Средство для профилактического и/или терапевтического лечения периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством

Средство для профилактического и/или терапевтического лечения периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к лекарственному средству, оказывающему профилактический и/или терапевтический эффект в отношении периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством.

Предшествующий уровень техники

В терапевтическом лечении злокачественных новообразований (злокачественных опухолей) хирургическое лечение, лучевую терапию и химиотерапию соответствующим образом используют независимо или в комбинации. Противораковые средства (средства против злокачественных опухолей), используемые для химиотерапии злокачественных новообразований наряду с терапевтическим лечением, указанным выше, исходно обладают цитотоксичностью и вызывают побочные реакции, повреждая не только раковые клетки (злокачественную опухоль), но также и нормальные клетки.

Примеры побочных реакций, вызываемых противораковыми средствами, включают нарушения крови, обструкции органов пищеварения и нейропатию, но в последние годы все более серьезной становится проблема острой или хронической нейропатии. Считают, что это происходит по причине значительных побочных реакций, вызываемых появляющимися на рынке противораковыми средствами, при этом во многих случаях отмечают нейропатии в качестве противоракового эффекта, развитие нейропатии усиливается под влиянием комбинированной терапии множеством лекарственных средств, такой как терапия FOLFOX, и такие побочные реакции, как нарушения крови и обструкция органов пищеварения, имеют тенденцию к улучшению. В современных условиях для контроля такой нейропатии, вызываемой противораковыми средствами, необходимо снижать дозы противораковых средств или прекращать противораковую химиотерапию.

Нейропатии, вызываемые противораковыми средствами, также наблюдают в органах чувств, таких как органы вкуса, а также в центральной нервной системе, вегетативной нервной системе и периферической нервной системе. Среди них очень часто развиваются периферические нейропатии, например, боли, такие как интенсивная боль и жгучая боль, онемение дистальных отделов конечностей, аномальные ощущения, такие как холодовая гиперчувствительность, дизестезии, такие как анестезия и сенсорный паралич, сенсорная атаксия, снижение мышечной силы и т.п., и, в особенности, в качестве типичных симптомов проблемы вызывают холодовая аллодиния и механическая аллодиния. Примеры противораковых средств, часто вызывающих такие периферические нейропатии, включают таксановые лекарственные средства (паклитаксел, доцетаксел), лекарственные средства на основе алкалоида барвинка (винкристин, винбластин, виндезин, винорелбин) и препараты платины (оксалиплатин, цисплатин).

В настоящее время не разработаны какие-либо эффективные способы профилактического и терапевтического лечения периферических нейропатий, вызываемых противораковыми средствами, особенно, аллодинии. Хотя в случае периферических нейропатий, вызываемых оксалиплатином, сообщают о применимости внутривенного введения кальция и магния или глутатиона, их трудно использовать, т.к., например, такая терапия дополнительно осложняет противораковую химиотерапию, и для таких веществ необходимо массированное введение. В клинической практике необходимость контролировать периферические нейропатии, вызываемые противораковыми средствами, с помощью физиотерапии, дополнительных способов терапии, таких как массаж и акупунктура, или комбинации медикаментозных способов терапии, таких как использование стероидов, антидепрессантов, антиконвульсантов и опиоидов, является нежелательной, при этом эффективность этих способов терапии не проверена, и такие способы терапии сами по себе часто вызывают побочные реакции (непатентные документы 1 и 2).

Тромбомодулин известен как вещество, действующее, специфически связываясь с тромбином, таким образом, ингибируя прокоагулянтную активность тромбина и, в то же время, проявляя антикоагулянтную активность, таким образом, значительно усиливая способность тромбина активировать протеин C. Тромбомодулин впервые открыли и получили как гликопротеин, экспрессирующийся на клетках эндотелия сосудов различных видов животных, включая людей, и, что касается его структуры, он состоит из 5 областей, а именно, начиная с N-конца белка, N-концевой области (аминокислотные остатки 1-226), области, имеющей шесть EGF-подобных структур (аминокислотные остатки 227-462), области O-сцепленного гликозилирования (аминокислотные остатки 463-497), трансмембранной области (аминокислотные остатки 498-521) и цитоплазматической области (аминокислотные остатки 522-557) (непатентный документ 3).

Полноразмерный тромбомодулин труднорастворим в отсутствие поверхностно-активного вещества, и для производства препарата полноразмерного тромбомодулина необходимо его добавление. Также доступен растворимый тромбомодулин, который может полностью растворяться даже в отсутствие поверхностно-активного вещества. Растворимый тромбомодулин можно получать, удаляя, по меньшей мере, часть трансмембранной области или всю трансмембранную область. Например, подтверждено, что растворимый тромбомодулин, состоящий только из 3 областей, а именно, N-концевой области, области с шестью EGF-подобными структурами и области O-сцепленного гликозилирования (т.е. растворимый тромбомодулин, имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 19-516 в SEQ ID NO:9), можно получать, используя рекомбинантные способы, и что получаемый рекомбинантный растворимый тромбомодулин имеет ту же активность, что и природный тромбомодулин (патентный документ 1). Также приводят примеры тромбомодулинов, получаемых из мочи человека и т.п. (патентный документ 2).

Как признают во многих случаях, в генах человека обнаружены полиморфные мутации, представляющие собой спонтанные мутации или мутации, возникающие при их получении. К настоящему времени идентифицированы тромбомодулиновые белки, в которых аминокислота в положении 473 предшественника тромбомодулина человека, имеющего аминокислотную последовательность, состоящую из 575 аминокислотных остатков, преобразована в Val или Ala. В нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, этот вариант аминокислотного остатка соответствует мутации в T или C в положении 1418 (непатентный документ 3). Однако, два типа тромбомодулинов полностью идентичны в отношении их активности и физико-химических свойств, и можно считать, что они являются, по существу, идентичными.

Что касается предполагаемого применения тромбомодулина, в настоящее время предполагают применение вещества в терапевтическом и профилактическом лечении заболеваний, например, инфаркта миокарда, тромбоза (например, тромбоза сосудов головного мозга в острой стадии или хронической стадии, острого или хронического тромбоза периферических артерий или вен и т.п.), эмболии (например, церебральной эмболии в острой стадии или хронической стадии, острой или хронической эмболии периферических артерий или вен и т.п.), обструкции периферических сосудов (например, болезни Бюргера, болезни Рейно и т.п.), обструктивного атеросклероза, функциональных обструкций, развивающихся после операций на сердце, осложнений трансплантации органов, диссеминированного внутрисосудистого свертывания (DIC), стенокардии, транзиторной ишемической атаки, токсикоза при беременности, тромбоза глубоких вен (DVT) и т.п. Кроме того, примеры подходящих заболеваний, иных, чем сопровождающиеся гиперкоагуляцией, таких как тромбоз и DIC, включают повреждения печени (патентный документ 4), абсорбционные заболевания костей (патентный документ 5), заживление ран (патентный документ 6) и т.п. Кроме того, что касается применения тромбомодулина совместно с другими активными ингредиентами, описывают заживление ран (патентный документ 7), защиту тканей мозга (патентный документ 8) и т.п. Кроме того, описывают применение тромбомодулина в терапевтическом и профилактическом лечении боли при трансплантации гематопоэтических клеток (патентный документ 9).

Ссылки на известный уровень техники

Патентные документы

Патентный документ 1: Нерассмотренная патентная публикация Японии (KOKAI) № 64-6219

Патентный документ 2: Нерассмотренная патентная публикация Японии № 3-86900

Патентный документ 3: WO 92/00325

Патентный документ 4: Нерассмотренная патентная публикация Японии № 8-3065

Патентный документ 5: Нерассмотренная патентная публикация Японии № 8-301783

Патентный документ 6: Нерассмотренная патентная публикация Японии № 9-20677

Патентный документ 7: патент США № 5976523

Патентный документ 8: патент США № 5827832

Патентный документ 9: Нерассмотренная патентная публикация Японии № 2012-001543

Непатентные документы

Непатентный документ 1: NCI Cancer Bulletin, 2010, Feb. 23, 7 (4)

Непатентный документ 2: Folia Pharmacologica Japonica (Nippon Yakurigaku Zasshi), 2010, 136:275-279

Непатентный документ 3: EMBO Journal, 1987, 6:1891-1897

Сущность изобретения

Цель, которая должна быть достигнута с помощью изобретения

Целью настоящего изобретения является получение лекарственного средства, делающего возможным эффективное профилактическое и/или терапевтическое лечение периферической нейропатической боли, вызываемой противораковыми средствами.

Средства достижения цели

Авторы настоящего изобретения решительно признают текущую ситуацию как проблему, решение которой в случае нейропатии, вызываемой противораковым средством, направлено на снижение дозы противоракового средства или прекращение введения противоракового средства, и к настоящему времени не разработано какое-либо эффективное профилактическое и терапевтическое лечение нейропатии, вызываемой противораковым средством, и они считают, что важной целью является получение лекарственного средства для эффективного профилактического и/или терапевтического лечения нейропатии, вызываемой противораковым средством, особенно периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством. Это связано с тем, что авторы настоящего изобретения считают, что периферическая нейропатическая боль, вызываемая противораковым средством, затрудняет повседневную деятельность пациентов и представляет собой наиболее значимую причину прекращения терапевтического лечения злокачественного новообразования, и, таким образом, решение проблемы аллодинии, вызываемой противораковым средством, является важным для терапевтического лечения злокачественного новообразования не только для улучшения качества жизни пациентов, но также и с точки зрения продолжения терапевтического лечения злокачественного новообразования.

Для достижения указанной выше цели авторы настоящего изобретения осуществляли различные исследования. В результате, они неожиданно обнаружили, что тромбомодулин оказывает превосходный профилактический и/или терапевтический эффект в отношении периферической нейропатической боли, особенно аллодинии, вызываемой противораковым средством, и осуществляли настоящее изобретение. До настоящего времени не сообщали и не предлагали какого-либо профилактического и/или терапевтического лечения нейропатии, вызываемой противораковым средством, особенно периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством, с использованием тромбомодулина. Хотя в патентном документе 9 описывают, что тромбомодулин оказывает эффект в отношении боли, сопровождающейся повышением массы в результате отека, объема асцита или т.п., вызываемых премедикацией перед трансплантацией гематопоэтических клеток, в документе никак не упоминают периферическую нейропатическую боль, вызываемую противораковым средством.

Таким образом, настоящее изобретение относится к следующему.

[1] Лекарственное средство для профилактического и/или терапевтического лечения периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством, содержащее тромбомодулин в качестве активного ингредиента.

[2] Лекарственное средство по указанному выше п.[1], где тромбомодулин является растворимым тромбомодулином.

[3] Лекарственное средство по указанному выше п.[1], где тромбомодулин является тромбомодулином человека.

[4] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[3], где периферическая нейропатическая боль представляет собой один или несколько типов симптомов, выбранных из онемения конечностей, боли в конечностях, снижения глубоких рефлексов сухожилий, снижения мышечной силы, аллодинии, гипералгезии и двигательной дисфункции.

[5] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[4], где периферическая нейропатическая боль является аллодинией.

[6] Лекарственное средство по указанному выше п.[5], где аллодиния является механической аллодинией.

[6-2] Лекарственное средство по указанному выше п.[5], где аллодиния является холодовой аллодинией.

[7] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[6-2], где противораковое средство состоит из одного или нескольких типов средств, выбранных из группы, состоящей из таксанового лекарственного средства и препарата платины.

[7-2] Лекарственное средство по указанному выше п.[7], где таксановое лекарственное средство состоит из одного или нескольких типов лекарственных средств, выбранных из группы, состоящей из паклитаксела и доцетаксела.

[7-3] Лекарственное средство по указанному выше п.[7], где препарат платины состоит из одного или нескольких типов препаратов, выбранных из группы, состоящей из оксалиплатина, цисплатина, карбоплатина и недаплатина.

[8] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[6-2], где противораковым средством является паклитаксел.

[8-2] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[6-2], где противораковым средством является оксалиплатин.

[9] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[6-2], где противораковое средство вводят в соответствии с терапией FOLFOX или терапией FOLFIRI.

[10] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[9], где тромбомодулин вводят периодически.

Если процитированные номера пунктов представлены в виде диапазона, такого как [1]-[9], как указано выше, и в диапазон включают указанный пункт с номером пункта, имеющим субномер, такой как [7-2], это означает, что также цитируют указанный пункт с номером пункта, имеющим субномер, такой как [7-2]. Это правило также справедливо для следующего описания.

[10-2] Лекарственное средство по указанному выше п.[10], где периодическое введение является введением раз в неделю.

[10-3] Лекарственное средство по указанному выше п.[10], где периодическое введение является ежедневным введением.

[10-4] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[9], где тромбомодулин вводят раз в неделю.

[10-5] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[9], где тромбомодулин вводят каждый день.

[11] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[10-5], которое вводят пациенту со злокачественным новообразованием, страдающему одним или несколькими типами злокачественных новообразований, выбранных из группы, состоящей из рака яичников, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака желудка, рака эндометрия, рака головы и шеи, карциномы пищевода, лейкоза, злокачественной лимфомы, опухоли детского возраста, множественной миеломы, злокачественной астроцитомы, нейроглиомы, трофобластической опухоли, герминогенной опухоли, рака легких, опухоли яичка, рака мочевого пузыря, опухоли почечной лоханки, опухоли мочеиспускательного канала, рака предстательной железы, карциномы шейки матки, нейробластомы, мелкоклеточного рака легких, остеосаркомы, злокачественной мезотелиомы плевры, злокачественной остеомы и рака толстого кишечника.

[12] Лекарственное средство для совместного введения с противораковым средством для профилактического и/или терапевтического лечения периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством, содержащее тромбомодулин в качестве активного ингредиента.

[12-2] Лекарственное средство по указанному выше п.[12], где противораковым средством является таксановое лекарственное средство или препарат платины.

[12-3] Лекарственное средство по указанному выше п.[12], где противораковым средством является паклитаксел.

[12-4] Лекарственное средство по указанному выше п.[12], где противораковым средством является оксалиплатин.

[13] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[12-4], где тромбомодулин является пептидом, получаемым из трансформированной клетки, полученной трансфекцией клетки-хозяина с использованием ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность по указанным ниже пп.(i-1) или (i-2), и пептид является пептидом, имеющим функции тромбомодулина;

(i-1) аминокислотная последовательность SEQ ID NO:9 или 11, или

(i-2) аминокислотная последовательность по указанному выше п.(i-1), дополнительно включающая замену, делецию или инсерцию одного или нескольких аминокислотных остатков.

[13-2] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[12-4], где тромбомодулин является пептидом, получаемым из трансформированной клетки, полученной трансфекцией клетки-хозяина с использованием ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность по указанному ниже п.(i-1), и пептид является пептидом, имеющим функции тромбомодулина;

(i-1) аминокислотная последовательность SEQ ID NO:9 или 11.

[14] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[12-4], где тромбомодулин является пептидом, содержащим аминокислотную последовательность по указанным ниже пп.(i-1) или (i-2), и пептид является пептидом, имеющим функции тромбомодулина;

(i-1) аминокислотная последовательность в положениях 19-516 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9 или 11, или

(i-2) аминокислотная последовательность по указанному выше п.(i-1), дополнительно включающая замену, делецию или инсерцию одного или нескольких аминокислотных остатков.

[14-2] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[12-4], где тромбомодулин является пептидом, содержащим аминокислотную последовательность по указанному ниже п.(i-1), и пептид является пептидом, имеющим функции тромбомодулина;

(i-1) аминокислотная последовательность в положениях 19-516 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO-9 или 11.

[14-3] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[12-4], где тромбомодулин является пептидом, содержащим:

(i) аминокислотную последовательность в положениях 367-480 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9 или 11, и аминокислотную последовательность по указанным ниже пп.(ii-1) или (ii-2), и пептид является пептидом, имеющим функции тромбомодулина:

(ii-1) аминокислотную последовательность в положениях 19-244 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9 или 11, или

(ii-2) аминокислотную последовательность по указанному выше п.(ii-1), дополнительно включающую замену, делецию или инсерцию одного или нескольких аминокислотных остатков.

[14-4] Лекарственное средство по любому из указанных выше пп.[1]-[12-4], где тромбомодулин является пептидом, содержащим:

(i) аминокислотную последовательность в положениях 367-480 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9 или 11, и аминокислотную последовательность по указанному ниже п.(ii-1), и пептид является пептидом, имеющим функции тромбомодулина:

(ii-1) аминокислотную последовательность в положениях 19-244 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9 или 11.

[15] Способ профилактического и/или терапевтического лечения периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством, включающий этап введения тромбомодулина млекопитающему.

[15-2] Способ по указанному выше п.[15], имеющий одну или несколько характерных черт, определенных в указанных выше пп.[1]-[14-4].

[16] Применение тромбомодулина для производства лекарственного средства для профилактического и/или терапевтического лечения периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством.

[16-2] Применение по указанному выше п.[16], имеющее одну или несколько характерных черт, определенных в указанных выше пп.[1]-[14-4].

[17] Способ профилактического и/или терапевтического лечения периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством, у млекопитающего, которому вводят противораковое средство, включающий этап введения тромбомодулина млекопитающему.

[17-2] Способ по указанному выше п.[17], имеющий одну или несколько характерных черт, определенных в указанных выше пп.[1]-[14-4].

[17-3] Способ по указанному выше п.[17], включающий этап введения тромбомодулина млекопитающему одновременно с противораковым средством или в разные моменты времени.

Эффект изобретения

Настоящее изобретение делает возможным эффективное профилактическое и/или терапевтическое лечение периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством. До настоящего времени для контроля периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством, необходимым являлось нежелательное снижение дозы противоракового средства или прекращение химиотерапии злокачественного новообразования. Настоящее изобретение делает возможным продолжение соответствующей химиотерапии злокачественного новообразования и вносит вклад в улучшение качества жизни пациентов.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены результаты исследования профилактического эффекта тромбомодулина в отношении механической аллодинии, вызываемой введением паклитаксела, исследование осуществляли согласно тесту фон Фрея.

Белая стрелка вниз: Введение 4 мг/кг паклитаксела

Черная стрелка вниз: Введение TMD123

o: Группа введения растворителя

•: Группа введения PTX

Δ: Группа введения PTX + 0,1 мг/кг TMD123

Серая Δ: Группа введения PTX + 1 мг/кг TMD123

Черная Δ: Группа введения PTX + 10 мг/кг TMD123

*: p<0,05

**: p<0,01 (сравнение с группой введения растворителя)

: p<0,05

: p<0,001 (сравнение с группой введения PTX)

На фиг. 2 представлены результаты исследования терапевтического эффекта тромбомодулина в отношении механической аллодинии, вызываемой введением паклитаксела, исследование осуществляли согласно тесту фон Фрея, как и исследование, результаты которого представлены на фиг. 1.

•: Группа введения PTX

Δ: Группа введения PTX + 10 мг/кг TMD123

: p<0,05 (сравнение с группой введения PTX)

rhTMα: TMD123

На фиг. 3 представлены результаты исследования терапевтического эффекта тромбомодулина в отношении механической аллодинии, вызываемой введением паклитаксела, исследование осуществляли согласно тесту Рэндалла-Селитто с использованием крыс, как и исследование, результаты которого представлены на фиг. 1.

Белая стрелка вниз: Введение 2 мг/кг паклитаксела

Черная стрелка вниз: Введение TMD123

o: Группа введения растворителя

■: Группа введения PTX

Δ: Группа введения PTX + 10 мг/кг TMD123

*: p<0,05

**: p<0,01 (сравнение с группой введения растворителя)

: p<0,05

: р<0,01 (сравнение с группой введения PTX)

Способы осуществления изобретения

Далее конкретно объясняют несколько предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения (предпочтительных способов осуществления изобретения, далее в описании также обозначаемых как "варианты осуществления"). Однако объем настоящего изобретения не ограничен приведенными ниже конкретными вариантами осуществления.

Примеры тромбомодулина, применимого в качестве активного ингредиента лекарственного средства для профилактического и/или терапевтического лечения периферической нейропатической боли, вызываемой противораковым средством, по этому варианту осуществления, включают растворимый тромбомодулин.

Предпочтительно, о тромбомодулине по этому варианту осуществления известно, что он имеет действия (1) избирательного связывания с тромбином (2) для стимуляции активации протеина C тромбином. Кроме того, предпочтительным является подтверждение того, что тромбомодулин, как правило, имеет (3) действие по повышению тромбинового времени, (4) действие по супрессии агрегации тромбоцитов, вызываемой тромбином, и/или (5) противовоспалительное действие. Такие действия, которыми обладает тромбомодулин, можно обозначать как функции тромбомодулина.

Что касается функций тромбомодулина, тромбомодулин предпочтительно оказывает указанные выше действия (1) и (2) и, более предпочтительно, оказывает указанные выше действия (1)-(4). Что касается функций тромбомодулина, тромбомодулин более предпочтительно оказывает все из указанных выше действий (1)-(5).

Действие тромбомодулина по связыванию с тромбином можно подтверждать способами исследования, описываемыми в различных известных публикациях, таких как Thrombosis and Haemostasis, 1993, 70(3):418-422 и The Journal of Biological Chemistry, 1989, 264, 9, pp.4872-4876. Что касается действия по стимуляции активации протеина C тромбином, степень активности стимуляции активации протеина C тромбином или наличие или отсутствие действия можно легко подтверждать способами исследования, четко описываемыми в различных известных публикациях включая, например, нерассмотренную патентную публикацию Японии № 64-6219. Кроме того, аналогично можно легко подтверждать действие по повышению тромбинового времени и/или действие по супрессии агрегации тромбоцитов, вызываемой тромбином. Кроме того, противовоспалительное действие также можно подтверждать способами исследования, описываемыми в различных известных публикациях, включая, например, Blood, 2008, 112:3361-3670 и The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115, 5:1267-1274.

Тромбомодулин, используемый в этом варианте осуществления, в частности, не ограничен при условии, что он имеет функции тромбомодулина, но тромбомодулин предпочтительно является растворимым тромбомодулином, растворимым в воде в условиях отсутствия поверхностно-активных веществ.

Растворимость растворимого тромбомодулина в воде, такой как дистиллированная вода, используемая для инъекций (в отсутствие поверхностно-активного вещества, такого как Triton X-100 или полидоканол, и, как правило, приблизительно в нейтральном диапазоне pH), предпочтительно составляет, например, 1 мг/мл или более, или 10 мг/мл или более, предпочтительно - 15 мг/мл или более или 17 мг/мл или более, более предпочтительно - 20 мг/мл или более, 25 мг/мл или более или 30 мг/мл или более; особенно предпочтительно - 60 мг/мл или более. В некоторых случаях растворимость составляет, например, 80 мг/мл или более или 100 мг/мл или более. Для определения того, успешно ли растворился растворимый тромбомодулин в воде, следует понимать, что после растворения растворимого тромбомодулина в воде и визуального осмотра раствора, например, при дневном свете в положении, соответствующем освещенности приблизительно 1000 люксов, в качестве простых критериев служат прозрачный внешний вид раствора и отсутствие очевидно наблюдаемых нерастворимых веществ. Также можно наблюдать наличие или отсутствие какого-либо остатка после фильтрации.

Молекулярная масса тромбомодулина не ограничена при условии, что он имеет функции тромбомодулина, как описано выше. Молекулярная масса предпочтительно составляет 100000 или менее, более предпочтительно - 90000 или менее, еще более предпочтительно - 80000 или менее, наиболее предпочтительно - 70000 или менее, и молекулярная масса предпочтительно составляет 50000 или более, наиболее предпочтительно - 60000 или более. Молекулярную массу растворимого тромбомодулина легко можно измерять общепринятыми способами измерения молекулярной массы белка. Предпочтительным является измерение с помощью масс-спектрометрии, и более предпочтительным является способ MALDITOF-MS. Для получения растворимого тромбомодулина, имеющего молекулярную массу в желаемом диапазоне, растворимый тромбомодулин, получаемый культивированием трансформированной клетки, полученной трансфекцией клетки-хозяина с помощью вектора с использованием ДНК, кодирующей растворимый тромбомодулин, можно подвергать фракционированию с использованием хроматографии на колонке или т.п., как описано ниже.

Тромбомодулин, используемый для настоящего варианта осуществления, предпочтительно, содержит аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков в положениях 19-132 SEQ ID NO:1, известную как центральную часть, ответственную за функции тромбомодулина человека, и тромбомодулин, в частности, не ограничен при условии, что тромбомодулин содержит аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков в положениях 19-132 SEQ ID NO:1. Аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 19-132 SEQ ID NO:1, может подвергаться природному или искусственному мутагенезу при условии, что последовательность оказывает действие, стимулирующее активацию протеина C тромбином, а именно, имеет одну из функций тромбомодулина. Конкретно, последовательность может содержать замену, делецию или инсерцию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 19-132 SEQ ID NO:1. Приемлемый уровень мутаций, в частности, не ограничен при условии, что аминокислотная последовательность имеет функции тромбомодулина. Пример включает гомологию аминокислотных последовательностей 50% или более, и гомология составляет предпочтительно 70% или более, более предпочтительно - 80% или более, более предпочтительно - 90% или более, особенно предпочтительно - 95% или более, и наиболее предпочтительно - 98% или более. Такую мутантную аминокислотную последовательность, включающую замену, делецию или инсерцию одного или нескольких аминокислотных остатков, обозначают как гомологичную мутантную последовательность. Как описано ниже, эти мутантные аминокислотные последовательности легко можно получать с использованием общепринятых способов генной инженерии. Тромбомодулин, в частности, не ограничен при условии, что он имеет указанную выше последовательность и оказывает действие по избирательному связыванию с тромбином для стимуляции активации протеина C тромбином, по меньшей мере, как целый тромбомодулин, но тромбомодулин, предпочтительно, также имеет противовоспалительное действие.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3 содержит мутацию Val, как аминокислоты в положении 125 последовательности SEQ ID NO:1, в Ala. Используемый в настоящем изобретении тромбомодулин, предпочтительно, также содержит аминокислотную последовательность в положениях 19-132 SEQ ID NO:3.

Как описано выше, хотя используемый в настоящем изобретении тромбомодулин, в частности, не ограничен при условии, что тромбомодулин имеет, по меньшей мере, аминокислотную последовательность в положениях 19-132 SEQ ID NO:1 или 3 или гомологичную им мутантную последовательность и содержит, по меньшей мере, пептидную последовательность, имеющую функции тромбомодулина, предпочтительные примеры тромбомодулина включают пептид, состоящий из последовательности в положениях 19-132 или 17-132 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, и пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной указанной выше последовательности, и имеющий, по меньшей мере, функции тромбомодулина. Более предпочтительным является пептид, состоящий из последовательности в положениях 19-132 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3. В другом варианте осуществления более предпочтительным является пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной последовательности в положениях 19-132 или 17-132 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, и имеющий, по меньшей мере, функции тромбомодулина.

В качестве другого варианта осуществления тромбомодулина, используемого в этом варианте осуществления, тромбомодулин предпочтительно содержит аминокислотную последовательность в положениях 19-480 SEQ ID NO:5, в частности, не ограниченную при условии, что тромбомодулин содержит аминокислотную последовательность в положениях 19-480 SEQ ID NO:5. Аминокислотная последовательность в положениях 19-480 SEQ ID NO:5 может являться ее гомологичной мутантной последовательностью при условии, что последовательность оказывает действие, стимулирующее активацию протеина C тромбином, т.е. имеет одну из функций тромбомодулина.

Последовательность SEQ ID NO:7 содержит мутацию Val, в качестве аминокислоты в положении 473 последовательности SEQ ID NO:5, в Ala. Используемый в этом варианте осуществления тромбомодулин, предпочтительно, также содержит аминокислотную последовательность в положениях 19-480 SEQ ID NO:7.

Как описано выше, хотя используемый в этом варианте осуществления тромбомодулин, в частности, не ограничен при условии, что тромбомодулин имеет, по меньшей мере, последовательность в положениях 19-480 SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7 или гомологичную им мутантную последовательность и содержит, по меньшей мере, пептидную последовательность, имеющую функции тромбомодулина, предпочтительные примеры тромбомодулина включают пептид, состоящий из последовательности в положениях 19-480 или 17-480 SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7, и пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной указанной выше последовательности, и имеющий, по меньшей мере, функции тромбомодулина. Более предпочтительным является пептид, состоящий из последовательности в положениях 19-480 SEQ ID NO:5 или 7. В другом варианте осуществления более предпочтительным является пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной последовательности в положениях 19-480 или 17-480 SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7, и имеющий, по меньшей мере, функции тромбомодулина.

В качестве другого варианта осуществления тромбомодулина, используемого в этом варианте осуществления, тромбомодулин, предпочтительно, содержит аминокислотную последовательность в положениях 19-515 SEQ ID NO:9, в частности, не ограниченную при условии, что тромбомодулин содержит аминокислотную последовательность в положениях 19-515 SEQ ID NO:9. Аминокислотная последовательность в положениях 19-515 SEQ ID NO:9 может являться гомологичной ей мутантной последовательностью при условии, что последовательность оказывает действие, стимулирующее активацию протеина C тромбином, т.е. имеет одну из функций тромбомодулина.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:11 содержит мутацию Val, как аминокислоты в положении 473 SEQ ID NO:9, в Ala. Используемый в этом варианте осуществления тромбомодулин, предпочтительно, также содержит аминокислотную последовательность в положениях 19-515 SEQ ID NO:11.

Как описано выше, хотя используемый в этом варианте осуществления тромбомодулин, в частности, не ограничен при условии, что тромбомодулин имеет, по меньшей мере, последовательность в положениях 19-515 SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:11 или гомологичную им мутантную последовательность и содержит пептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, функции тромбомодулина, более предпочтительные примеры включают пептид, имеющий последовательность в положениях 19-516, 19-515, 17-516 или 17-515 SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:11, и пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной указанной выше последовательности, и имеющий, по меньшей мере, функции тромбомодулина. Особенно предпочтительным является пептид, имеющий последовательность в положениях 19-516, 19-515, 17-516 или 17-515 SEQ ID NO:9. Их смесь также является предпочтительным примером. В другом варианте осуществления особенно предпочтительным является пептид, имеющий последовательность в положениях 19-516, 19-515, 17-516 или 17-515 SEQ ID NO:11. Их смесь также является предпочтительным примером. Кроме того, пептид, состоящий из гомологичной им мутантной последовательности и имеющий, по меньшей мере, функции тромбомодулина, также является предпочтительным примером. Предпочтительно, чтобы растворимый тромбомодулин также имел противовоспалительное действие.

Пептид, имеющий гомологичную мутантную последовательность, является таким, как описано выше, и означает пептид, который может содержать замену, делецию или инсерцию по меньшей мере одного, а именно, одного или нескольких, предпочтительно - нескольких (например, от 1 до 20, предпочтительно - от 1 до 10, более предпочтительно - от 1 до 5, особенно пред