Способ определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови по содержанию карбонильных групп в фибриновом сгустке

Способ определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови по содержанию карбонильных групп в фибриновом сгустке

Реферат

В развитии ряда патологических состояний: ишемия, воспаление и многих заболеваний, таких как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, гипертония, нейродегенеративные, онкологические заболевания ведущую роль играет активация генерации свободных радикалов - окислительный стресс. Современные исследования неоспоримо доказывают, что окислительный стресс предшествует развитию вышеуказанных заболеваний, а измерение маркеров окислительного стресса может быть положено в основу методов прогноза развития и прогрессирования заболеваний. Белки организма являются чувствительными мишенями для активных форм кислорода, а белки плазмы крови, которые также вовлекаются в процессы свободно-радикального повреждения, представляют собой еще и удобный объект для клинико-биохимической диагностики состояний, этиопатогенез которых связан с оксидативным стрессом.

Изобретение относится к области медицины, к клинико-биохимической лабораторной диагностике, а именно к способам определения модифицированных белков и предназначается для селективного количественного определения степени окислительной модификации фибриногена в клинических образцах плазмы крови по содержанию карбонильных групп в фибриновом сгустке.

Не существует единого показателя степени окислительной модификации белков. С этой целью можно регистрировать различные химические или физико-химические изменения белковой молекулы в условиях окислительного стресса, которые будут отражать степень ее повреждения активными формами кислорода. Определение карбонильных групп аминокислотных остатков, образующихся при окислении белков, имеет ряд практических преимуществ по сравнению с другими подходами, а их содержание в белке рассматривается как наиболее адекватный и надежный показатель, количественно характеризующий выраженность химических изменений в структуре белка в зависимости от интенсивности окислительных свободно-радикальных процессов. Согласно оценке, основанной на обобщении литературных данных об окислительной модификации белков in vivo, уровень карбонильных продуктов окисления белков (карбонильных групп) при патологических процессах, сопряженных с окислительным стрессом, возрастает в 2-8 раз (Shacter Е. Quantification and significance of protein oxidation in biological samples. Drug Metabolism Reviews. 2000. V. 32. №3-4. P. 307-326).

В работе Shacter E. и соавторов (1994 г.) было показано, что фибриноген «окисляется» значительно быстрее, чем другие белки при окислении цельной плазмы in vitro в системе железо/аскорбиновая кислота. Содержание карбонильных продуктов окисления (количество карбонильных групп на 1 моль белка) в условиях этого эксперимента для фибриногена составило 9.7 моль/моль, а для альбумина, глобулинов и трансферина - 0.5, 0.6 и 0.8 моль/моль, соответственно (Shacter, Е.; Williams, J.A.; Lim, М.; Levine, R.L. Differential susceptibility of plasma proteins to oxidative modification: examination by Western blot immunoassay. Free Radic. Biol. Med. 17:429-437; 1994).

В клинических исследованиях было показано, что окислительная модификация фибриногена у больных ИБС со стенокардией напряжения, часть из которых перенесла инфаркт, в среднем выше на 40% в сравнении с лицами без ИБС. В то же время окислительная модификация других белков плазмы у этих больных была лишь на 13% выше, чем в группе сравнения (Патент РФ №2298189).

Таким образом, при активации свободно-радикальных процессов окислительная модификация фибриногена идет более интенсивно по сравнению с другими белками плазмы крови.

Накопленные к настоящему времени сведения позволяют многим авторам рассматривать окисленный фибриноген не только как перспективный чувствительный маркер, характеризующий степень выраженности окислительного стресса в организме, но и как фактор, обладающий собственным патогенным действием, в частности при сердечно-сосудистых патологиях. Так, известно, что фибриноген относится к белкам острой фазы, его содержание резко возрастает при воспалительном процессе, который в свою очередь тесно связан с окислительным стрессом. Более высокий уровень фибриногена способствует более интенсивной агрегации тромбоцитов и эритроцитов, ведет к возрастанию вязкости крови. Окислительная же модификация фибриногена под действием активных форм кислорода приводит к изменению его многочисленных свойств и функций. Показано, что «окисленный» фибриноген в большей степени чем «нормальный» усиливает продукцию АФК активированными лейкоцитами, усиливает агрегацию тромбоцитов, активирует апоптоз клеток сосудистого эндотелия, оказывает влияние на параметры свертывания и реологические свойства крови, способствует повышению адгезивных свойств сосудистого эндотелия, что в конечном итоге приводит к формированию и росту атеросклеротической бляшки. Окислительная модификация фибриногена вызывает также изменение его основной функции - превращаться в фибрин и образовывать сгусток, то есть окислительный стресс через модификацию фибриногена вызывает изменение процессов тромбообразования (Азизова О.А., Пирязев А.П., Швачко А.Г. /Окислительная модификация фибриногена замедляет его превращение в фибрин под влиянием тромбина.// Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2009; 147(2): 160-163). Таким образом, прослеживается связь окисленного фибриногена с ключевыми звеньями патогенеза ряда сердечно-сосудистых заболеваний и развитием таких грозных осложнений, как инфаркты и инсульты. В этой связи важно отметить, что повышенное содержание фибриногена в плазме крови давно уже рассматривается как общепринятый независимый риск-фактор развития атеросклероза и его осложнений. Вместе с тем даже при нормальных величинах содержания фибриногена значительное повышение степени его окислительной модификации регистрируется у лиц с ИБС или с подострым инфарктом миокарда (Рагино Ю.И., Баум В.А., Полонская Я.В., Воевода М.И., Никитин Ю.П. /Атеросклероз и окислительные процессы. Новые способы оценки окислительной модификации белков. // Бюллетень СО РАМН, 2006, №4 (122): 67-74).

Таким образом, определение окислительной модификации фибриногена является более чувствительным и информативным диагностическим тестом, чем концентрация самого фибриногена в плазме крови. Однако клинические исследования в данном направлении ограничены существующим уровнем развития методов селективного определения окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови, пригодных для использования в клинико-лабораторной практике.

ДНФГ (2,4-динитрофенилгидразин) представляет собой классический реагент для определения карбонильных группы (С=О) альдегидов и кетонов.

Известен способ Levine R.L. и соавторов (R.L. Levine, D. Garland, С.N. Oliver, А. Amici, I. Climent, A. Lenz, B. Ahn, S. Shaltiel, and E.R. Stadtman /Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. // Methods of Enzymology, 1990, 186: 464-478), в котором ДНФГ-реакцию используют для определения карбонильных групп в белках из тканей и клеточных культур. В результате реакции 2,4-динитрофенилгидразина с карбонильными продуктами окисления (карбонильными группами) белков, к последним через ковалентную связь присоединяются производные 2,4-динитрофенилгидразона, имеющие характерный спектр поглощения. Содержание карбонильных групп в белке пропорционально оптической плотности образовавшихся динитрофенилгидразонов, измеряемой, как правило, при длине волны 370 нм. Способ Levine R.L. и соавторов (1990 г.) по настоящее время является базовым для многочисленных модификаций спектрофотометрического метода определения карбонильных продуктов окисления белков по реакции с ДНФГ. Среди этих модификаций следует выделить методы, которые были целенаправленно разработаны для определения карбонильных продуктов окисления белков сыворотки и плазмы, такие, как метод Дубининой Е.Е. и соавторов (1995 г.), метод Азизовой О.А. и соавторов (2007 г.). Оба эти метода дают интегральную характеристику степени окисления всех белков плазмы, то есть их суммарной фракции.

Известен способ селективного определения окислительной модификации белков плазмы крови, описанный в статье Shacter Е. и соавторов (1994 г.), при котором разделение белков плазмы проводят методом ДСН-гель электрофореза. Способ так же основан на применении ДНФГ-реакции, однако детекцию карбонильных групп в составе индивидуальных белков осуществляют в системе иммуноблоттинга. С этой целью используют антитела, специфические к динитрофенильным группам производных 2,4-динитрофенилгидразона на поверхности белковых молекул. Метод отличается высокой чувствительностью, как минимум в 100 раз превышающей чувствительность классического спектрофотометрического метода. Именно этим методом была показана более высокая окисляемость фибриногена по сравнению с альбумином и другими белками при металл-катализируемом окислении цельной плазмы (Shacter, Е.; Williams, J.A.; Lim, М.; Levine, R.L. Differential susceptibility of plasma proteins to oxidative modification: examination by Western blot immunoassay. Free Radic. Biol. Med. 17:429-437; 1994). Однако способ является сложным, длительным и трудоемким, требует наличия высокоспециализированного оборудования и дорогостоящих реактивов. Кроме того, данный способ, как указывают сами авторы, является, безусловно, полуколичественным. Указанные обстоятельства накладывают существенные ограничения на применение способа в практике клинических лабораторных исследований.

В отечественных исследованиях широкое применение нашел способ определения степени окисления белков в сыворотке крови человека, предложенный Дубининой Е.Е. и соавторами (Дубинина Е.Е., Бурмистров C.O., Ходов Д.А., Портов И.Г. /Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения. // Вопр мед хим 1995; 1: 24-26). При данном способе суммарную фракцию белков получают осаждением трихлоруксусной кислотой (ТХУ), а в качестве растворителя белкового осадка используют 8 М мочевину. Для анализа берут 0,05-0,1 мл сыворотки, добавляют 20% раствор ТХУ до объема 1 мл, затем приливают равный объем (1 мл) 0,01 М ДНФГ, растворенного в 2 М HCl. В контрольную пробу добавляют вместо ДНФГ равный объем 2 М HCl. Таким образом, конечная концентрация ТХУ и в контрольной, и в опытной пробе составляет около 10% (9,5-9,75%). Пробы инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, затем центрифугируют при 3000 g 15-20 мин. Осадок промывают 3 раза раствором этанол - этилацетат (1:1) для экстракции липидов и избытка ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. После высушивания к осадку приливают 2,5 мл 8 М мочевины и выдерживают на кипящей водяной бане в течение 5 мин до полного растворения. Оптическую плотность раствора регистрируют на спектрофотометре в области поглощения образовавшихся 2,4-динитрофенилгидразонов - продуктов реакции карбонильных производных окисления белков с 2,4-динитрофенилгидразином (ДНФГ). Степень окисления белков в сыворотке крови выражают в единицах оптической плотности на 1 мл сыворотки или на 1 мг белка.

Данный способ не является селективным, т.е. не позволяет определить степень окислительной модификации индивидуальных белков, в частности фибриногена, в плазме крови. В связи с этим происходит потеря клинически актуальной информации. Кроме того, выражение степени окислительной модификации белков в Ед оптической плотности/мл сыворотки или мг белка представляется крайне неудачным, так как не позволяет сопоставить результаты, полученные в различных исследованиях. Другим существенным недостатком известного способа является то обстоятельство, что белки сыворотки подвергаются действию 10% ТХУ в течение 1 часа при комнатной температуре. Как известно, ТХУ является сильным денатурирующим агентом, поэтому в биохимической практике осаждение белков с помощью ТХУ осуществляют строго на холоду, при 0°С или при отрицательной температуре, по возможности сводя к минимуму время экспозиции. Необратимая денатурация и агрегация белков может препятствовать как протеканию самой реакции с ДНФГ, так и приводить к ухудшению растворимости белка в мочевине (слипание осадка), что является потенциальной причиной отклонений в результатах и источником артефактов.

Известен способ определения окисляемости белков сыворотки и плазмы крови, разработанный Азизовой О.А. и соавторами, при котором окислительная устойчивость белков оценивается по накоплению карбонильных продуктов окисления белков в процессе медь-индуцированного окисления (О.А. Азизова, А.П. Пирязев, С.Н. Москвина / Метод определения окисляемости белков сыворотки и плазмы крови. // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53, №1, с. 99-106). Для определения степени окислительной модификации белков в данном способе к 0,2 мл исследуемых образцов плазмы или сыворотки добавляют 1,0 мл 0,0025 М ДНФГ, растворенного в 2,5 М HCl, а в контрольные образцы - 1,0 мл 2,5 М HCl. Все пробы инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте, затем добавляют 1 мл охлажденного 20% раствора ТХУ, выдерживают 10 мин в холодильнике и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Осадок промывают смесью этанол - этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Для этого к осадку добавляют 2 мл смеси этанол - этилацетат, центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Затем повторяют процедуру. Полученный осадок высушивают для удаления растворителей. Затем осадок растворяют в предварительно нагретых 2,0 мл 10 М раствора мочевины на кипящей водяной бане. Оптическую плотность опытных и контрольных растворов регистрируют на спектрофотометре при 370 нм. Концентрацию карбонильных продуктов рассчитывают по формуле: С (нмоль/мл)=(Abs370 нм·106/ε370 нм)·X, где С - концентрация карбонильных групп в плазме (нмоль/мл), Abs370 нм - оптическая плотность образца при λ=370 нм, ε370нм=22000М^-1 см^-1 - коэффициент молярной экстинкции при λ=370 нм, X - фактор разбавления. Содержание карбонильных продуктов пересчитывают на 1 мг белка или 1 мл плазмы. Для определения концентрации белка в плазме используют биуретовый метод.

Способ также является неселективным, поэтому не позволяет получить информацию о степени окисленности индивидуальных белков плазмы, таких как фибриноген, однако авторам данного способа удалось избежать недостатков, отмеченных выше для предыдущего способа.

В качестве прототипа заявляемого изобретения избран способ определения окислительной модификации фибриногена, при котором фибриноген изолируют из плазмы крови, используя его специфическое свойство превращаться в нерастворимый фибрин с образованием организованного сгустка, а содержание карбонильных групп в фибриновом сгустке определяют спектрофотометрическим методом по реакции с ДНФГ (Патент РФ №2298189). Способ является селективным, так как позволяет получить информацию о степени окислительной модификации индивидуального белка плазмы крови - фибриногена. Кроме того, как указывают авторы, способ занимает непродолжительное время исследования, его техническое выполнение весьма простое и работа осуществляется одним врачом-лаборантом, для его выполнения требуется только спектрофотометр и необходимые реактивы, способ может использоваться в условиях клинических биохимических лабораторий для оценки степени окисления фибриногена.

Согласно способу-прототипу сначала определяют концентрацию фибриногена: к 1 мл плазмы крови (3,8% цитрата) добавляют 0,5 мл 20 мМ раствора CaCl₂, далее пробу инкубируют на водяной при 37°С 10 минут, образовавшийся сгусток высушивают на бумажном фильтре, взвешивают на торсионных весах и пересчитывают его массу на концентрацию фибриногена в плазме в мг/мл с использованием коэффициента перерасчета 0,222 (гравиметрический метод определения содержания фибриногена в плазме, предложенный Рутберг Р.А. в 1961 г.). Затем к сгустку добавляют 0,5 мл 0,9% раствора NaCl и такой же объем 20% раствора ТХУ. Далее определяют окислительную модификацию сгустка по вышеописанному способу Дубининой Е.Е. и соавторов (1995 г.). Результаты выражают в Ед оптической плотности/мг фибриногена/мл плазмы.

К недостаткам способа-прототипа следует отнести недостатки самого метода Дубининой Е.Е. и соавторов (1995 г.), отмеченные выше. Это длительный контакт белка с ТХУ при комнатной температуре и использование некорректных единиц измерения карбонильных продуктов окисления белка. Поэтому технически более близким аналогом заявляемого изобретения в части модификации самого базового метода определения карбонильных групп белков Levine R.L. и соавторов (1990 г.) является способ Азизовой О.А. и соавторов (2007 г.).

Недостатком способа-прототипа является также активация свертывания плазмы хлоридом кальция, который используется в исходном гравиметрическом методе Рутберг Р.А. для получения фибринового сгустка. Освобождение эндогенного тромбина под действием ионов кальция зависит от состояния плазменных и тромбоцитарных факторов системы свертывания крови у данного пациента и многих других факторов, таких как прием лекарственных препаратов, условия подготовки и хранения образцов и т.д. Поэтому в более поздней модификации гравиметрического метода определения содержания фибриногена в плазме для активации свертывания вместо CaCl₂ было предложено использовать раствор тромбина (прямая стимуляция превращения фибриногена в фибрин). Добавка экзогенного препарата тромбина с известной активностью обеспечивает стандартные условия получения фибринового сгустка. При этом сам гравиметрический метод определения содержания фибриногена в плазме крови считается устаревшим, в настоящее время не используется.

Однако наиболее существенным недостатком известного способа является то обстоятельство, что фибриновый сгусток плазмы практически не растворяется ни в 8М мочевине, ни в других растворителях, поскольку молекулы фибрин-мономера, образующие основу сгустка, сшиты поперечными ковалентными связями. Образование ковалентных связей происходит под действием фибрин-стабилизирующего фактора крови (фактор XIII). Считается, что растворение сгустка исследуемой плазмы в 30% мочевине в течение 1 ч является признаком тяжелой недостаточности фактора XIII. Сгусток нормальной плазмы при этом не растворяется (Смоляницкий А.Я. / Методы исследования системы гемостаза// с. 170, в кн. «Лабораторные методы исследования в клинике». Справочник под редакцией проф. В.В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987).

Очевидно, что полное растворение фибринового сгустка является необходимым этапом и условием для осуществления самой реакции с ДНФГ и для спектрофотометрической регистрации образовавшихся в этой реакции соединений с карбонильными группами белка. Более того, корректное определение карбонильных продуктов окисления в составе нерастворимого полимеризованного фибрина, как представляется, невозможно ни одним из известных способов.

Указанные недостатки устраняются в настоящем изобретении.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка селективного, количественного и надежного способа определения окислительно-модифицированного фибриногена в клинических образцах плазмы крови. В идеале такой способ должен быть достаточно точным и чувствительным и при этом простым в исполнении, не требующим специального оборудования и дорогостоящих реактивов, пригодным для осуществления в условиях обычной клинико-диагностической лаборатории. Также важно, чтобы объем крови, требуемый для анализа, был приемлемым с учетом практических возможностей забора крови на дополнительные исследования у пациентов, в частности, с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Поставленная задача решается тем, что фибриноген плазмы переводят в фибрин, при этом для активации свертывания используют тромбин, плазму инкубируют при 37°C, образовавшийся сгусток трижды промывают 0,9% раствором NaCl и высушивают на фильтровальной бумаге. Промывка и высушивание имеет целью максимально удалить посторонние белки плазмы из сгустка. Полученный из 1 мл плазмы фибриновый сгусток переводят в растворимое состояние путем гидролиза в 1 мл 1 М раствора NaOH при 100°C, реакцию останавливают через 120±1 с добавлением 1 мл 2 М HCl, пробирки охлаждают, в гидролизате определяют концентрацию белка и концентрацию карбонильных групп.

Концентрацию белка определяют по биуретовой реакции, пересчитывают на концентрацию фибриногена в мг/мл по калибровке фибриногеном. Концентрацию карбонильных групп определяют по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. Вначале инкубируют 0,5 мл гидролизата фибринового сгустка с 2 мл 0,01 М раствора ДНФГ в 2 М HCl (опытная проба) и 0,5 мл гидролизата с 2 мл 2 М HCl (холостая проба) при комнатной температуре 60 минут. Затем к холостой и опытной пробе добавляют охлажденный 20% раствор ТХУ в объемном соотношении 8:5 (4 мл ТХУ на 2,5 мл пробы), выдерживают при -20°C не менее 10 минут, центрифугируют, полученный осадок трехкратно промывают раствором этанола и этилацетата (1:1) от избытка не прореагировавшего ДНФГ по схеме: 5, 3, и 2 мл с центрифугированием при 1500 g по 10 мин при каждой отмывке. После удаления последней порции супернатанта осадки высушивают, растворяют в 2,5 мл 8 М мочевины, растворы в мочевине еще раз центрифугируют 10 мин при 1500 g, затем спектрофотометрически измеряют оптическую плотность при 370 нм. Содержание карбонильных групп в фибриногене нмоль/мг, эквивалентное образовавшимся динитрофенилгидразонам в реакции с ДНФГ, рассчитывают, используя принятый для динитрофенилгидразонов коэффициент молярной экстинкции 22000 М^-1 см^-1 при указанной длине волны.

В соответствии с общепринятой практикой анализ одного клинического образца плазмы крови рекомендуется выполнять в трех параллельных экспериментах, в каждом из которых независимо получают фибриновый сгусток, определяют значение концентрации фибриногена и содержание карбонильных групп.

Таким образом, в отличие от способа-прототипа в заявляемом способе фибриновый сгусток перед анализом переводят в растворимое состояние путем гидролиза в специально подобранных и строго контролируемых условиях, благодаря чему получают гидролизат с требуемыми свойствами, а дальнейшее определение карбонильных групп в реакции с ДНФГ проводят способом, модифицированным с учетом специфических физико-химических свойств полученного гидролизата. При этом для активации свертывания плазмы используют раствор тромбина, а содержание фибриногена (мг/мл) определяют биуретовым методом. Результаты определения окислительной модификации фибриногена представляют в стандартизованном виде, как количество карбонильных групп, содержащихся в 1 мг фибриногена (нмоль/мг), что позволяет сравнивать данные различных исследований, в том числе полученные разными способами.

Преимуществом предложенного способа является аналитическая надежность (воспроизводимость, правильность, чувствительность, специфичность) измерения карбонильных групп в фибриновом сгустке, которая достигается, прежде всего, благодаря полной растворимости анализируемого образца в мочевине, в то время как в прототипе выполнение данного условия не обеспечивается.

Более высокая аналитическая надежность достигается также за счет применения биуретового метода для определения концентрации фибриногена вместо взвешивания фибринового сгустка, использования стандартного раствора тромбина для прямой активации превращения фибриногена в фибрин вместо опосредованной активации раствором CaCl₂, а также за счет минимизации денатурирующего действия ТХУ путем сокращения экспозиции и инкубации при -20°C. Добавление охлажденной ТХУ после окончания инкубации образца с ДНФГ, а не в начале, как в прототипе, и последующее охлаждение образца до -20°C призвано еще и остановить реакцию и, следовательно, более точно соблюдать заданное время протекания реакции.

В то же время предложенный способ не требует использования дополнительного по сравнению с прототипом оборудования, редких или дорогостоящих реактивов, также прост в техническом исполнении и может применяться для анализа окислительной модификации фибриногена в условиях общеклинической биохимической лаборатории.

Между тем, процесс температурного щелочного гидролиза характеризуется сильной нелинейностью, а белковый гидролизат по ряду свойств отличается от нативных белков. Поэтому для достижения указанного технического результата необходима оптимизация условий гидролиза, а также существенная модификация самого метода спектрофотометрического определения карбонильных групп белков в ДНФГ-реакции с учетом специфических физико-химических свойств гидролизата фибринового сгустка.

Так, известен унифицированный колориметрический метод определения фибриногена в плазме (утвержден приказом Минздрава СССР от 15.10.1974 №960 "Об унификации клинических лабораторных методов исследования"), при котором фибриноген превращают в фибрин путем добавления тромбина, затем фибриновый сгусток растворяют в щелочи и определяют концентрацию белка по биуретовой реакции. Кратко: в 2 пробирки (для параллельных определений) вводят по 0,2 мл цитратной (3,8% цитрата натрия) или оксалатной (1,34% оксалата натрия) плазмы, добавляют по 0,1 мл раствора тромбина в 0,85% растворе хлорида натрия с активностью 7-10 с и ставят пробирки в водяную баню при 37°С. Через 1 ч сгустки извлекают, трижды отмывают охлажденным 0,85% раствором хлорида натрия и высушивают на фильтровальной бумаге. Каждый из сгустков помещают в пробирку с 1 мл 1 н. раствора NaOH и ставят пробирки на 5 мин в кипящую воду. Пробы охлаждают до комнатной температуры и добавляют в каждую пробирку по 1 мл биуретового реактива. Через 30 мин пробы колориметрируют при длине волны 500-560 нм против дистиллированной воды. Для определения количества фибриногена в мг/мл предварительно строят график соотношения между показаниями ФЭКа и концентрацией фибриногена в растворе. Для этого используют стандартные разведения чистого фибриногена (коагулируемого белка) в пределах от 0,5 до 10 мг/мл (Смоляницкий А.Я. /Методы исследования системы гемостаза// с. 169, в кн. «Лабораторные методы исследования в клинике». Справочник под редакцией проф. В.В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987). Унифицированный колориметрический метод сохраняет свое значение по настоящее время в качестве референтного способа определения концентрации фибриногена в плазме крови благодаря высокой точности биуретового метода определения белка.

Исходя из задач настоящего изобретения в представленном примере наиболее важным является то обстоятельство, что белковый гидролизат фибринового сгустка количественно и качественно соответствует фибриногену, содержащемуся в исходном образце плазмы, что указывает на высокую специфичность заявляемого способа, в котором также используется гидролизат фибринового сгустка. В то же время по биуретовой реакции определяется содержание пептидных связей, однако определение содержания карбонильных групп в гидролизате, полученном по вышеописанной методике, с помощью известных способов не представляется возможным из-за малых размеров пептидных фрагментов.

Разделение молекул белка и не прореагировавшего ДНФГ (реакция проводится в условиях 100-1000-кратного избытка ДНФГ) является одним из неотъемлемых этапов определения карбонильных групп. С этой целью обычно проводят осаждение белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ), в присутствии которой выпадают в осадок белки и пептиды с молекулярной массой порядка 10 кД и выше. Метод широко используется в биохимической практике как быстрый и удобный способ очистки белков от низкомолекулярных примесей. Также хорошо известно применение этанола различных концентраций и других органических растворителей с целью осаждения или фракционирования белков. Однако ни ТХУ, ни этанол с этилацетатом, используемые в стандартной методике для дальнейшей отмывки белкового осадка от примесей ДНФГ, не осаждают белок гидролизата фибринового сгустка, полученный вышеуказанным способом, поскольку средний размер пептидов оказывается ниже критического.

В специальных экспериментах установлено, что зависимость среднего размера пептидных фрагментов фибринового сгустка от интенсивности щелочного гидролиза имеет резко выраженный экстремальный характер, в связи с чем возникает необходимость в подборе и строгом контроле условий гидролиза. С этой целью в заявляемом способе используется добавка к 1 М раствору NaOH равного объема 2 М HCl, которая в силу двухкратного избытка кислоты позволяет мгновенно остановить реакцию гидролиза. Изучение различных режимов гидролиза (температура; время; концентрация NaOH) с остановкой реакции показало, что при недостаточном гидролизе фибриновый сгусток остается полностью или частично нерастворимым и не растворяется после всех процедур в мочевине, следовательно, такой образец не может быть использован для спектрофотометрического определения карбонильных продуктов. При более интенсивном гидролизе, например таком, который используется в вышеописанном унифицированном колориметрическом методе определения фибриногена (100°С; 5 мин; 1 М NaOH), гидролизат становится слишком «низкомолекулярным», вследствие чего растворяется в ТХУ, а также в спирте и этилацетате, поэтому его нельзя отделить от свободного ДНФГ методом осаждения. Оптимальным результатом гидролиза было бы полное растворение сгустка в щелочи и полное осаждение белкового гидролизата в растворе ТХУ. Однако даже при минимальной продолжительности гидролиза порядка 2 мин, требующейся для полного растворения фибринового сгустка, возникают значительные потери белка при осаждении.

Для осаждения белков обычно используют ТХУ в конечной концентрации 10%, как правило, путем добавления 20% раствора ТХУ в соотношении 1:1 в исследуемой пробе. ТХУ в конечной концентрации 10% используется и в ранее известных способах определения карбонильных групп белков в реакции с ДНФГ. Установлено, что при объеме пробы 2,5 мл увеличение объема добавки 20% ТХУ с 2,5 мл до 4 мл позволяет практически полностью осадить белок из гидролизата, полученного в оптимальных условиях (100°С; 120±1 с). Использование более высоких концентраций ТХУ является нецелесообразным, так как не повышается эффективность осаждения, приводит к необоснованному расходу реактива.

Поэтому в отличие от известных способов в настоящем изобретении используется экспериментально подобранная конечная концентрация ТХУ около 12,3%, которая достигается при смешивании 20% раствора ТХУ с реакционной смесью, содержащей гидролизат фибрина и раствор ДНФГ, в объемном соотношении 8:5.

Дальнейшая отмывка осадка от ДНФГ, который не связался с карбонильными группами белков, согласно базовому способу Levine R.L. и соавторов (1990 г.), а также его модификациям, проводится смесью этанола и этилацетата в соотношении 1:1. Белки, как известно, не растворяются ни в спирте с низким содержанием воды, ни в этилацетате, в раствор переходят только низкомолекулярные соединения. Смесь также эффективно экстрагирует липиды, с которыми может быть связан ДНФГ, не имеющий отношения к карбонильным группам белка, и другие низкомолекулярные хромофоры, препятствующие спектрофотометрии. При этом использование 1-2 мл смеси этанола и этилацетата оказывается достаточным для эффективной отмывки при условии трехкратной смены раствора. Однако в случае отмывки осадка, полученного из гидролизата фибринового сгустка, от 30 до 50% белка переходит в отмывочный раствор, вследствие чего результаты определения карбонильных групп оказываются не только сильно заниженными, но и характеризуются большим разбросом значений.

Данное явление, как оказалось, обусловлено разбавлением этанола и этилацетата небольшим остатком жидкости в пробирке с осадком, вследствие чего относительно короткие пептиды гидролизата приобретают растворимость. Полное удаление супернатанта, оставшегося после осаждения ТХУ, технически затруднительно, однако эффект разбавления этанола и этилацетата можно снизить за счет увеличения объема самой промывочной смеси. Увеличение количества смеси для отмывки с 2 до 5 мл позволяет резко сократить потери белка, при этом повышается прочность связывания осадка со стеклом и, что крайне важно, существенно улучшается сходимость результатов в параллельных измерениях.

Таким образом, в отличие от известных способов определения карбонильных продуктов окисления в белках плазмы и сыворотки в предложенном способе отмывка осадка гидролизатата фибрина от избытка ДНФГ производится ступенчато: для 1-й отмывки используют 5 мл смеси этанола и этилацетата, для 2-й - 3 мл, для 3-й - 2 мл. Предложенная схема позволяет максимально снизить потери белка и является оптимальной по расходу реактивов. При этом суммарные потери белка на этапе осаждения и отмывки составляют около 10% от исходного содержания фибриногена. Аналогичные потери по литературным и собственным данным возникают и при определении карбонильных групп в коммерческом препарате фибриногена или альбумина и рассматриваются как вполне приемлемые для данного метода. Однако указанную систематическую погрешность следует учитывать при анализе результатов.

Модификация процедур осаждения белка и отмывок от низкомолекулярных примесей является важным элементом настоящего изобретения, так как стандартные схемы осаждения и отмывки, применявшиеся ранее, не позволяют получить достоверные результаты при определении карбонильных групп в гидролизате фибринового сгустка, физико-химические свойства которого сильно отличаются от свойств обычных белков.

Следует отметить, что в предложенном способе применяется отмывка от не прореагировавшего ДНФГ без разрушения осадка, поэтому эффективность отмывки зависит от параметров, которые влияют на условия диффузии, таких как конфигурация и размеры пробирок, нагрузки по белку, продолжительность центрифугирования. Рекомендуется использовать определенный тип пробирок, указанный в протоколе.

Одной из особенностей заявляемого способа является центрифугирование растворов белка в мочевине перед измерением оптической плотности. Для спектрофотометрии используют 2 мл супернатанта, который отбирают из общего объема 2,5 мл. Данный этап необходим для удаления волокон фильтровальной бумаги, которые прилипают к фибриновому сгустку в процессе высушивания, а также других частиц нерастворимого материала, вызывающих светорассеяние. В связи с небольшой величиной измеряемого сигнала светорассеяние является одним из основных источников артефактов.

К другим источникам артефактов следует отнести неадекватный контроль, или его отсутствие, недостаточно полную отмывку от ДНФГ, не вступившего в реакцию с карбонильными группами белка, неполное растворение белкового осадка в мочевине.

Для устранения роли случайных отклонений, вероятность которых особенно велика на этапах гидролиза, осаждения и отмывки, анализ одного образца плазмы целесообразно выполнять в трех параллельных экспериментах, в каждом из которых независимо получают фибриновый сгусток, определяют значение концентрации фибриногена и карбонильных продуктов окисления.

Ниже представлены аналитические и рабочие характеристики способа, полученные с использованием пулированной плазмы доноров:

1. Линейность: величина регистрируемого сигнала линейно зависит от концентрации карбонильных продуктов окисления белков при дозовой нагрузке по белку 0,25-1,25 мг.

2. Значение коэффициента вариации: не более 10%.

3. Чувствительность: не менее 0,5 нмоль/мг.

4. Специфичность (по отношению к фибриногену): не менее 95%.

5. Количество плазмы/крови для исследования: 3-4/8-10 мл.

6. Затраты времени на анализ 4-х клинических образцов: 4,5-5 ч.

Правильность результатов исследования уровня окислительной модификации фибриногена, как одна из характеристик аналитической надежности диагностического лабораторного теста, достигается за счет выявления и устранения всех факторов, вызывающих отклонение измеряемого значения от его истинной величины (с учетом статистической погрешности). Для проверки правильности измерений заявленным способом были проведены исследования уровня окислительной модификации фибриногена в образцах, полученных путем смешивания плазмы больных с высоким и низким значением данного показателя. Результаты этих измерений в пределах статистической ошибки совпадают с расчетными значениями, что подтверждает аналитическую правильность способа.

О правильности результатов измерений заявляемым способом свидетельствует и сам по себе линейный характер зависимости содержания карбонильных продуктов от количества фибриногена в указанном выше диапаз