Комбинированное использование белков cry1ca и cry1ab для контроля устойчивости насекомых

Комбинированное использование белков cry1ca и cry1ab для контроля устойчивости насекомых

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень изобретения

Люди выращивают кукурузу для использования в качестве пищи и источника энергии. Люди также выращивают хлопок и множество других зерновых культур, включающих в себя сою. Насекомые поедают и повреждают растения и таким образом подрывают усилия человека. Ежегодно затрачиваются миллиарды долларов для контроля насекомых-вредителей, где ущерб, который они наносят, исчисляется дополнительными миллиардами долларов. Для контроля насекомых-вредителей применяются в первую очередь синтетические органические химические инсектициды, вместе с тем, в некоторых сферах важную роль играют биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, полученные из Bacillus thuringiensis (Bt). Способность производить устойчивые к насекомым растения посредством их трансформации генами инсектицидного белка Bt представляет собой революционное изменение в современном сельском хозяйстве и повышает важность и значение инсектицидных белков и их генов.

Для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений использовались несколько Bt-белков, которые в настоящее время успешно зарегистрированы и введены в коммерческое обращение. Они включают в себя белки кукурузы Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa и Cry3Bb, белки хлопка Cry1Ac и Cry2Ab и картофельный белок Cry3A.

Экспрессирующие указанные белки коммерческие продукты экспрессируют единственный белок, кроме тех случаев, когда желательно объединить инсектицидный спектр 2 белков (например, Cry1Ab и Cry3Bb в кукурузе объединяют для обеспечения устойчивости к чешуекрылым вредителям и к личинкам, повреждающим корни, соответственно), или если независимое действие белков делает их полезными в качестве инструмента для задержки развития устойчивости у восприимчивых популяций насекомых (например, объединяют белки хлопка Cry1Ac и Cry2Ab для обеспечения контроля устойчивости к листовертке-почкоеду табака).

В этой связи, некоторые из качеств устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые привели к быстрому и широко распространенному принятию этой технологии, также вызывают обеспокоенность возможностью развития у популяций вредителей устойчивости к инсектицидным белкам, которые продуцируются этими растениями.

Был предложен ряд стратегий для сохранения полезности свойств устойчивости к насекомым, обусловленной Bt белками, которые включают в себя применение белков в высоких дозах, применение в комбинации с «убежищами», и совместное применение с различными токсинами или повреждение этими токсинами (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol. 16: 144-146).

Белки, выбранные для использования с целью управления устойчивостью насекомых (IRM), в совокупности должны проявлять свой инсектицидный эффект независимо таким образом, чтобы устойчивость, развивающаяся к одному белку, не вызывала развитие устойчивости ко второму белку (то есть, чтобы отсутствовала перекрестная устойчивость к этим белкам). Если, например, популяция вредителя, выбранная по устойчивости к "белку А", восприимчива к "белку B", можно сделать вывод об отсутствии перекрестной устойчивости, и что комбинация белка A и белка B будет эффективно задерживать развитие устойчивости к белку А единственному.

При отсутствии устойчивых популяций насекомых можно проводить оценку на основе других характеристик, которые, вероятно, связаны с механизмом действия и интенсивностью перекрестной устойчивости. Было предложено применение рецептор-опосредованного связывания для идентификации инсектицидных белков с вероятным отсутствием перекрестной устойчивости (van Mellaert et al. 1999). Ключевым фактом для прогноза отсутствия перекрестной устойчивости, который лежит в основе упомянутого подхода, является то, что инсектицидные белки не конкурируют за рецепторы у восприимчивых видов насекомых.

В случае, если два токсина B.t. Cry конкурируют за один и тот же рецептор, и впоследствии у насекомого происходит определенная мутация рецептора, в результате которой один из токсинов больше не связывается с этим рецептором и поэтому теряет инсектицидное действие против этого насекомого, то у этого насекомого может также возникать устойчивость ко второму токсину (который конкурентно связывается с этим рецептором). Вместе с тем, если два токсина связываются с двумя разными рецепторами, это может служить признаком отсутствия одновременной устойчивости насекомого к двум упомянутым токсинам.

Для защиты растений от множества насекомых-вредителей в настоящее время применяется Cry1Ab, представляющий собой инсектицидный белок, используемый в трансгенной кукурузе. Белок Cry1Ab обеспечивает защиту от основного вредителя кукурузы, которым является европейский кукурузный мотылек.

Дополнительные токсины Cry можно найти в перечне на вебсайте комитета по официальной номенклатуре B.t (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). См. Приложение A к указанному источнику. В настоящее время существует около 60 основных групп токсинов "Cry" (Cry1-Cry59), с дополнительными токсинами Cyt, токсинами VIP и подобными токсинами. Многие из этих многочисленных групп имеют подгруппы, обозначаемые прописными буквами, и в подгруппах с прописными буквами выделяют подподгруппы, обозначаемые строчными буквами. (Например, Cry1 имеет подгруппы A-L, и в подгруппе Cry1A выделяют подподгруппы а-i).

Краткая сущность изобретения

Настоящее изобретение частично относится к неожиданному открытию, что Cry1Ca обладает высокой активностью против популяции огневки сахарного тростника, включающей в себя популяцию устойчивой к Cry1Ab огневки сахарного тростника. Специалистам в данной области техники будет очевидно, в плане преимущества настоящего раскрытия, что растения, продуцирующие Cry1Ca и Cry1Ab (включающие в себя инсектицидные участки указанных белков), будут полезными для замедления или предотвращения развития устойчивости к любому одному из указанных инсектицидных белков. Например, ген cry1Fa также может состоять из этих генов/белков из двух оснований.

Настоящее изобретение также относится к открытию, что Cry1Ca и Cry1Ab не конкурируют друг с другом за связывание с рецепторами кишечника кукурузной листовой совки (Spodoptera frugiperda; FAW).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 показывает конкурентное связывание корового токсина Cry1Ab, корового токсина Cry1Ca и корового токсина Cry1Ab, меченного ¹²⁵I, с мембранными везикулами щеточной каймы (BBMV) Spodoptera frugiperda.

Фиг.2 показывает конкурентное связывание корового токсина Cry1Ca, корового токсина Cry1Ab и корового токсина Cry1Ab, меченного ¹²⁵I, с BBMV Spodoptera frugiperda.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:1 показывает коровый Cry1Ca/протоксин Cry1Ab химерный белок 1164 aa (DIG-152),

SEQ ID NO:2 показывает коровый токсин Cry1Ca,

SEQ ID NO:3 показывает коровый токсин Cry1Ab.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение частично относится к неожиданному открытию, что Cry1Ca обладает высокой активностью против популяции огневки сахарного тростника (SCB; Diatraea saccharalis), которая устойчива к Cry1Ab. Соответственно, настоящее изобретение частично относится к неожиданному открытию, что Cry1Ca можно использовать в комбинации или в "комплекте" с Cry1Ab для борьбы с развитием устойчивости к любому одному из упомянутых инсектицидных белков. Иначе говоря, настоящее изобретение частично относится к неожиданному открытию, что популяция огневки сахарного тростника, выбранная по устойчивости к Cry1Ab, не обладает устойчивостью к Cry1Ca; популяция огневки сахарного тростника с устойчивостью к токсину Cry1Ab является восприимчивой (то есть, не проявляет перекрестной устойчивости) к Cry1Ca. Таким образом, настоящее изобретение включает в себя использование токсина Cry1Ca для контроля популяций огневки сахарного тростника, которые являются устойчивыми к Cry1Ab.

Специалистам в данной области техники будет очевидно, в плане преимущества настоящего раскрытия, что растения, продуцирующие Cry1Ca и Cry1Ab (включающие в себя инсектицидные участки указанных белков), будут полезными для замедления или предотвращения развития устойчивости к любому одному из указанных инсектицидных белков.

Настоящее изобретение включает в себя использование Cry1Ca для защиты сахарного тростника и других экономически важных видов растений от повреждения и потери урожая, вызванных огневкой сахарного тростника или популяциями огневки сахарного тростника, которые стали устойчивыми к Cry1Ab. Огневка сахарного тростника может также быть вредителем кукурузы. Это особенно актуально для некоторых стран Центральной и Южной Америки, например, Бразилии и Аргентины. Таким образом, согласно настоящему изобретению также можно защищать, например, кукурузу.

Настоящее изобретение, таким образом, описывает совокупность мероприятий по управлению устойчивостью насекомых (IRM) для предотвращения или уменьшения развития устойчивости к Cry1Ab и/или Cry1Ca у огневки сахарного тростника.

Дополнительно, исследования связывания рецептора с помощью радиомеченого Cry1Ca и ткани насекомого Spodoptera frugipera; кукурузной листовой совки (FAW), показали, что Cry1Ab не конкурирует за участок высокоаффинного связывания, с которым связывается Cry1Ca. Эти результаты указывают, что комбинацию Cry1Ab и Cry1Ca можно использовать как эффективный способ снижения развития устойчивости в популяциях насекомого (таких как FAW и SCB) к белкам Cry1Ab и/или Cry1Ca для растений (таких как кукуруза и сахарный тростник), продуцирующих оба белка. Совместные исследования токсина показали, что белок Cry1Ca связывается с двумя белками в BBMV у S.frugiperda, один из которых имеет молекулярную массу 40 кДа и другой 44 кДа, где белок Cry1Ab связывается с единственным белком 150 кДа (Aranda et al., 1996) и его не задействовали в исследованиях неконкурентного связывания.

Таким образом, настоящее изобретение также включает в себя комбинацию Cry1Ca и Cry1Ab в качестве совокупности мероприятий IRM по снижению развития устойчивости кукурузной листовой совки и/или огневки сахарного тростника к какому-либо белку, или по борьбе с устойчивостью популяций огневки сахарного тростника, проявляемой к Cry1Ab.

Настоящее изобретение относится к следующему: композициям для контроля чешуекрылых вредителей, где указанные композиции содержат клетки, которые экспрессируют коровый токсин-содержащий белок Cry1Ca и коровый токсин-содержащий белок Cry1Ab;

к клеткам-хозяевам, трансформированным для экспрессии обоих белков: корового токсин-содержащего белка Cry1Ab и корового токсин-содержащего белка Cry1C, где указанный хозяин представляет собой клетку микроорганизма или растения (полунуклеотидный субъект (субъекты) предпочтительно находятся в генетической конструкции под контролем промотора, не происходящего из Bacillus thuringiensis (функционально связанного с ним/содержащими его); рассматриваемые полинуклеотиды могут содержать кодон, используемый для усиления экспрессии в растении);

к способу контроля чешуекрылых вредителей, содержащему контакт указанных вредителей или окружающей среды указанных вредителей с эффективным количеством композиции, которая продуцирует коровый токсин-содержащий белок Cry1Ab, и к клетке, экспрессирующей коровый токсин-содержащий белок Cry1C;

к растению (такому как, например, кукуруза, или соя, или хлопок, или сахарный тростник), которое содержит ДНК, кодирующую коровый токсин-содержащий белок Cry1Ca, и ДНК, кодирующую коровый токсин-содержащий белок Cry1Ab; и к семенам такого растения;

к растению (такому как, например, кукуруза, или соя, или хлопок, или сахарный тростник), где в указанное растение кукурузу была вставлена ДНК, кодирующая коровый токсин-содержащий белок Cry1Ca, и ДНК, кодирующая коровый токсин-содержащий белок Cry1Ab; и к семенам такого растения.

Авторы изобретения в биотестах с искусственной питательной средой продемонстрировали, например, что Cry1Ca (белок из рекомбинантного штамма Pseudomonas fluorescens MR1206/DC639; плазмида pMYC2547), обладает высокой эффективностью для контроля популяций огневки сахарного тростника (SCB; Diatraea saccharalis), которые были выбраны по устойчивости к Cry1Ab. Это является показателем полезности Cry1Ca для контроля популяций SCB, которые устойчивы к Cry1Ab, или для снижения развития устойчивости к Cry1Ab в популяциях SCB.

Частично исходя из описанных в изобретении данных, считается, что совместная экспрессия Cry1Ca и Cry1Ab может создать высокоэффективный комплекс IRM для контроля SCB. Для расширения спектра действия к указанной комбинации можно добавлять другие белки. Например, для кукурузы, добавление Cry1Fa сможет создать комплекс IRM против европейского кукурузного мотылька (ECB), Ostrinia nubilalis (Hübner), при добавлении еще одного МОА создается комплекс для контроля огневки сахарного тростника SCB.

Информацию о белке Cry1C как потенциальном биоинсектициде для растений см. в публикации (Avisar et al. 2009). Avisar D, Eilenberg H, Keller M, Reznik N, Segal M, Sneh B, Zilberstein A (2009) The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry1C as a potential bioinsecticide in plants. Plant Science 176:315-324.

Рецепторы насекомых. Как описано в разделе примеров, исследования конкурентного рецепторного связывания с использованием радиомеченого корового белка-токсина Cry1Ca показали, что коровый белок-токсин Cry1Ab не конкурирует за присутствующий в тканях насекомых FAW высокоаффинный сайт связывания, с которыми связывается Cry1Ca. Эти результаты показывают, что комбинация белков Cry1Ab и Cry1Ca может быть эффективным средством для снижения развития устойчивости в популяциях FAW к Cry1Ab (и аналогично, для снижения развития устойчивости к Cry1Ca), и, вероятно, будет повышать уровень устойчивости к этому вредителю кукурузных растений, экспрессирующих оба белка.

Исходя из этих данных, также предполагается, что Cry1Ca будет эффективен для контроля популяций SCB, которые обладают устойчивостью к Cry1Ab. Один вариант осуществления состоит в использовании упомянутых белков Cry в регионах, где Cry1Ab перестал быть эффективным для контроля SCB по причине развития устойчивости. Другой вариант осуществления состоит в использовании Cry1Ca в комбинации с Cry1Ab для снижения развития устойчивости у SCB к белку Cry1Ab.

Комбинации токсинов, описанных в изобретении, можно использовать для контроля чешуекрылых вредителей. Взрослые чешуекрылые, то есть, бабочки и моли, питаются в основном цветочным нектаром. Почти все личинки, то есть, гусеницы, питаются растениями, и многие из личинок являются серьезными вредителями. Гусеницы питаются на листьях или внутри листьев, или поедают корни или стебли растения, где они лишают растение питательных веществ и часто разрушают конструкцию физической опоры растения. Дополнительно, гусеницы питаются фруктами, тканями и хранящимся зерном и мукой, разрушая указанные продукты для продажи или в значительной степени уменьшая их стоимость. Упоминаемые в изобретении чешуекрылые вредители относятся к разным стадиям жизни вредителя, включая в себя личиночные стадии.

Химерные токсины настоящего изобретения содержат полный N-концевой токсический участок корового токсина B.t. и, в некоторой точке после конца участка токсина белок несет транзицию в гетерологичной последовательности протоксина. N-концевой токсический участок токсина B.t. называется согласно изобретению "коровым" токсином. Транзиция в гетерологичном сегменте протоксина может происходить примерно около соединения токсина/протоксина или, как альтернатива, может сохраняться участок нативного протоксина (расположенный после участка токсина) с транзицией в гетерологичном протоксине, расположенной в 5'-3' направлении.

В качестве примера, один химерный токсин настоящего изобретения имеет полный коровый токсический участок Cry1Ab (аминокислоты от 1 до 601) и гетерологичный протоксин (аминокислоты от 602 до C-конца). В одном предпочтительном варианте осуществления участок химерного токсина, содержащий протоксин, происходит из белка-токсина Cry1Ab. В качестве второго примера, второй химерный токсин настоящего изобретения, показанный в SEQ ID NO:1 (DIG-152), имеет полный коровый токсический участок Cry1Ca (аминокислоты от 1 до 619) и гетерологичный протоксин (аминокислоты от 620 до C-конца). В предпочтительном варианте осуществления участок химерного токсина, содержащий протоксин, происходит из белка-токсина Cry1Ab.

Специалистам в данной области техники будет очевидно, что токсины B.t., даже относящиеся к конкретному классу, например, к Cry1Ca, до некоторой степени могут варьировать по длине и точной локализации транзиции от участка токсина до участка протоксина. Обычно длина токсинов Cry1Ca составляет от около 1150 до около 1200 аминокислот. Транзиция от участка токсина до участка протоксина будет обычно занимать участок в диапазоне от около 50% до около 60% от общей длины токсина. Химерный токсин настоящего изобретения будет полностью включать в себя всю протяженность этого корового N-концевого участка токсина. Таким образом, химерный токсин будет содержать по меньшей мере около 50% полноразмерных B.t. токсинов Cry1Ca или Cry1Ab. Обычно они будут составлять по меньшей мере около 590 аминокислот. В отношении участка протоксина, полноразмерный участок Cry1(b) протоксина расположен от конца участка токсина до C-конца молекулы. Конец этого участка длиной примерно от 100 до 150 аминокислот является наиболее важным для включения в него химерного токсина настоящего изобретения.

Гены и токсины. Гены и токсины, полезные согласно настоящему изобретению, включают в себя не только полноразмерные раскрытые последовательности, но также и фрагменты этих последовательностей, варианты, мутанты и слитые белки, которые сохраняют свойства пестицидной активности токсинов, конкретно описанных в изобретении в качестве примеров. Используемые в изобретении термины "варианты" или "изменения" генов относятся к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют одинаковые токсины, или которые кодируют эквивалентные токсины, обладающие пестицидным действием. Используемый в изобретении термин "эквивалентные токсины" относится к токсинам, имеющим одинаковое или по существу одинаковое биологическое действие против целевых вредителей, как и токсины, указанные в формуле изобретения.

Используемые в настоящем изобретении пределы идентичности последовательностей составляют около 95% (белки Cry1Ab и 1Са), 78% (Cry1A и Cry1C) и 45% (Cry1), см. публикации "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Эти пределы также можно применять только для коровых токсинов (для токсинов Cry1Ab и Cry1C). Перечень номеров GENBANK, приведенный ниже в Приложении A, также можно использовать для получения последовательности для любого из генов и белков, раскрытых или упомянутых в настоящем изобретении.

Специалистам в данной области техники будет очевидно, что существует ряд способов идентификации и получения генов, кодирующих активные токсины. Конкретные гены или участки генов, упомянутые в изобретении в качестве примера, можно выделять из коллекций депозитария культур, как описано выше. Эти гены, или их участки или варианты, также можно конструировать искусственно, например, при помощи синтезатора генов. Вариации генов можно легко конструировать с помощью стандартных технологий создания точечных мутаций. Также можно создавать фрагменты этих генов согласно стандартным методикам с использованием коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз. Например, можно использовать ферменты, такие как Bal31, или сайт-направленный мутагенез для систематического отсечения нуклеотидов от концов этих генов. Также можно получать гены, кодирующие активные фрагменты, с помощью ряда ферментов рестрикции. Можно использовать протеазы для прямого создания активных фрагментов упомянутых токсинов.

Фрагменты и эквиваленты, которые сохраняют пестицидное действие рассматриваемых токсинов, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, благодаря избыточности генного кода множество разных последовательностей ДНК может кодировать раскрытые в изобретении аминокислотные последовательности. Специалистам в данной области техники будут очевидны способы создания таких альтернативных последовательностей ДНК, кодирующих одинаковые, или по существу аналогичные токсины. Эти различные последовательности ДНК входят в объем настоящего изобретения. Используемое в изобретении понятие "по существу аналогичная" последовательность относится к последовательностям, имеющим аминокислотные замены, делеции, добавления или инсерции, которые фактически не влияют на пестицидное действие. В это определение также включены фрагменты, сохраняющие пестицидное действие.

Дополнительным способом идентификации генов и генных участков, кодирующих токсины и полезных согласно настоящему изобретению, является использование олигонуклеотидных зондов. Эти зонды представляют собой обнаружимые нуклеотидные последовательности. Детекцию таких последовательностей можно проводить с помощью подходящей метки, или можно задействовать флуоресцентные свойства, как описано в международной патентной заявке № WO 93/16094. Как известно в данной области техники, если при гибридизации молекулы зонда и образца нуклеиновой кислоты образуется прочная связь между этими двумя молекулами, то обоснованно предполагается, что зонд и образец имеют значительную степень гомологии. Предпочтительно, гибридизацию проводят при строгих условиях способами, известными в данной области техники, которые описаны, например, авторами Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Некоторые примеры концентраций солей и температурных комбинаций представляют собой (в порядке увеличения степени строгости): 2 X SSPE или SSC (раствор хлорида и цитрата натрия) при комнатной температуре; 1 X SSPE или SSC при 42°C; 0,1 X SSPE или SSC при 42°C; 0,1 X SSPE или SSC при 65°C. Детекция зонда представляет собой общепринятый способ для определения факта проведения гибридизации. Такой анализ зондов обеспечивает быстрый способ идентификации кодирующих токсины генов настоящего изобретения. Нуклеотидные сегменты, которые используются в качестве зондов согласно изобретению, можно синтезировать с помощью синтезатора ДНК и стандартных методик. Указанные нуклеотидные последовательности можно также использовать в качестве ПЦР-праймеров для амплификации генов настоящего изобретения.

Конкретные токсины настоящего изобретения приведены в изобретении в качестве конкретных примеров. Поскольку упомянутые токсины являются просто примерами токсинов настоящего изобретения, будет очевидно, что настоящее изобретение содержит варианты или эквиваленты токсинов (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), обладающие пестицидным действием, которое одинаково или сходно с действием рассматриваемого токсина. Эквивалентные токсины и рассматриваемый токсин имеют аминокислотную гомологию. Эта аминокислотная гомология обычно превышает 75%, предпочтительно составляет более 90%, и наиболее предпочтительно более 95%. Наиболее выраженную аминокислотную гомологию выявляют в самых важных областях токсина, которые обуславливают биологическое действие или вовлечены в предопределение трехмерной конфигурации, которая в конечном счете отвечает за биологическое действие. В этом отношении подходят конкретные замены аминокислоты, и можно предполагать, что эти замены находятся в областях, не имеющих решающего значения для действия, или они представляют собой консервативные аминокислотные замены, которые не затрагивают трехмерную конфигурацию молекулы. Например, аминокислоты могут относиться к следующим классам: неполярные, незаряженные полярные, щелочные и кислые. Консервативные замены, посредством которых аминокислота одного класса заменяется на другую аминокислоту того же типа, входят в объем настоящего изобретения, если эта замена в значительной степени не изменяет биологическое действие соединения. В таблице 1 приведен перечень примеров аминокислот, принадлежащих к каждому классу.

Таблица 1

В некоторых случаях также можно делать неконсервативные замены. Решающим фактором является то, что эти замены не должны в значительной степени снижать биологическое действие токсина.

Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины настоящего изобретения, можно вставлять в широкий спектр клеток-хозяев микроорганизмов или растений. Экспрессия генов токсина прямо или опосредованно приводит к внутриклеточной продукции и сохранению пестицида. Можно использовать конъюгационный перенос и рекомбинантный перенос для создания штамма B.t., который экспрессирует оба токсина настоящего изобретения. Другие организмы-хозяева также можно трансформировать одним или двумя генами токсина, используемых в этом случае для достижения синергетического эффекта. Можно применять микроорганизмы с подходящими микробными хозяевами, например, Pseudomonas, у вредителя в месте их размножения и поглощения. Результатом является контроль над вредителем. Альтернативно, микроорганизм, являющийся хозяином гена токсина, можно обрабатывать при условиях, которые пролонгируют действие токсина и стабилизируют клетку. Затем обработанную клетку, которая сохраняет токсическую активность, можно применять в окружающей среде целевого вредителя.

Если ген токсина B.t. внедряют в микроорганизм-хозяин посредством подходящего вектора, и указанный хозяин используется в окружающей среде в живом состоянии, имеет значение использование конкретных микроорганизмов-хозяев. Хозяев выбирают из микроорганизмов, которые обладают известной способностью в одной или более рассматриваемых сельскохозяйственных культур заселять "фитосферу" (филлоплан, филлосферу, ризосферу и/или ризоплан). Выбирают такие микроорганизмы, которые способны успешно конкурировать в конкретной среде (сельскохозяйственные культуры и другие среды обитания насекомых) с микроорганизмами дикого типа, обеспечивать устойчивое сохранение и экспрессию гена, экспрессирующего полипептидный пестицид, и обеспечивать улучшенную защиту пестицида от разложения и инактивации в окружающей среде.

Известно, что большое количество микроорганизмов населяет филлоплан (поверхность листьев растения) и/или ризосферу (почву, окружающую корни растения) у широкого спектра важных сельскохозяйственных культур. Эти микроорганизмы включают в себя бактерии, морские водоросли и грибы. Особый интерес вызывают такие микроорганизмы, как, например, бактерии рода Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes; грибы, особенно дрожжи, например, рода Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес вызывают такие фитосферные виды бактерий как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii; и фитосферные виды дрожжей, такие как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес вызывают пигментированные микроорганизмы.

Широкое разнообразие путей доступно для внедрения в микроорганизм-хозяин гена B.t., кодирующего токсин при условиях, которые позволяют устойчиво сохранять и экспрессировать ген. Эти способы известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 5135867, который включен в изобретение путем ссылки.

Обработка клеток. Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, экспрессирующие токсины B.t., можно обрабатывать для пролонгирования действия токсина и стабилизации клетки. Образуемая микрокапсула пестицида содержит токсин B.t. или токсины в клеточной структуре, которая была стабилизирована, и будет защищать токсин в ходе применения микрокапсулы в среде вредителя-мишени. Подходящие клетки-хозяева могут включать в себя или прокариоты или эукариоты, и обычно ограничены клетками, которые не продуцируют веществ, являющихся токсичными для высших организмов, например, млекопитающих. Вместе с тем, можно использовать организмы, которые продуцируют токсичные вещества для высших организмов, если эти токсичные вещества нестабильны или уровень применения является достаточно низким, чтобы избежать любой вероятности токсичного воздействия на хозяина-млекопитающего. В качестве хозяев особый интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы.

Обычно для обработки задействуют интактные клетки, в основном в пролиферативной форме, а не в виде споры, хотя в некоторых случаях можно использовать споры.

Обработку микробной клетки, например, микроорганизма, содержащего ген или гены токсина B.t., можно осуществлять химическими или физическими способами, или комбинацией химических и/или физических способов при условии, что отсутствует и вредное воздействие технологии на свойства токсина, и уменьшение способности клеток к защите токсина. Примерами химических реагентов являются галогеновые агенты, в частности, галогены с атомными номерами 17-80. Более конкретно, можно использовать иод при умеренных условиях и в течение достаточного времени для достижения желательных результатов. Другие подходящие способы включают в себя обработку альдегидами, такими как глутаральдегид; противоинфекционными агентами, например, зефиран хлоридом и цетилпиридиния хлоридом; спиртами, такими как изопропил и этанол; различными гистологическими фиксаторами, такими как иодный раствор Люголя, фиксатор Боуэна, различные кислоты и фиксатор Хэлли (См.: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); или комбинацию физических воздействий (нагревание) и химических агентов, которые сохраняют и пролонгируют действие токсина, продуцируемого в клетке при введении клетки в среду хозяина. Примерами физических способов является коротковолновое излучение, например, гамма-излучение и рентгеновское излучение, замораживание, ультрафиолетовое облучение, лиофилизация и т.п. Способы обработки микробных клеток раскрыты в патентах США № 4 695455 и 4695462, включенных в изобретение путем ссылки.

Обычно клетки имеют повышенную структурную устойчивость, которая увеличивает их стабильность в условиях окружающей среды. Если пестицид находится в предварительной форме, необходимо выбирать способ обработки клеток, который не ингибирует превращение пре-формы в зрелую форму пестицида посредством патогена целевого вредителя. Например, формальдегид сшивает белки и способен ингибировать превращение пред-формы полипептида пестицида. Способ обработки должен сохранять по меньшей мере значительную часть свойств биодоступности или биоактивности токсина.

Особенно важные свойства для отбора клеток-хозяев в целях продукции включают в себя простоту внедрения гена или генов B.t. в клетку-хозяин, доступность систем экспрессии, эффективность экспрессии, стабильность пестицида в хозяине и присутствие дополнительных генетических способностей. Рассматриваемые свойства для применения в качестве пестицидной микрокапсулы включают в себя защитные характеристики для пестицида, такие как толстые клеточные стенки, пигментация и внутриклеточная упаковка или образование телец включения; выживание в водной среде; отсутствие токсичности для млекопитающих; привлекательность для поглощения вредителями; способность легко вызывать гибель и фиксироваться без повреждения токсина; и т.п. Другие важные условия включают в себя простоту изготовления и использования, экономичность, стабильность при хранении и тому подобное.

Рост клеток. Клетку-хозяин, содержащую инсектицидные ген или гены B.t., можно выращивать в любой удобной питательной среде, в которой конструкция ДНК дает селективное преимущество, и во всей среде или по существу во всех клетках в селективной среде обеспечивается сохранение гена B.t. Затем эти клетки можно собирать общепринятыми способами. Альтернативно, клетки можно обрабатывать перед их сбором.

Клетки B.t., продуцирующие токсины по изобретению, можно культивировать с использованием стандартных в данной области техники сред и способов ферментации. После завершения цикла ферментации бактерии можно собирать из ферментационного бульона первой сепарацией спор B.t. и кристаллов с помощью способов, известных в данной области. Восстановленные споры B.t. и кристаллы можно объединять в смачивающийся порошок, жидкий концентрат, гранулы или другие рецептуры с помощью добавления сурфактантов, диспергирующих агентов, инертных носителей и других компонентов, чтобы облегчить обработку и применение для конкретных целевых вредителей. Эти рецептуры и методики применения широко известны в данной области техники.

Рецептуры. Рецептуры гранулированных приманок, содержащие аттрактант и споры, кристаллы и выделенные B.t. токсины, или рекомбинантные микроорганизмы, которые содержат гены, получаемые из изолятов B.t., раскрытые в настоящем изобретении, можно применять на почве. Рецептуру продукта также можно применять в качестве покрытия семян, или для обработки корней, или для полной обработки растения на более поздних этапах цикла злакового растения. Для обработки растений и почвы можно использовать B.t.-клетки в виде смачивающихся порошков, гранул или порошковых препаратов путем смешивания с различными инертными материалами, такими как неорганические минералы (филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты и т.п.) или растительными материалами (порошок из кукурузных початков, рисовая шелуха, скорлупа грецкого ореха и т.п.). Рецептуры могут включать в себя адгезивные адъюванты, стабилизирующие агенты, другие пестицидные добавки или сурфактанты. Жидкие рецептуры могут иметь водную или неводную основу и использоваться в виде пены, гелей, суспензий, эмульгируемых концентратов или подобных форм. Компоненты могут включать в себя реологические агенты, сурфактанты, эмульгаторы, диспергирующие агенты или полимеры.

Специалистам в данной области техники будет очевидно, что концентрация пестицида может широко варьировать в зависимости от природы конкретной рецептуры, в частности, является ли она концентратом или изготовлена для непосредственного применения. Пестицид может присутствовать в количестве по меньшей мере 1% веса и может составлять 100% веса. В сухих рецептурах пестицид может составлять примерно от 1 до 95% веса, тогда как жидкие рецептуры обычно могут иметь примерно от 1 до 60% веса твердых частиц в жидкой фазе. В рецептурах обычно может находиться от около 10² около до 10⁴ клеток/мг. Указанные рецептуры можно применять в количестве примерно от 50 мг (в жидком или сухом виде) до 1 кг или больше на гектар.

Рецептуры можно применять в среде обитания чешуекрылых вредителей, например, на листве или на почве, путем распыления, опудривания, опрыскивания или подобными способами.

Трансформация растений. Предпочтительным рекомбинантным хозяином, продуцирующим инсектицидные белки настоящего изобретения, является трансформированное растение. Гены, кодирующие Bt белки-токсины, раскрытые в изобретении, можно вставлять в клетки растения, используя множество способов, известных в данной области техники. Например, для подготовки к вставке чужих генов в высшие растения доступно большое количество векторов клонирования, содержащих систему репликации в Escherichia coli и маркер, позволяющий проводить селекцию трансформированных клеток. Векторы содержат, например, среди прочего, pBR322, серии pUC, серии M13mp, pACYC184. Соответственно, фрагмент ДНК, несущий последовательность, кодирующую Bt белок-токсин, можно вставлять в вектор на подходящем участке рестрикции. Полученную плазмиду используют для трансформации в E. coli. Клетки E. coli выращивают в подходящей питательной среде, затем собирают и лизируют. Восстанавливают плазмиду. В качестве способов анализа обычно проводят анализ последовательностей, анализ рестрикции, электрофорез и другие биохимические и молекулярно-биологические тесты. После каждой манипуляции используемую последовательность ДНК можно расщеплять и соединять со следующей последовательностью ДНК. Каждую последовательность плазмиды можно клонировать в той же плазмиде или в других плазмидах. В зависимости от способа вставки желательных генов в растение могут потребоваться другие последовательности Д