокины, такие как CXCL5, IL-8 и GRO-α, инициируют привлечение нейтрофилов.

Димеризация появилась как общий механизм регуляции функции рецепторов, связанных с G-белком, к числу которых относятся хемокиновые рецепторы (Wang J. and Norcross M., 2008). Было показано, что гомо- и гетеродимеризация в ответ на связывание хемокином необходима для инициирования и изменения передачи сигнала от большого количества хемокиновых рецепторов. Все больше фактов поддерживает концепцию, что рецепторные димеры или олигомеры, вероятно, являются основной функциональной единицей хемокиновых рецепторов. Димеры хемокиновых рецепторов присутствуют в отсутствие лигандов, а хемокины индуцируют конформационные изменения рецепторных димеров. CXCR4, как известно, формирует гомодимеры, а также гетеродимеры, например, с 5-опиоидным рецептором (DOR) (Hereld D., 2008) или CCR2 (Percherancier Y. et al., 2005). В последнем примере пептиды, полученные из трансмембранных доменов CXCR4, ингибировали активацию путем блокирования лиганд-индуцированных конформационных переходов димера (Percherancier Y. et al., 2005). Другое исследование показало, что пептид CXCR4-TM4, синтетический пептид трансмембранного участка CXCR4, уменьшает перенос энергии между протомерами гомодимеров CXCR4 и ингибирует SDF-1-индуцированную миграцию и полимеризацию актина в злокачественных клетках (Wang J. et al., 2006). Совсем недавно также было описано, что CXCR7 формирует функциональные гетеродимеры с CXCR4 и усиливает SDF-1-индуцированную передачу сигнала (Sierro F. et al., 2007). Другие примеры конститутивных гетеродимеров включают исследования, показывающие взаимодействие CXCR1 и CXCR2, а также формирование соответствующих гомодимеров. Для любого из них было отмечено отсутствие взаимодействий с другим GPCR (альфа(1А)-адренорецептором), что указывает на специфичность взаимодействия CXCR1 и CXCR2 (Wilson S. et al., 2005).

Как упоминалось ранее, рецепторы CXCR4 и CXCR2 являются интересными опухолевыми мишенями. Влияние на эти рецепторы должно ингибировать опухолевый рост и метастазирование очень эффективным образом путем уменьшения пролиферации опухолевых клеток, ангиогенеза, миграции и инвазии опухолевых клеток, привлечения нейтрофилов и макрофагов в опухоль и путем ингибирования CXCR4-раковых стволовых клеток.

Одним из предлагаемых аспектов данного изобретения является создание гуманизированного моноклонального антитела, индуцирующего конформационные изменения CXCR4-димеров. Изобретение охватывает CXCR4-MKA hz515H7 (или его фрагменты), способное связывать и индуцировать конформационные изменения как гомодимеров CXCR4, так и гетеродимеров CXCR4/CXCR2, и имеющее высокую противоопухолевую активность. Hz515H7 индуцирует конформационные изменения как гомодимеров CXCR4, так и гетеродимеров CXCR4/CXCR2. Это новое свойство должно представлять интерес для применения в терапии рака с учетом важной роли этих двух хемокиновых рецепторов при раке.

Уже обнаружено, что влияние как гомо-, так и гетеродимеров рецепторов усиливает терапевтический эффект MKA. Действительно, было продемонстрировано, например, что MKA (h7C10), влияющее на оба гибридных рецептора IGF-1R и инсулин/IGF-1, более мощно ингибирует опухолевый рост in vivo, чем MKA, влияющее исключительно на IGF-1R (Pandini G., 2007).

Кроме того, анти-CXCR4-MKA hz515H7 является молчащим антагонистом для CXCR4, оно не изменяет базальный сигнал в анализах in vitro, но ингибирует SDF-1-индуцированную передачу сигнала в различных анализах (GTPγS-связывание, высвобождение Са²⁺), а также способно ингибировать SDF-1-индуцированную миграцию опухолевых клеток in vitro.

Молекулы, действующие либо как частичные агонисты, либо как обратные агонисты, демонстрируют внутреннюю активность в отсутствие лигандов. Эти типы молекул стабилизируют, соответственно, высокоаффинное или низкоаффинное состояние GPCR, даже в отсутствие лиганда, тем самым активируя или ингибируя нисходящие сигнальные каскады (Galandin et al., 2007; Kenakin, 2004).

В случае MKA hz515H7 оно ведет себя как молчащий антагонист без какой-либо внутренней активности в отношении CXCR4-рецептора в отсутствие SDF-1. Эта фармакологическая черта может быть связана с менее неблагоприятными побочными эффектами по сравнению с частичными или обратными агонистами, как уже отмечалось для лигандов опиоидных рецепторов (Bosier and Hermans, 2007). Действительно, функциональная активность MKA hz515H7 полностью зависит от наличия SDF-1, и отсутствие модуляции активности рецептора CXCR4 будет наблюдаться в тканях и органах, в которых лиганд SDF-1 не экспрессируется, не секретируется или не доставляется кровотоком. Таким образом, MKA hz515H7, вероятно, будет менее токсичным по сравнению с другими лигандами рецептора CXCR4 с положительной или отрицательной эффективностью. Кроме того, молчащие антагонисты составляют меньшую часть видов в фармакологической области (Wurch et al., 1999, Kenakin, 2004).

Удивительно, но в первый раз изобретателям удалось создать гуманизированное антитело, которое способно связываться с CXCR4, но также способно вызывать конформационные изменения гомодимеров и/или гетеродимеров CXCR4. В частности, антитело изобретения способно вызывать конформационные изменения гомодимеров CXCR4, а также гетеродимеров CXCR4/CXCR2.

В последующей заявке выражение во множественном числе «димеры CXCR4» следует понимать как охватывающее гомодимеры CXCR4, а также гетеродимеры CXCR4/CXCR2.

На данном этапе следует отметить, что такие гуманизированные антитела никогда не были описаны в известном уровне техники. Кроме того, необходимо отметить, что существование гетеродимеров CXCR4/CXCR2 никогда не было описано.

Частью изобретения является открытие существования гетеродимера, образованного CXCR4 и CXCR2.

Так, в частном аспекте данное изобретение относится к выделенному комплексу, включающему или состоящему из гетеродимера CXCR4/CXCR2.

Соединение CXCR4-части указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2 является одной из двух человеческих изоформ CXCR4, выбранных из группы, состоящей из:

- хемокинового (С-Х-С-мотив) рецептора 4 изоформы b [Homo sapiens], имеющего последовательность, указанную под регистрационным номером Genbank NP_003458 (SEQ ID №1);

- хемокинового (С-Х-С-мотив) рецептора 4 изоформы a [Homo sapiens], имеющего последовательность, указанную под регистрационным номером Genbank NP_001008540 (SEQ ID №2);

- альтернативного транскрипционного варианта сплайсинга или природного варианта, имеющего по меньшей мере 95% идентичность с одной из этих изоформ b или а с SEQ ID №1 или 2; и

- его фрагмента, который может специфично распознаваться природным лигандом фактором стромальных клеток-1 (SDF-1) и предпочтительно имеет по меньшей мере 100,150 и 200 аминокислот в длину.

Соединение CXCR2-части указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2 выбрано из группы, состоящей из:

рецептора бета интерлейкина-8 [Homo sapiens], имеющего последовательность, указанную под регистрационным номером Genbank NP_001548(SEQIDNQ3);

- альтернативного транскрипционного варианта сплайсинга или природного варианта, имеющего по меньшей мере 95% идентичность с этим рецептором бета интерлейкина-8 с SEQ ID №3; и

- его фрагмента, который может специфично распознаваться ИЛ-8 и предпочтительно имеет по меньшей мере 100, 150 и 200 аминокислот в длину.

В данном частном аспекте данное изобретение также включает выделенную РНК или ДНК, кодирующую полипептид, включающий указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2.

Это изобретение также включает нуклеиновую конструкцию, предпочтительно экспрессионный вектор, например плазмиду, кодирующую указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2.

Изобретение также включает композицию, включающую по меньшей мере одну нуклеиновую конструкцию, предпочтительно экспрессионный вектор, например плазмиду, кодирующую CXCR4-часть указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2, и вторую конструкцию, предпочтительно экспрессионный вектор, например плазмиду, кодирующую CXCR2-часть указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2.

В этом аспекте изобретение также раскрывает способ получения рекомбинантной клетки-хозяина, экспрессирующей указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2, где этот способ включает этап трансформации указанной клетки-хозяина:

а) нуклеиновой конструкцией, предпочтительно экспрессионным вектором, например плазмидой, кодирующей указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2; или

б) по меньшей мере одной нуклеиновой конструкцией, предпочтительно экспрессионным вектором, например плазмидой, кодирующей CXCR4-часть указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2, и второй конструкцией, предпочтительно экспрессионным вектором, например плазмидой, кодирующей CXCR2-часть указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2.

Указанная клетка-хозяин является эукариотической клеткой, например клеткой млекопитающего.

Нуклеиновая конструкция (конструкции), кодирующая указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2, кодирует также первый маркер, который связан (в частности, с помощью ковалентной связи) с CXCR4-последовательностью, например маркер luc (люцефераза), и второй маркер, который связан (в частности, с помощью ковалентной связи) с CXCR2-последовательностью, например маркер GFP (т.е. для анализа BRET).

Изобретение также раскрывает способ выбора соединения, которое проявляет противораковую активность или которое может быть использовано для получения композиции для лечения рака, который характеризуется тем, что включает этап:

а) контактирования рекомбинантной клетки-хозяина данного изобретения, которая экспрессирует указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2, с анализируемым соединением; и

б) определения того, способно ли это соединение модулировать, предпочтительно ингибировать, активность этого гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2 в рекомбинантной клетке-хозяине.

В первом аспекте предметом данного изобретения является процесс создания и выбора гуманизированных антител в соответствии с изобретением.

В первом аспекте изобретение касается процесса выбора гуманизированного анти-CXCR4-антитела или одного из его функциональных фрагментов или производных, способных ингибировать как лиганд-зависимую, так и лиганд-независимую активацию CXCR4, при этом указанный процесс включает следующие этапы:

i) скрининг созданных гуманизированных антител и выбор антител, способных специфически связывать CXCR4, а также для модулировать CXCR4-активацию;

ii) тестирование антител, выбранных на этапе i), и выбор антител, способных индуцировать конформационные изменения гомодимеров CXCR4, а затем

iii) тестирование антител, выбранных на этапе ii), и выбор антител, способных индуцировать конформационные изменения гетеродимеров CXCR4/CXCR2.

Под выражением «модулировать» следует понимать усиление или ингибирование. Предпочтительно выбранные антитела изобретения должны ингибировать CXCR4-активацию.

Как было объяснено ранее, индукция конформационных изменений димеров CXCR4 является основным аспектом изобретения, так как такие антитела будут представлять реальный интерес для большего количества пациентов.

Создание антитела может быть реализовано любым способом, известным специалистам в данной области, таким как, например, из рекомбинантных гуманизированных антител, разработанных из секвенированных CDR мышиных антител, секретированных при слиянии миеломной клетки с клетками селезенки от иммунизированных мышей или других видов, совместимых с выбранными миеломными клетками [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]. Иммунизированные животные могут включать трансгенных мышей с человеческими иммуноглобулиновыми локусами, которые затем непосредственно продуцируют человеческие антитела. Другое возможное воплощение могло бы состоять в применении методики фагового дисплея для скрининга библиотек.

Этап скрининга i) может быть реализован любым способом или процессом, известным специалистам в данной области. В качестве неограничивающих примеров можно упомянуть ИФА, BIAcore, иммуногистохимию, FACS-анализ и функциональные скрининги. Предпочтительный способ состоит в скрининге с помощью FACS-анализа на CXCR4-трансфектантах и по меньшей мере на опухолевой клеточной линии, чтобы убедиться, что продуцируемые антитела также способны распознавать нативный рецептор на опухолевых клетках. Этот процесс будет описан более точно в последующих примерах.

Под выражением «модулировать CXCR4-активацию» понимается модуляция по меньшей мере одной из активностей, указанных ниже в примерах 4, 5, 7 и 11 для мышиного антитела, 16, 17 и 19 для химерного антитела и 27, 24 и 28 для гуманизированного антитела:

Предпочтительными для модуляции являются:

- специфическое связывание на клеточных мембранах лиганда SDF-1 рецептором CXCR4 (см. примеры 4, 16, 27), в частности, путем конкурирования на мембране трансформированных эукариотических клеток, таких как мембраны СНО-K1, стабильно эксперессирующих человеческий рецептор CXCR4 дикого типа;

- специфическое связывание на клеточных мембран GTPγS рецептором CXCR4 (см. примеры 5, 17, 24), в частности, на мембране трансформированных эукариотических клеток, например клеток NIH-3T3, стабильно и конститутивно эксперессирующих рецептор CXCR4 дикого типа;

- CXCR4-опосредованное ингибирование продукции цАМФ (см. пример 7); и

- CXCR4-рецептор-опосредованная мобилизация внутриклеточных депо кальция (см. примеры 11, 19, 28).

Более предпочтительно эта модуляция по меньшей мере одной из этих видов активности представляет собой ингибирование активности.

В предпочтительном воплощении этапов выбора ii) и iii) процесса изобретения указанные этапы ii) и iii) состоят в оценке антител с помощью BRET-анализа на клетках, экспрессирующих CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP и CXCR4-Rluc/CXCR2-YFP, соответственно, и в выборе антител, способных ингибировать по меньшей мере 40%, предпочтительно 45%, 50%, 55% и наиболее предпочтительно 60% BRET-сигнала.

Методика BRET представляет собой методику, которая известна как репрезентативная для белковой димеризации [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89].

Методика BRET, используемая в этапах процесса ii) и iii), хорошо известна специалистам в данной области и будет подробно описана в последующих примерах. Более конкретно BRET (bioluminescence resonance energy transfer, резонансный перенос энергии биолюминесценции) представляет собой нерадиационный перенос энергии, возникающий между биолюминесцентным донором (люциферазой Renilla (Rluc)) и флуоресцентным акцептором, мутантом GFP (green fluorescent protein, зеленый флуоресцентный белок) или YFP (yellow fluorescent protein, желтый флуоресцентный белок). В данном случае был использован EYFP (enhanced yellow fluorescent protein, усиленный желтый флуоресцентный белок). Эффективность переноса зависит от ориентации и расстояния между донором и акцептором. Кроме того, передача энергии может происходить только тогда, когда две молекулы находятся в непосредственной близости (1-10 нм). Это свойство используется для проведения анализа белково-белковых взаимодействий. Действительно, в целях изучения взаимодействия между двумя участниками первый из них генетически сливают с люциферазой Renilla, а второй с желтым мутантом GFP. Гибридные белки, как правило, но не обязательно, экспрессируются клетками млекопитающих. В присутствии своего мембранно-проницаемого субстрата (коэлентеразина) Rluc испускает синий свет. Если мутант GFP находится ближе 10 нм к Rluc, то может возникнуть передача энергии, и будет обнаружен дополнительный желтый сигнал. Сигнал BRET измеряется как соотношение между светом, излучаемым акцептором, и светом, излучаемым донором. Таким образом, BRET-сигнал будет увеличиваться по мере сближения двух гибридных белков, или если конформационное изменение сблизит Rluc и GFP-мутант.

Если BRET-анализ включен в предпочтительное воплощение, то для измерения конформационных изменений димеров CXCR4 можно использовать любой способ, известный специалистам в данной области. Не ограничивая, можно отметить следующие методики: FRET (fluorescence resonance energy transfer, резонансный перенос энергии флуоресценции), HTRF (homogenous time resolved fluorescence, гомогенная флуоресценция с временным разрешением), FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy, флуоресцентная микроскопия с изображением по времени жизни флуоресценции) или SW-FCCS (single wavelength fluorescence cross-correlation spectroscopy, кросс-корреляционная спектроскопия флуоресценции одной длины волны).

Также могут быть использованы другие классические методики, например коиммунопреципитация, Alpha Screen, химическое сшивание, двойной гибрид, аффинная хроматография, ИФА и фар-вестерн-блоттинг.

В частном аспекте процесса в соответствии с изобретением этап ii) состоит в оценке антител с помощью BRET-анализа на клетках, экспрессирующих оба CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP, и в выборе антител, способных ингибировать по меньшей мере 40% BRET-сигнала.

В другом частном аспекте процесса в соответствии изобретением этап iii) состоит в оценке антител с помощью BRET-анализа на клетках, экспрессирующих оба CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP, и в выборе антител, способных ингибировать по меньшей мере 40% BRET-сигнала.

Во втором аспекте предметом изобретения является выделенное гуманизированное антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, получаемых указанным способом. Указанное гуманизированное антитело или один из его указанных фрагментов или производных способны специфически связываться с человеческим CXCR4 и, более того, при необходимости предпочтительно способны ингибировать природное присоединение его лиганда; также указанное гуманизированное антитело способно индуцировать конформационные изменения димеров CXCR4.

Выражения «функциональные фрагменты и производные» подробно будут определены ниже в данном описании.

Здесь следует понимать, что изобретение не относится к антителам в природной форме, то есть они находятся не в их природной среде, но что они могут быть выделены или получены путем очистки из природных источников, либо получены путем генетической рекомбинации, либо путем химического синтеза, и что они могут содержать неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.

В частности, в соответствии с другим аспектом изобретения описано антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, при этом указанное гуманизированное антитело характеризуется тем, что оно содержит по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность (CDR), определенный в соответствии с IMGT, выбранный среди CDR, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID №№4-9.

В соответствии со вторым аспектом изобретение связано с выделенным гуманизированным антителом или его производным или функциональным фрагментом, содержащим по меньшей мере один CDR, выбранный среди CDR с последовательностью SEQ ID №№4, 5, 6, 7, 8 или 9, или по меньшей мере один CDR, определенный в соответствии с IMGT, с последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентична после оптимального выравнивания последовательностям SEQ ID №№4, 5, 6, 7, 8 или 9.

Под «функциональным фрагментом» антитела понимается, в частности, фрагмент антитела, такой как фрагменты Fv, scFv (sc обозначает одну цепь), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc, или димерные антитела или любой фрагмент, с такой же специфичностью к CXCR4, как у родительского антитела, время полужизни которого было увеличено. Такие функциональные фрагменты будут подробно описаны ниже в данном описании.

Под «производным соединением» или «производным» антитела понимается, в частности, связывающий белок, содержащий пептидную матрицу и по меньшей мере один из CDR исходного антитела для поддержания способности распознавать CXCR4. Такие производные соединения, хорошо известные специалистам в данной области, будут описаны более подробно в данном описании. В другом воплощении изобретения, производное соединение или производное может содержать по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, более предпочтительно 4, еще более предпочтительно 5 или, наиболее предпочтительно, 6 CDR исходного антитела.

Более предпочтительно изобретение содержит гуманизированные антитела, их производные соединения или их функциональные фрагменты в соответствии с данным изобретением, полученные путем генетической рекомбинации или химического синтеза.

В соответствии с предпочтительным воплощением гуманизированное антитело в соответствии с изобретением или его производные соединения или функциональные фрагменты характеризуются тем, что они состоят из моноклональных антител.

Под «моноклональным антителом» понимается антитело, полученное из популяции существенно однородных антител. Более конкретно отдельные антитела популяции являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минимальных пропорциях. Иными словами, моноклональное антитело представляет собой однородное антитело, полученное в результате роста отдельного клона клеток (например, гибридомы, эукариотической клетки-хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей однородное антитело, прокариотической клетки-хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей однородное антитело и т.д.), и в целом характеризуется тяжелыми цепями одного и только одного класса и подкласса и легкими цепями только одного типа. Моноклональные антитела высоко специфичны и направлены против одного антигена. Кроме того, в отличие от получения поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант, или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена.

Здесь следует понимать, что изобретение не относится к гуманизированным антителам в природной форме, то есть они взяты не из их природной среды, но что они выделены или получены путем очистки из природных источников, либо получены путем генетической рекомбинации, либо путем химического синтеза, и, таким образом, они могут содержать неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.

В частности, в соответствии с предпочтительным воплощением изобретения гуманизированное антитело или его производные соединения или функциональные фрагменты характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один CDR, выбранный среди CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID №№4, 5 или 6, или по меньшей мере один CDR последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентична после оптимального выравнивания последовательностям SEQ ID №№4, 5 или 6; или они содержат легкую цепь, содержащую по меньшей мере один CDR, выбранный среди CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID №№7, 8 или 9, или по меньшей мере один CDR последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентична после оптимального выравнивания последовательностям SEQ ID №№7, 8 или 9.

Предпочтительным образом гуманизированные антитела изобретения или одно из их производных соединений или функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где:

- CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID №4 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №4;

- CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID №5 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №5; и

- CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID №6 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №6.

В соответствии с частным воплощением антитела или одно из их производных соединений или функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую CDR-H1 с последовательностью SEQ ID №4, CDR-H2 с последовательностью SEQ ID №5 и CDR-H3 с последовательностью SEQ ID №6.

Еще более предпочтительно антитела изобретения или одно из их производных соединений или функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:

- CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID №7 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №7;

- CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID №8 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №8, и

- CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID №9 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №9.

В соответствии с частным воплощением антитела или одно из их производных соединений или функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат легкую цепь, содержащую CDR-L1 с последовательностью SEQ ID №7, CDR-L2 с последовательностью SEQ ID №8 и CDR-L3 с последовательностью SEQ ID №9.

В данном описании термины «полипептиды», «полипептидные последовательности», «пептиды» и «белки», применяемые по отношению к соединениям антителам или их последовательностям, являются взаимозаменяемыми.

Здесь следует понимать, что изобретение не относится к антителам в природной форме, то есть они взяты не из их природной среды, но они выделены или получены путем очистки из природных источников, либо получены путем генетической рекомбинации, либо путем химического синтеза, и, таким образом, они могут содержать неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.

Уникальная нумерация IMGT была создана для сравнения вариабельных доменов независимо от антигенного рецептора, типа цепи или вида [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, С., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда занимают одну и ту же позицию, например цистеин 23 (1-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2-CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT предусматривает стандартизированное разграничение каркасных участков (FR1-IMGT: позиции 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 и FR4-1MGT: 118-128) и участков, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 и CDR3-IMGT: 105-117. Т.к. разрывы представляют собой незанятые позиции, то длины CDR-IMGT (показаны в скобках и разделены точками, например [8.8.13]) становятся важной информацией. Уникальная нумерация IMGT используется в 2D-графических представлениях, обозначенных как IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в 3D-структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Существует три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. Термин «CDR» в единственном или множественном числе используется здесь для обозначения в зависимости от случая одного из этих участков или нескольких, или даже всех этих участков, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинное связывание антитела с антигеном или эпитопом, который оно распознает.

В контексте данного изобретения «процент идентичности» двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей обозначает процент идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков в двух сравниваемых последовательностях, полученный после оптимального выравнивания; этот процент не чисто статистический, и различия между двумя последовательностями распределяются случайным образом по всей их длине. Сравнение двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей традиционно проводится путем сравнения этих последовательностей после выравнивания их оптимальным образом; указанное сравнение может осуществляться по сегментам или с помощью «окна выравнивания». Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть осуществлено, в дополнение к ручному, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита-Уотермана (1981) [Ad. App. Math. 2:482], с помощью алгоритма локальной гомологии Нидлмана-Вунша (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], с помощью способа поиска сходства Пирсона и Липмана (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444) или с помощью компьютерного программного обеспечения с использо