Специфические к опухоли антитела и их применение

Специфические к опухоли антитела и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка является заявкой в частичное продолжение заявки США на патент с серийным номером 12/924,952, поданной 8 октября 2010 г., которая сама претендует на преимущества предварительной заявки США на патент с серийным номером 61/249,634, поданной 8 октября 2009 г.Каждая из этих заявок полностью включена в данную заявку посредством отсылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, связанных с настоящим изобретением, был представлен в Ведомство США по патентам и торговым знакам, действующее в качестве международного получающего ведомства, в электронном виде в виде текстового файла объемом двадцать один (21) Кб в кодировке ASCII, созданного 25 мая 2011 г. и озаглавленного "1276_5PCT_ST25.txt". Этот перечень последовательностей, поданный при помощи EFS-Web, полностью включен в данную заявку посредством отсылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Описанное в данной заявке изобретение относится к выделенным антителам или их фрагментам и их производным, которые связываются с антигенами, находящимися в опухолях, и к способам их применения. Согласно некоторым вариантам данное изобретение относится к выделенным антителам или их фрагментам и их производным, которые связывают член семейства эпителиальных муцинов MUC1, и к способам их применения для обнаружения опухолей, нацеливания на опухоли и клетки опухолей и лечения опухолей и их клеток, включая, но без ограничения, циркулирующие опухолевые клетки (СТС) и раковые стволовые клетки (CSC).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак поджелудочной железы занимает четвертое и пятое место как причина смерти от рака среди мужчин и женщин, соответственно, после смерти от рака легкого, рака толстой кишки и рака простаты у мужчин и после смерти от рака легкого, рака молочной железы, рака толстой кишки и рака яичника у женщин. Пациенты, у которых болезнь прогрессировала, с трудом поддаются лечению. Хирургия является единственным методом радикального лечения, однако, местное поражение с распространением на отдаленные органы возникает более чем у 80% от общего количества пациентов. Для увеличения количества выздоровевших пациентов необходимы попытки разработать более эффективные способы вмешательства.

Часто опухолевое превращение приводит к изменениям процесса экспрессии различных полипептидов в опухолевых клетках. Например, некоторые муцины и мутантные формы полипептидов онкогена K-ras сверхэкспрессируются в 90% клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (далее обозначаемой как "PDA"), и становятся мишенями для терапевтического вмешательства.

Однако до настоящего времени вакцины, которые нацелены на эти полипептиды, оказались не особенно успешными при проведении клинических испытаний. Вакцины не генерируют длительно сохраняющуюся иммунную память, вероятно, по меньшей мере частично, из-за наличия опухолей, адаптирующихся таким образом, который позволяет им избежать иммунного распознавания и гибели.

Некоторые агенты, которые могут модулировать иммунную переносимость, были испытаны в клинических условиях, но результаты были весьма скромными, возможно, из-за недостаточного количества агентов, достигающих места расположения опухоли и/или из-за того, что агенты сами приводят к появлению нежелательных побочных эффектов, таких, которые могут возникать вследствие их связывания с нормальными клетками.

Кроме того, основная цель лечения онкологических заболеваний заключается не только в лечении первичного заболевания, но и в предотвращении образования метастаз. В настоящее время считается, что метастатический процесс может возникнуть из-за миграции злокачественных клеток, часто называемых опухолевыми стволовыми клетками или раковыми стволовыми клетками, из расположения первичной опухоли к другим участкам, где они могут инфильтрировать в этот участок и образовать новые опухоли (см., например. Bonnet & Dick, 1997; Reya et al., 2001; Al-Hajj et al., 2003; Pardal et al., 2003; Dontu et al., 2004; Singh et al., 2004; Brabletz et al., 2005). В результате, было бы очень желательно уметь идентифицировать и удалять эти клетки, если они есть у пациента.

Таким образом, существует необходимость в создании новых композиций и способов обнаружения, нацеливания и лечения опухолей и опухолевых клеток.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В этом разделе перечислены несколько вариантов данного изобретения и во многих случаях вариации и комбинации этих вариантов. Этот раздел просто описывает примеры многочисленных и различных вариантов. Упоминание одного или более признаков данного варианта также является только примером. Такой вариант может обычно существовать при наличии упомянутого признака(-ов) или без него (них); точно также эти признаки могут быть применены в других вариантах данного изобретения, независимо от того, упомянуты они в этом разделе или нет. Для того, чтобы избежать повторений, в этом разделе перечислены не все возможные комбинации этих признаков.

Согласно различным вариантам данное изобретение предусматривает следующее:

Выделенные антитела, а также их фрагменты и их производные, которые специфически связываются с муцином-1 (MUC1) и с мутантными полипептидами онкогена K-ras, находящегося в эпителиальных опухолях.

Выделенные нуклеиновые кислоты, которые кодируют выделенные антитела по данному изобретению и/или их последовательности.

Антитела, такие как моноклональные антитела и/или их пептиды, их фрагменты и/или их производные, которые связываются специфически с опухолями, такими как эпителиальные опухоли, включая опухоли поджелудочной железы, опухоли яичника, опухоли молочной железы, колоректальные новообразования и метастазы, вызванные этими опухолями.

Антитела, а также их фрагменты и производные, которые связываются специфически с эпитопом, находящимся в полипептиде MUC1 и/или мутантном полипептиде K-ras^G12D, по некоторым вариантам с эпитопом, находящимся в полипептиде человеческого MUC1. Согласно некоторым вариантам такой эпитоп находится в любой из SEQ ID NO:1-3.

Антитела, а также их фрагменты и производные, которые связываются специфически с MUC1 (по некоторым вариантам с MUC1 человека) и с мутантным K-ras^G12D, образовавшимся при помощи белковых лизатов на мышиной модели, которая представляет MUC1 и мутантный K-ras^G12D как опухоль-ассоциированные антигены.

Химерные молекулы, представляющие собой антитела, а также их фрагменты и их производные, присоединенные к эффекторам и/или иммуномоделирующим агентам, при этом антитела или их фрагменты или их производные связываются специфически с эпитопами, находящимися на полипептиде MUC1 и/или на полипептиде мутантного K-ras. Согласно некоторым вариантам эффекторы выбираются из группы, состоящей из эпитопных меток, вторичных антител (или их фрагментов или их производных), меток, цитотоксинов, липосом, радионуклидов, лекарств, пролекарств и хелатов, и иммуномоделирующий агент выбран из иммуномодуляторов, перечисленных, например, в Таблице 3.

Антитела, а также их фрагменты и производные, соединенные с иммуномоделирующим агентом; например, иммуномоделирующими агентами, перечисленными в Таблице 3.

Антитела, а также их фрагменты и производные, соединенные с диагностическими агентами.

Антитела, а также их фрагменты и их производные, содержащиеся в композициях, которые содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или эксципиентов.

Способы индукции иммунных ответов, которые согласно некоторым вариантам включают введение антител, их фрагментов и/или их производных и/или композиций, описанных в данной заявке, субъекту, такому как, но без ограничения, человек.

Способы обнаружения раковых клеток, включающие введение субъекту, такому как, но без ограничения, человек, антитела или его фрагмента или его производного, соединенного с детектируемой меткой, которые связываются специфически с полипептидом MUC1 и/или мутантным полипептидом K-ras.

Гибридные клетки (гибридомы), которые продуцируют антитела, их фрагменты и/или их производные согласно данному изобретению, такие как, но без ограничения, моноклональные антитела, которые связываются специфически с полипептидом MUC1, мутантным полипептидом K-ras^G12D или с обоими полипептидами.

Вакцины против эпителиального рака, включающие антитела, их фрагменты и/или производные согласно данному изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или эксципиентов, а также один или более иммуномоделирующих агентов.

Более конкретно, согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает антитела, их фрагменты и/или их производные, содержащие гипервариабельные (определяющие комплементарность) области (CDR) моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам выделенные антитела или их фрагменты или их производные являются поликлональными. Согласно некоторым вариантам выделенные антитела или их фрагменты или их производные являются моноклональными. Согласно некоторым вариантам выделенные антитела или их фрагменты или их производные являются человеческими или гуманизированными. Согласно некоторым вариантам выделенные антитела или их фрагменты или их производные выбраны из группы, состоящей из (а) моноклонального антитела, продуцированного гибридомной клеточной линией TAB-004, депонированной в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC)), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America, 16 декабря 2010 г.под номером доступа РТА-11550; (б) химерных антител или их фрагментов или их производных; (в) гуманизированных антител или их фрагментов или их производных; (г) одноцепочечных антител или их фрагментов или их производных; и (д) фрагментов Fab, при этом химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела или фрагменты Fab содержат CDR моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам выделенных антител или их фрагментов или их производных CDR содержат один или более следующих фрагментов: (i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:8; (ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:9; (iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:10; (iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID NO:11; (v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID NO:12; и (vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам выделенных антител или их фрагментов или их производных вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:5 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:4; и/или вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:7 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:6.

Настоящее изобретение предусматривает также композиции, содержащие описанные в данной заявке антитела или их фрагменты или их производные, и один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или эксципиентов. Согласно некоторым вариантам один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или эксципиентов приемлемы для применения для людей.

Настоящее изобретение предусматривает также композиции, содержащие описанные в данной заявке антитела или их фрагменты или их производные, конъюгированные с активным агентом. Согласно некоторым вариантам активный агент выбран из группы, состоящей из радиоактивной молекулы, радионуклида, молекулы сенсибилизатора, визуализирующего средства, радиоизотопа, токсина, цитотоксина, антиангиогенного агента, противоопухолевого агента, химиотерапевтического агента, иммуномодулирующего агента, цитокина, репортерной группы и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам радиоизотоп выбран из группы, состоящей из ¹⁰В, ²¹¹At, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S и ³H Согласно некоторым вариантам иммуномодулирующий агент выбран из группы, состоящей из ингибитора индоламин 2,3-диоксигеназы (IDO), возможно, 1-метил- DL-триптофана (1МТ); антагониста рецептора ЕР2/ЕР4; ингибитора циклооксигеназы, возможно, индометацина; и активатора дендритных клеток, возможно, олигодезоксинуклеотидов CpG (CpG ODN).

Данное изобретение предусматривает также наборы, содержащие описанные в данной заявке антитела или их фрагменты или их производные. Согласно некоторым вариантам описанные в данной заявке наборы включают инструкции по применению антител или их фрагментов или их производных, описанных в данной заявке.

Настоящее изобретение предусматривает также средства доставки для применения при нацеленной доставке активных агентов к опухолевым клеткам. Согласно некоторым вариантам носитель для доставки активных агентов содержит один или более агентов для нацеливания на мишени, которые представляют собой описанные в данной заявке антитела, или их фрагменты и их производные. Согласно некоторым вариантам активный агент представляет собой радиоактивную молекулу, радионуклид, молекулу сенсибилизатора, визуализирующий реагент, радиоизотоп, токсин, цитотоксин, антиангиогенный агент, противоопухолевый агент, химиотерапевтический агент, иммуномодулирующий агент, цитокин, репортерную группу или их комбинацию.

Настоящее изобретение предусматривает также выделенные клетки, которые продуцируют антитела, описанные в данной заявке или их фрагменты или их производные. Согласно некоторым вариантам выделенная клетка представляет собой гибридому, которая продуцирует описанные в данной заявке антитела. По некоторым вариантам гибридома является клеточной линией с номером доступа РТА-11550, которая была депонирована 16 декабря 2010 г. в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC)), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America), по условиям Будапештского договора.

Данное изобретение предусматривает также способ обнаружения наличия эпитопа, с которым связывается моноклональное антитело TAB-004 в биологическом образце. Согласно некоторым вариантам способы включают: контактирование биологического образца с одним или более описанными в данной заявке выделенными антителами или их фрагментами или их производными; и детектирование эпитопа, с которым в биологическом образце связано моноклональное антитело TAB-004. Согласно некоторым вариантам выделенные антитела или их фрагменты или их производные связываются с эпитопом, который находится в полипептиде муцина (MUC1) и/или с эпитопом, который находится в полипептиде K-ras, возможно, в полипептиде мутантного K-ras.

Данное изобретение предусматривает также способы получения антитела или его фрагмента или его производного. Согласно некоторым вариантам способы включают культивирование выделенной клетки по изобретению или гибридомы по изобретению в таких условиях, что происходит экспрессия указанного антитела или его фрагмента или его производного; и выделение указанных антитела или его фрагмента или его производного из клетки или гибридомы и/или из среды, в которой происходит рост клетки или гибридомы.

Данное изобретение предусматривает также способы обнаружения опухоли и/или раковой клетки у субъекта. Согласно некоторым вариантам эти способы включают контактирование биологического образца в организме субъекта или образца, выделенного у субъекта, с композицией, которая содержит описанное в данной заявке антитело или его фрагмент или его производное, в условиях, достаточных для связывания описанного в данной заявке антитела или его фрагмента или его производного с эпитопом, находящимся в опухоли и/или в раковой клетке, если они имеются в биологическом образце; и обнаружение наличия связывания описанного в данной заявке антитела или его фрагмента или его производного с эпитопом, при этом указанное обнаружение является показателем наличия опухоли и/или раковой клетки у субъекта. Согласно некоторым вариантам опухоль и/или раковая клетка представляет клетку опухоли поджелудочной железы, молочной железы, яичника, толстой кишки или прямой кишки и/или метастатическую клетку, порожденную этими опухолями, которая, возможно, экспрессирует MUC1, мутантный K-ras или и то, и другое. Согласно некоторым вариантам описанное в данной заявке антитело или его фрагмент или его производное связывается с детектируемой меткой, содержащей визуализирующее средство, которое по некоторым вариантам выбирается из группы, состоящей из парамагнитного, радиоактивного или флуорогенного ионов.

Согласно некоторым вариантам радиоактивный визуализирующий агент выбран из группы, состоящей из гамма-излучателей, излучателей позитронов и источников рентгеновского излучения. Согласно некоторым вариантам радиоактивный визуализирующий агент выбран из группы, состоящей из ⁴³K, ⁵²Fe, ⁵⁷Со, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁷Br, ⁸¹Rb/⁸¹MKr, ^87MSr, ^99MTc, ¹¹¹In, ¹¹³In, ¹²³I, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹²⁷Cs, ¹²⁹Cs, ¹³¹I, ¹³²I, ¹⁹⁷Hg, ²⁰³Pb и ²⁰⁶Bi. Согласно некоторым вариантам биологический образец представляет собой образец крови или фракцию крови.

Данное изобретение предусматривает также способы лечения опухоли у субъекта. Согласно некоторым вариантам эти способы включают введение субъекту композиции, содержащей описанное в данной заявке антитело или его фрагмент или его производное, связанное с активным агентом, при этом активный агент контактирует с опухолью с целью лечения этой опухоли. Согласно некоторым вариантам активный агент представляет собой терапевтический агент, возможно, химиотерапевтический агент, токсин, радиотерапевтический агент или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам химиотерапевтический агент выбран из группы, состоящей из противоопухолевого лекарства, цитокина, антиметаболита, алкилирующего агента, гормона, метотрексата, доксорубицина, даунорубицина, цитозин-арабинозида, этопозида, 5-флуороурацила, мелфалана, хлорамбуцила, мустаргена, циклофосфамида, цисплатина, виндесина, алкалоидов винка, митомицина, блеомицина, пуротионина, макромомицина, производных 1,4-бензохинона, тренимона, стероидов, аминоптерина, антрациклинов, демекольцина, этопозида, митрамицина, доксорубицина, дауномицина, винбластина, неокарциностатина, макромицина, а-аманитина и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам токсин выбирают из группы, состоящей из яда гадюки Рассела, активированного фактора IX, активированного фактора X, тромбина, фосфолипазы С, фактора яда кобры, рицина, А-цепи рицина, экзотоксина Pseudomonas, токсина дифтерии, бычьей панкреатической рибонуклеазы, антивирусного белка лаконоса, абрина, А- цепи абрина, гелонина, сапорина, модецина, вискумина, волкенсина и их комбинаций. Согласно некоторьм вариантам радиотерапевтический агент выбирают из группы, состоящей из ⁴⁷Sc, ⁶⁷Cu, ⁹⁰Y, ¹⁰⁹Pd, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ²¹¹At, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ³²P, ³³P, ⁷¹Ge, ⁷⁷As, ¹⁰³Pb, ¹⁰⁵Ph, ¹¹¹Ag, ¹¹⁹Sb, ¹²¹Sn, ¹³¹Cs, ¹⁴³Pr, ¹⁶¹Tb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹¹Os, ^193MPt и ¹⁹⁷Hg.

Данное изобретение предусматривает также способы подавления роста опухоли у субъекта. Согласно некоторым вариантам способы включают введение субъекту, имеющему опухоль, эффективного количества описанного в данной заявке антитела или его фрагмента или его производного, содержащего определяющие комплементарность области (CDR) моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы, молочной железы, яичника, толстой кишки или прямой кишки и/или метастатическую клетку, порожденную этими опухолями, которая, возможно, экспрессирует MUC1, мутантный K-ras или и то, и другое. Согласно некоторым вариантам CDR в TAB-004 содержат один или более следующих фрагментов: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:8; CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:9; CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:10; CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID NO:11; CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID NO:12; и/или CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:5 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:4, и/или вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:7 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:6.

Что касается способов лечения, описанных в данной заявке, согласно некоторым вариантам способы включают также применение для субъекта одного или более видов противоопухолевой терапии. Согласно некоторым вариантам один или более видов противоопухолевой терапии выбраны из группы, состоящей из радиотерапии, химиотерапии, дополнительной иммунотерапии, противовоспалительной терапии и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам противовоспалительная терапия включает введение субъекту ингибитора циклооксигеназы, возможно, специфического ингибитора циклооксигеназы-2. Согласно некоторым вариантам один или более видов дополнительной противоопухолевой терапии включает введение субъекту гемцитабина (4-амино-1-(2-дезокси-2,2-дифтор-β-D-эритро-пентафуранозил)пиримидин-2(1Н)-он-2′,2′-дифтор-2′-дезоксицитидина) и целекоксиба (4-[5-(4-метилфенил)-3-(трифторметил)пиразол-1-ил]бензосульфонамида) или фармацевтически приемлемых солей любого из них или обоих.

Данное изобретение включает также способы очистки раковых стволовых клеток. Согласно некоторым вариантам эти способы включают обеспечение популяции клеток, у которых подозревают наличие раковых стволовых клеток; идентификацию субпопуляции клеток, которые связываются с антителом, его фрагментом или его производным, содержащим CDR моноклонального антитела TAB-004; и очистку этой субпопуляции. Согласно некоторым вариантам такая популяция клеток содержит циркулирующие клетки, выделенные из организма субъекта, у которого имеются опухоль и/или раковое заболевание. Согласно некоторым вариантам описанные в данной заявке способы включают также удаление клеток позитивной линии (lin⁺) из популяции клеток перед стадией идентификации и/или после стадии очистки.

Данное изобретение предусматривает также способы нацеливания активных агентов на циркулирующие раковые стволовые клетки у субъектов. Согласно некоторым вариантам эти способы включают контактирование циркулирующих раковых стволовых клеток с композицией, содержащей описанное в данной заявке антитело или его фрагмент или его производное, которые содержат CDR моноклонального антитела TAB-004 и один или более активных агентов, при этом возможно, что один или более активных агентов представляют собой терапевтический агент, в том числе химиотерапевтический агент, токсин, радиотерапевтический агент или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам терапевтический агент представляет собой иммуномодулирующий агент, при этом возможно, что иммуномодулирующий агент выбран из группы, состоящей из ингибитора индоламин 2,3-диоксигеназы (IDO), например, 1-метил- DL-триптофана (1МТ); антагониста рецептора ЕР2/ЕР4 и активатора дендритных клеток, в том числе CpG-олигонуклеотидов (CpG ODN).

Данное изобретение предусматривает также способы прогнозирования рецидивов рака у субъекта, который подвергался лечению от рака. Согласно некоторым вариантам эти способы включают выделение биологического образца, содержащего циркулирующие клетки, из организма субъекта; контактирование биологического образца с описанными в данной заявке антителами или их фрагментами и их производными в условиях, достаточных для связывания антител или их фрагментов и их производных с эпитопом, содержащимся в опухоли и/или в раковой клетке, если они имеются в биологическом образце; и идентификацию в биологическом образце одной или более циркулирующих клеток, которые связываются с указанным антителом, его фрагментом или его производным, при этом у субъекта прогнозируется рецидив. Согласно некоторым вариантам биологический образец представляет собой кровь или ее фракцию. Согласно некоторым вариантам раковое заболевание представляет собой рак поджелудочной железы или рак молочной железы. Согласно некоторым вариантам антитела, их фрагменты или их производные выбраны из группы, состоящей из моноклональных тел, продуцируемых гибридомной клеточной линией TAB-004 с номером доступа РТА-11550, которая была депонирована 16 декабря 2010 г.в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC)), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America) по условиям Будапештского договора; химерных антител или их фрагментов и их производных; человеческих антител или их фрагментов и их производных; гуманизированных антител или их фрагментов и их производных; одноцепочечных антител или их фрагментов и их производных; и фрагментов Fab, при этом химерные антитела или их фрагменты и их производные, человеческие антитела или их фрагменты и их производные, гуманизированные антитела или их фрагменты и их производные, одноцепочечные антитела или их фрагменты и их производные и фрагменты Fab содержат определяющие комплементарность области (CDR) моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам CDR моноклонального антитела TAB-004 содержат следующие аминокислотные последовательности: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:8; CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:9; CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:10; CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID NO:11; CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID NO:12; и/или CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:5 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:4, и/или вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:7 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:6.

Данное изобретение предусматривает также способы прогнозирования прогрессирования рака у субъекта. Согласно некоторым вариантам эти способы включают выделение биологического образца, содержащего циркулирующие клетки, из организма субъекта; контактирование этого биологического образца с описанным в данной заявке антителом, его фрагментом или его производным в условиях, достаточных для связывания антител или их фрагментов и их производных с эпитопом, содержащимся в опухоли и/или в раковой клетке, если они имеются в биологическом образце; и идентификацию в биологическом образце одной или более циркулирующих клеток, которые связываются с указанными антителом, его фрагментом или его производным, при этом прогнозируется прогрессирование рака у субъекта. Согласно некоторьм вариантам биологический образец представляет собой кровь или ее фракцию. Согласно некоторым вариантам раковое заболевание представляет собой рак поджелудочной железы или рак молочной железы. Согласно некоторым вариантам антитела, их фрагменты или их производные выбраны из группы, состоящей из моноклональных тел, продуцируемых гибридомной клеточной линией TAB-004 с номером доступа РТА-11550, которая была депонирована 16 декабря 2010 г. в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC)), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America) по условиям Будапештского договора; химерных антител или их фрагментов и их производных; человеческих антител или их фрагментов и их производных; гуманизированных антител или их фрагментов и их производных; одноцепочечных антител или их фрагментов и их производных; и фрагментов Fab, при этом химерные антитела или их фрагменты и их производные, человеческие антитела или их фрагменты и их производные, гуманизированные антитела или их фрагменты и их производные, одноцепочечные антитела или их фрагменты и их производные и фрагменты Fab содержат определяющие комплементарность области (CDR) моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам CDR моноклонального антитела TAB-004 содержат следующие аминокислотные последовательности: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:8; CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:9; CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:10; CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID NO:11; CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID NO:12; и/или CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:5 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:4, и/или вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:7 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:6. Согласно некоторым вариантам прогрессирование ракового заболевания представляет собой метастазирование опухолей у субъекта.

Данное изобретение предусматривает также выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, включающие любую из последовательностей SEQ ID ID NO:4 и 6, и/или кодирующие любую из последовательностей SEQ ID NO:5 и 7-13.

Согласно некоторым вариантам данного изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержится в векторе, который, согласно некоторым вариантам, представляет собой экспрессионный вектор. Согласно некоторым вариантам выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержится в экспрессионном векторе, который функционально связан с одной или более нуклеотидными последовательностями, кодирующими последовательности молекул антител таким образом, что после введения вектора экспрессии в соответствующую клетку-хозяина интактное рекомбинантное антитело, содержащее одну или более последовательностей SEQ ID NO:5 и 7-13, или его фрагмент или его производное, экспрессируется в клетке-хозяине.

Таким образом, одна из целей данного изобретения состоит в получении выделенных антител, их фрагментов или их производных, которые связываются с антигенами, находящимися в опухолях. Помимо цели данного изобретения, указанной выше и достигнутой полностью или частично при помощи композиций и способов, описанных в данной заявки, имеются и другие цели, которые станут очевидными из следующего описания и прилагаемых Фигур, которые описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигурах 1А и 1В приведен ряд микрофотографий, показывающих специфическое связывание антитела, описанного в данной заявке, с опухолями поджелудочной железы человека и мыши. Темные пятна показывают положительное связывание этого антитела с клетками, содержащимися в образце. На Фигуре 1А приведен ряд микрофотографий, показывающих специфическое связывание антитела, описанного в данной заявке, с опухолями поджелудочной железы человека на стадиях 0 (в качестве контрольного образца применялась нормальная ткань поджелудочной железы) и 2-4. На Фигуре 1В приведен ряд микрофотографий, показывающих специфическое связывание антитела, описанного в данной заявке, со спонтанными опухолями, имеющимися в поджелудочной железе трансгенных мышей в возрасте 6, 16, 26 и 34 нед, клетки которых содержат трансген человеческого MUC1 и мутацию K-ras^G12D.

На Фигурах 2А-2С приведен ряд микрофотографий, показывающих специфическое связывание антитела, описанного в данной заявке, с тканью опухоли молочной железы у человека (Фигуры 2А и 2В), но не с нормальной тканью молочной железы (Фигура 2С).

Фигура 3 показывает схематически (верхняя левая панель) подход к созданию линии трижды трансгенных мышей, которая экспрессирует фермент, Cre-рекомбиназу, по всей поверхности поджелудочной железы, мутантный полипептид онкогена K-ras и полипептид человеческого MUC1. У этой мыши развивалась аденокарцинома поджелудочной железы (панкреатическая аденокарцинома), клетки которой использовали для получения линии клеток первичной опухоли КСМ (нижняя панель). Клеточная линия КСМ использовалась для определения связывания антитела по данному изобретению (обозначенного на Фигуре как "TAB" и в данном описании как "TAB-004") или самого этого антитела, или этого антитела, связанного с CpG-олигодезоксинуклеотидами (CpG ODN). Было установлено, что и несвязанные антитела, и конъюгированные антитела связывались с клеточной линией рака поджелудочной железы КСМ с одинаковым сродством (верхняя правая панель).

На Фигурах 4А и 4В приведены графики, показывающие, что антитело по изобретению (TAB-004) повышало цитотоксичность клеток-природных киллеров (NK) в процессе гибели целевых опухолевых клеток. Соединение этого антитела с CpG ODN еще более усиливало этот эффект, тем самым показывая, что это антитело было способно усиливать противоопухолевый иммунный ответ in vivo. Фигура 4А представляет линейный график, показывающий, что антитело TAB-004 ускоряло специфический лизис опухолевых клеток линии КСМ при различном отношении эффектор (NK-клетки)-мишень (отношение Е:Т) по сравнению с отрицательным контролем (минус антитело TAB-004). На Фигуре 4В представлена гистограмма, показывающий, что соединение антитела TAB-004 с CpG ODN еще более ускоряло специфический лизис опухолевых клеток при различных отношениях Е:Т по сравнению с не присоединившимся антителом.

Фигуры 5А и 5В иллюстрируют результаты экспериментов по определению способности антитела по изобретению (TAB-004) и его конъюгатов снижать объем развившейся опухоли КСМ у трансгенных мышей с геном MUC1 (MUC1 Tg).

На Фигуре 5А приведен линейный график, показывающий величины объема опухолей (в мм, измерен с помощью штангенциркуля с цифровой индикацией) у мышей, которым вводили только физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) (отрицательный контроль, закрашенные прямоугольники), только CpG ODN (X′s), несвязанное антитело TAB-004 (незакрашенные кружочки) или конъюгат TAB-004-CpG ODN (закрашенные кружочки).

На Фигуре 5 В приведена гистограмма, показывающая изменение величины объема опухолей у мышей на 19 и 27 день после последнего введения вещества. Следует отметить, что на 19 и 27 день после последнего введения вещества величина объема опухоли у мышей, которым вводили TAB-004-CpG ODN, не увеличилась по сравнению с контрольными мышами (то есть, теми, которым вводили только PBS, только CpG ODN или только антитело TAB-004). *:p<0.5. Только PBS (отрицательный контроль; столбцы не закрашены); только CpG ODN (заштрихованные столбцы); несвязанное антитело TAB-004 (столбцы заштрихованы темными линиями); конъюгат TAB-004-CpG ODN (столбцы заштрихованы накрест),

На Фигуре 6 приведено схематическое изображение типичных композиций по изобретению и их применение. ADCC - антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность; CDC - комплемент-зависимая цитотоксичность; ADEPT - антитело-опосредованная терапия с использованием ферментов и пролекарств.

На Фигурах 7А и 7В приведены гистограммы, показывающие разделение клеток CD133⁺ (Фигура 7А) по сравнению с клетками CD24⁺/CD44⁺/EpCAM⁺ (Фигура 7В) методом флуоресцентно-активированного клеточного сортинга (FACS) и степень, до которой антитело TAB-004, описанное в данной заявке, связалось с этими популяциями. Черточки слева на каждой панели соответствуют сортингу с отрицательным контролем и черточки справа - сортингу с антителом TAB-004.

На Фигурах 8A-8D показаны диаграммы рассеяния для FACS, иллюстрирующие связывание антитела TAB-004 с клетками опухоли поджелудочной железы ("Tumor 1") и соседней нормальной ткани ("Normal") с применением антитела TAB-004 и антитела против СХС- хемокинового рецептора 4 (CXCR4). MUC1: антитело TAB-004; CXCR4: антитело против CXCR4; FL1-H: интенсивность для флуоресцентного красителя 1 (Flourescein-FITC); FL2-H: интенсивность для флуоресцентного красителя 2 (Phycoerythrin-PE); SSC-H: интенсивность бокового светорассеяния; FSC-H: интенсивность в прямом направлении рассеяния; FL4-H: интенсивность для флуоресцентного красителя 4 (Allophycocyanin-APC).

На Фигуре 8А показана диаграмма рассеяния, иллюстрирующая распределение клеток в отсутствие какого-либо антитела. На Фигуре 8В показана диаграмма рассеяния, иллюстрирующая распределение клеток, окрашенных с применением изотипического контроля. На Фигуре 8С приведен ряд графиков рассеяния, показывающих распределение клеток в нормальной ткани, окрашенных антителом TAB-004 в сравнении с антителом CXCR4. На Фигуре 8D приведен ряд графиков рассеяния, показывающих распределение клеток в ткани аденокарциномы поджелудочной железы, окрашенной антителом TAB-004 в сравнении с антителом CXCR4.

На Фигурах 9А-9С приведен ряд диаграмм рассеяния возбужденной флуоресценции сортированных клеток, которые показывают, что антитело TAB-004 по изобретению превосходит стандартное антитело ЕрСАМ при обнаружении циркулирующих опухолевых клеток у пациентов с раком поджелудочной железы. Неокрашенные клетки (самые темные линии слева); клетки, окрашенные ЕрСАМ-РЕ (0,1 мг/мл) (темно-серые линии); клетки, окрашенные антителом TAB-004 (0,1 мг/мл) (самые темные линии справа); клетки, окрашенные антителом ТАВ-004-РЕ (0,02 мг/мл) (светло-серые линии); клетки, окрашенные антителом ТАВ-004-РЕ (0,004 мг/мл) (линии серого цвета). Обозначение "-РЕ" показывает, что антитела были мечены фикоэритрином для проведения сортинга.

На Фигуре 9А показано, что клетки клеточных линий рака поджелудочной жел