Способ функционализации поверхностей для выявления аналитов

Способ функционализации поверхностей для выявления аналитов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу функционализации поверхностей для выявления аналитов. Указанный способ функционализации поверхностей, в частности, основан на устройстве для выявления аналитов, которое можно применять для осуществления различных химических, биологических и диагностических анализов. В изобретении также предлагаются специальные полимеры, которые подходят для осуществления указанного способа функционализации поверхностей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Эталонным анализом в диагностике является так называемый анализ «ELISA». С использованием такого анализа можно выявлять или определять аналит в биологической жидкости. В общем, лунки планшета для микротитрования покрывают (главным образом, за счет гидрофобного взаимодействия) улавливающим элементом (например, антителом), способным специфично связываться с искомым аналитом (в частности, с антигеном). Затем в лунки микропланшета помещают раствор для тестирования, и если искомая молекула присутствует, она специфично связывается с улавливающим элементом.

Индикаторный элемент также способный связываться с искомой молекулой, добавляют в лунки. Таким индикаторным элементом может быть, например, фермент, который катализирует образование окрашенного продукта, так что такой индикаторный элемент можно оценивать количественно, используя колориметрию.

Анализ ELISA хорошо подходит для автоматизации. Однако поверхности, обычно используемые для такого анализа (из полистирола) не могут легко иммобилизовать гидрофильные молекулы, такие как отрицательно заряженные полисахариды или молекулы с низкой молекулярной массой. Также было предложено, например, конъюгировать полисахарид с полилизином, для того чтобы можно было фиксировать его на поверхности полистирола, используя способность полилизина к адсорбции (Leinonen and Frasch, Infect. Immun., 38(3): 1203-7, 1982).

Анализ ELISA также имеет ограничения, связанные с зарядом поверхности, поскольку взаимодействия обычно являются более специфичными с отрицательно заряженными поверхностями (Graves, J. Immunol. Methods, 111(2): 157-66, 1988), тогда как поверхности пластмассы являются гидрофобными.

Кроме того, стандартный анализ ELISA ограничен однопараметрическими анализами, что означает, что доступна одна часть информации в одном месте и для одного образца. В том случае, когда требуется проведение нескольких анализов на одном и том же образце, необходимо выполнять несколько анализов типа ELISA, предпочтительно в параллели, либо в обычном масштабе, либо в уменьшенном масштабе в устройстве, известном как «биочип». В настоящее время на ранке продается очень небольшое количество биочипов, и в устройства, имеющихся в настоящее время в продаже, главным образом, используют предметные стекла для микроскопии в качестве подложек. Такая подложка плохо подходит для массового применения.

С другой стороны, пластиковые подложки плохо подходят для изготовления биочипов. Обычно получают неудовлетворительное соотношение сигнал/шум при прямой адсорбции на подложке вследствие значительной неспецифичной адсорбции аналитов. Гидрофобные пластиковые поверхности также имеют недостаток, который заключается в том, что они денатурируют белки и поэтому не могут быть использованы без модификации.

Однако возможности для функционализации пластмассы за счет химической модификации полимеров, о которых идет речь, очень ограничены, так как можно вводить немногие химические группы. Кроме того, небольшое изменение в составе полимеров или даже вариации состава от партии к партии могут приводить к различиям в свойствах функционализированных подложек.

Кроме того, серьезные ограничения встречаются во время литографического изготовления биочипа, так как на такие подложки трудно наносить нанокапли воспроизводимым образом (так чтобы получить нанесения, которые были бы четко очерченными и регулярными). Наиболее часто используемый на практике способ нанесения капель, контактная литография иглами, в данном контексте является технической проблемой, так что обычно используют бесконтактный способ нанесения пьезоэлектрического типа. Однако ввиду того, что последний способ является медленным, он не очень подходит для промышленного производства.

Были предложены некоторые примеры функционализации 96-луночных пластиковых планшетов. Так плазменный способ предложен в публикации Marson, Robinson с соавторами, Glycobiology 19(2): 1537-46 (2009), для получения основанных на сахарах чипов. Такой способ связан с трудностями сохранения функциональности сахара после иммобилизации. Другой пример основа на использовании стрептавидина для покрытия пластиковых поверхностей (Gehring, Albin с соавторами, Anal. Bioanal. Chem., 5 April 2008).

В документе EP 1953555 описано устройство, содержащее пластиковую подложку, покрытую металлической пленкой, на которой иммобилизуют физиологически активное вещество и соединение для создания водородных связей.

В документе EP 2030677 описан биосенсор, содержащий подложку, покрытую металлической пленкой, с помощью которой фиксируют анионный полимер.

В таких документах не раскрыто прямое взаимодействие между полимером и пластиковой подложкой.

Поэтому все еще существует необходимость в получении устройств для выявления аналитов, которые легки в производстве, устойчивы, легки в применении и/или которые позволяют параллельно выявлять большие количества аналитов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение, во-первых, относится к устройству для выявления аналитов, включающему в себя пластиковую подложку, покрытую, по меньшей мере, частично связывающими полимерами, фиксированными на подложке нековалентно, при этом указанные связывающие полимеры содержат полисахаридный остов, снабженный ароматическими группами и группами карбоновой кислоты.

Согласно одному варианту полисахаридный остов представляет собой остов из декстрана, молекулярная масса которого предпочтительно составляет от 15000 до 100000 и, в частности, более предпочтительно от 30000 до 60000.

Согласно одному варианту полисахаридный остов дополнительно снабжен реакционно-способными группами, при этом указанные реакционно-способные группы предпочтительно имеют форму -X-CONH-Z', где X означает неразветвленную или разветвленную, замещенную или незамещенную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, в частности, X более предпочтительно означает CH₂ и Z' означает группу, которая способна связываться с другой молекулой.

Согласно одному варианту группы карбоновой кислоты имеют форму -X-COOH, где X означает неразветвленную или разветвленную, замещенную или незамещенную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, при этом X предпочтительно означает CH₂.

Согласно одному варианту ароматические группы имеют форму -X-CONH-Z, где X означает неразветвленную или разветвленную, замещенную или незамещенную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, при этом X предпочтительно означает CH₂, и Z означает арильную функцию, предпочтительно содержащую от 6 до 30 атомов углерода, при этом Z предпочтительно означает необязательно замещенную бензильную функцию, такую как -CH₂-Ph или -CH₂-Ph-пара-OH.

Согласно одному варианту связывающие полимеры содержат:

- от 0,4 до 0,8 ароматических групп, предпочтительно от 0,4 до 0,6 ароматических групп, предпочтительно от 0,45 до 0,6 ароматических групп на единицу сахарида полисахаридного остова; и/или

- от 0 до 0,8 реакционно-способных групп, предпочтительно от 0 до 0,6 реакционно-способных групп на единицу сахарида полисахаридного остова; и/или

- от 0,5 до 1,5 ароматических групп, групп карбоновой кислоты и реакционно-способных групп в совокупности, предпочтительно от 0,9 до 1,3 ароматических групп, групп карбоновой кислоты и реакционно-способных групп в совокупности на единицу сахарида полисахаридного остова.

Согласно одному варианту подложкой является подложка из полистирола, поликарбоната, поли(метилметакрилата) или полипропилена, и предпочтительно из полистирола.

Согласно одному варианту устройство содержит улавливающие элементы, иммобилизованные на связывающих полимерах, при этом указанные улавливающие элементы предпочтительно выбраны из полипептидов, необязательно модифицированных и/или конъюгированных, сахаридов, олигосахаридов или липополисахаридов, вирусов или вирусных фрагментов и клеток, при этом улавливающие элементы предпочтительно иммобилизованы на связывающих полимерам посредством адсорбции или ковалентного связывания с реакционно-способными группами F.

Согласно одному варианту устройство содержит множество зон для выявления, при этом зоны для выявления предпочтительно содержат разные улавливающие элементы.

Согласно одному варианту подложка представляет собой непрозрачное или прозрачное предметные пластины, планшет для микротитрования, набор шариков, чашку для культуры, полоску или палочку.

Изобретение также относится к полимеру, содержащему полисахаридный остов, снабженный ароматическими группами, группами карбоновой кислоты, а также реакционно-способными группами формулы (V):

,

при этом каждый из X и X' означает замещенную или незамещенную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода.

Изобретение также относится к полимеру, содержащему полисахаридный остов, снабженный ароматическими группами, группами карбоновой кислоты, а также реакционно-способными группами формулы (V'):

,

при этом каждый и X и X' означает замещенную или незамещенную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и Pep означает пептидный фрагмент.

Согласно одному варианту в двух вышеупомянутых полимерах X означает CH₂ и/или X' означает (CH₂)₂.

Изобретение также относится к способу производства указанного выше полимера, снабженного реакционно-способными группами формулы (V), включающему в себя:

- получение полисахарида;

- прививку групп карбоновой кислоты на полисахарид; затем

- модификацию части привитых групп карбоновой кислоты, чтобы получить ароматические группы; с последующей или предшествующей

- модификацией другой части привитых групп карбоновой кислоты, чтобы получить реакционно-способные группы формулы (V), при этом указанная модификация включает в себя взаимодействие полисахарида с соединением формулы (VII):

,

в котором X' означает замещенную или незамещенную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода.

Изобретение также относится к способу производства указанного выше полимера, снабженного реакционно-способными группами формулы (V'), включающему в себя:

- получение полимера формулы (V), указанного выше; и

- взаимодействие такого полимера с полипептидом H-Cys-Pep, где Pep означает пептидный фрагмент, и Cys означает остаток цистеина.

Согласно одному варианту описанного выше устройства связывающие полимеры представляют собой вышеупомянутые полимеры (снабженные реакционно-способными группами формулы (V) или (V')).

Изобретение также относится к применению устройства для выявления аналитов, которое описано выше, для выявления и необязательно количественного определения химических молекул, биологических молекул, клеток или живых организмов.

Изобретение также относится к способу производства устройства для выявления аналитов, которое описано выше, включающему в себя:

- получение пластиковой подложки;

- осуществление контакта подложки, по меньшей мере, с одним раствором, содержащим связывающие полимеры.

Согласно одному варианту, такой способ дополнительно включает в себя осуществление контакта подложки с одним или несколькими растворами, содержащими улавливающие элементы.

Изобретение также относится к способу производства устройства для выявления аналитов, которое описано выше, включающему в себя:

- получение пластиковой подложки;

- осуществление контакта подложки с одним или несколькими растворами, содержащими связывающие полимеры, связанные с улавливающими элементами.

Настоящее изобретение позволяет преодолеть недостатки предшествующего уровня техники. Более конкретно, изобретение относится к устройствам для выявления аналитов, которые легки в производстве, устойчивы и легки в применении. Согласно одному варианту такие устройства позволяют выявлять большое количество аналитов параллельно. В частности, изобретение позволяет иммобилизовать гидрофильные и/или небольшие молекулы (а также антитела или белки).

Такой результат достигается за счет функционализации поверхности с использованием связывающих полимеров, имеющих полисахаридный остов. Связывающие полимеры содержат ароматические группы, которые способствуют нековалентной фиксации связывающих полимеров с относительно гидрофобными поверхностями, а также группы карбоновой кислоты для отрицательного заряда связывающих полимеров, с тем, чтобы ограничить явление неспецифичной адсорбции между связывающими полимерами и выявляемыми аналитами (которые само по себе часто являются отрицательно заряженными).

Применение пластиковых и, в частности, полистироловых поверхностей в устройствах согласно изобретению позволяет избежать проблем, связанных со стеклом: риска разбить стекло и связанной с этим опасности для персонала, затрат, связанных с утилизацией отходов, гетерогенности функционализации, связанной с химической природой стекла, высокой стоимости подложки и характеризации, трудности распределения на подложке.

Согласно некоторым конкретным вариантам изобретение также обладает одним или предпочтительно несколькими преимущественными признаками, перечисленными ниже.

- Связывающие полимеры легко синтезировать в больших количествах, и они могут быть охарактеризованы обычными аналитическими способами (ЯМР, измерение pH, микроанализ), что позволяет строго контролировать производство.

- Связывающие полимеры фиксируют на поверхностях благодаря простой адсорбции (нековалентному связыванию), в частности, посредством ароматических групп связывающих полимеров. Адсорбция является способом фиксации, который особенно прост для осуществления, надежен и не очень чувствителен к умеренному варьированию физико-химических свойств поверхностей. В любом случае также можно корректировать плотность ароматических групп в связывающих полимерах в зависимости от природы поверхностей.

- Изобретение может быть осуществлено, исходя из подложек, которые в настоящее время широко доступны и стоят недорого: планшеты для микротитрования, изготовленные из полистирола, чашки Петри и т.д..

- Изобретение также может быть использовано для изготовления биочипов, т.е. миниатюрных устройств для выявления аналитов для параллельного выявления большого количества аналитов на основе пластиковых и, в частности, полистироловых подложек.

- Функционализацию поверхности согласно изобретению осуществляют благодаря фиксации улавливающих элементов (или зондов) на связывающих полимерах, либо ковалентно (посредством реакционно-способных групп, присутствующих на связывающих полимерах), в частности, когда улавливающие элементы представляют собой небольшие молекулы, либо нековалентно (посредством адсорбции). Таким образом, изобретение обеспечивает большую гибкость в применении.

- Функциональные группы преимущественно стабильны (сохраняют свои свойства) в присутствии влаги или на воздухе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показана взаимосвязь между степенью замещения ароматическими группами (по оси y) в полимере PsAcAr1 из примера 3 и количеством эквивалентов бензиламина (по оси x). Фигура будет описана в примере 4.

На фиг.2 показана взаимосвязь между степенью замещения азидными группами (на оси y) в полимере PsAcF1 из примера 7 и количеством эквивалентов азида амина (на оси x). Фигура будет описана в примере 8.

На фиг.3 приведена гистограмма, показывающая измерения углов контактов (в градусах) на функционализированных или не функционализированных полистироловых планшетах. Фигура будет описана в примере 22.

Фиг.4, 5 и 6 иллюстрируют специфичность фиксации конканавалина A (по сравнению с другими лектинами) на полимере согласно изобретению. Фигуры будут описаны в примерах 23 и 24.

Фиг.7 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую влияние степени ароматического замещения на угол контакта (в градусах) на функционализированных планшетах из полистирола. Фигура будет описана в примере 25.

Фиг.8 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую хемоселективное связывание альдегида пептида с поверхностью, функционализированной полимером согласно изобретению. Фигура будет описана в примере 26.

Фиг.9 и 10 представляют собой гистограммы, показывающие функционализацию поверхностей пептидами и выявление с использованием подходящих антител (инкубация с анти-HA-антителом или анти-FLAG-антителом). Фигуры будут описаны в примере 27.

Фиг.11 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую хемоселективное связывание пептида, несущего N-концевой цистеин, с поверхностью, функционализированной полимером согласно изобретению. Фигура будет описана в примере 33.

Фиг.12 и 13 представляют собой диаграммы, иллюстрирующие колориметрическое выявление на биочипе с антителом на дне 96-луночных планшетов из полистирола. Фигуры будут описаны в примере 34.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение описано боле подробно в следующем далее описании, которое не является ограничивающим.

Связывающие полимеры и их производство

Связывающие полимеры, используемые в контексте изобретения, содержат полисахаридный остов (далее сокращенно «Ps»), снабженный группами карбоновой кислоты (далее сокращенно «Ac») и ароматическими группами (далее сокращенно «Ar»). Согласно одному варианту полисахаридный остов также может быть снабжен реакционно-способными группами, отличающимися от вышеупомянутых групп карбоновой кислоты (далее сокращенно «F»).

Под «полисахаридным остовом» подразумевают структуру, образованную совокупностью сахаров (или сахаридных единиц), связанных вместе O-гликозидными связями. Такая структура может быть линейной или разветвленной. Предпочтительно она содержит от 80 до 600 сахаридных единиц и, в частности, более предпочтительно от 150 до 350 сахаридных единиц.

Сахаридные единицы предпочтительно являются циклическими. Они могут быть триозами, тетрозами, пентозами, гексозами или гептозами и предпочтительно они являются гексозами.

«Уровень замещения» или «степень замещения» означает среднее количество заместителей (Ac, Ar или F) на сахаридную единицу. Способы определения степени замещения приведены в разделе «Примеры».

Все группы Ac, Ar и F предпочтительно привиты на некоторых или на всех гидроксильных функциях сахаридных единиц.

Молекулярная масса полисахаридного остова предпочтительно составляет от 15000 до 100000 и, в частности, более предпочтительно от 30000 до 60000.

Полисахаридный остов может быть гомополисахаридного типа (идентичные сахаридные единицы) или гетерополисахаридного типа (разные сахаридные единицы).

В качестве примеров гомополисахаридов можно указать: глюкозаны или глюканы (альфа-глюканы или бета-глюканы), такие как крахмал, гликоген, целлюлоза, декстран, пуллулан, гиалуроновая кислота, хитин или хитозан (деацетилированные формы хитина); арабинаны, ксиланы и пектины. В качестве примеров гетерополисахаридов можно упомянуть камеди, которые представляют собой разветвленные структуры, содержащие D-галактозу, L-арабинозу, L-рамнозу и D-глюкуроновую кислоту, а также гемицеллюлозы.

Согласно предпочтительному варианту сахаридные единицы являются единицами глюкозы (или декстрозы). Предпочтительно полисахаридный остов представляет собой молекулу декстрана, т.е. она имеет основную цепь из молекул глюкозы, связанных вместе α-1,6-гликозидными связями, необязательно с ответвлениями, связанными с главной цепью α-1,2- и/или α-1,3- и/или α-1,4-связями. Декстран доступен в больших количествах, недорого стоит и имеет хорошую растворимость в воде.

В остальной части описания будет упоминаться полисахаридный остов типа декстрана, при этом следует понимать, что такое описание аналогично применимо к другим типам полисахаридных остовов.

Связывающие полимеры согласно изобретению, которые не снабжены реакционно-способными группами F (полимеры типа «PsAcAr»), могут быть получены посредством:

- получения полисахарида Ps (незамещенный полисахаридный остов);

- прививки групп Ac на такой полисахарид так, чтобы получить полимер типа «PsAc»;

- модификации части групп Ac полимера PsAc, чтобы получить полимер PsAcAr.

Таким образом, что касается общей формулы (I), приведенной ниже:

то исходный полимер Ps представляет собой полимер формулы (I), в котором все группы R₁, R₂ и R₃ представляют собой атом водорода; промежуточный полимер PsAc представляет собой полимер формулы (I), в котором некоторые группы R₁, R₂ и R₃ представляют собой атом водорода, а другие группы R₁, R₂ и R₃ представляют собой группу, несущую функцию карбоновой кислоты; и связывающий полимер PsAcAr представляет собой полимер формулы (I), в котором некоторые группы R₁, R₂ и R₃ представляют собой атом водорода, другие группы R₁, R₂ и R₃ представляют собой группу, несущую функцию карбоновой кислоты и третья и последняя часть групп R₁, R₂ и R₃ представляют собой группу, несущую ароматическое ядро.

Группы карбоновой кислоты Ac группы имеют форму -X-COOH, где X означает неразветвленную или разветвленную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, необязательно снабженную одним или несколькими заместителями, выбранными из хлора, брома, кетонной группы, фтора, спиртовой группы, группы карбоновой кислоты и ароматической группы (в частности, фенила). Предпочтительно, такая цепь является линейной и незамещенной и/или содержит не более 5 атомов углерода, не более 4 атомов углерода, не более 3 атомов углерода или не более 2 атомов углерода. Согласно предпочтительному варианту, в котором исключены возможные проблемы, связанные с избыточной реакционной способностью, группы Ac имеют форму -CH₂-COOH (группы метилкарбоновой кислоты).

Понятно, что группы Ac могут быть в ионизованной форме (COOH заменена на COO^-, ассоциированную с противоионом) или в форме соли (COOH заменена, например, на COONa) в зависимости от контекста.

Предпочтительно все группы Ac идентичны, но также можно предусмотреть прививку разных групп Ac.

Ароматические группы Ar имеют форму -Y-Z, где Y означает связывающую группу, и Z означает арильную функцию, предпочтительно, содержащую от 6 до 30 атомов углерода, предпочтительно от 6 до 24 атомов углерода, более предпочтительно от 6 до 12 атомов углерода, и один или несколько заместителей, выбранных из галогенов, -OH, -NH₂, -NO₂, -OR', -COOR', -CONHR', где R' означает алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода. Z может быть моноциклическим или полициклическим и необязательно гетероциклическим. Z предпочтительно означает производное бензола и, в частности, фенильную, бензильную и фенольную группу.

Y предпочтительно означает амидную группу формы -X-CONH-, где X имеет такое же значение, которое указано выше в отношении групп Ac.

Согласно предпочтительному варианту группы Ar представляют собой группы -CH₂-CONH-CH₂-Ph (где Ph означает фенильную группу) или группы -CH₂-CONH-CH₂-Ph-пара-OH.

Предпочтительно все группы Ar являются идентичными, но также можно предусмотреть прививку разных групп Ar.

Стадию прививки групп Ac на полисахарид Ps, чтобы получить полимер PsAc, можно осуществлять посредством взаимодействия полисахарида Ps с соединением карбоновой кислоты, несущим функцию галогена, и предпочтительно функцию хлора.

Например, прививку предпочтительных групп Ac в форме -CH₂-COOH можно получить в результате взаимодействия полисахарида Ps с монохлоруксусной кислотой. Предпочтительно, реакцию осуществляют в присутствии изопропанола.

Стадию модификации части групп Ac полимера PsAc для получения полимера PsAcAr можно осуществить в результате взаимодействия полимера PsAc с соединением типа R-Z, где Z имеете такое же значение, которое указано выше, и R означает функцию, которая способны взаимодействовать с карбоксильной функцией. Предпочтительно R означает аминную функцию, способную образовывать амидную связь с группами Ac.

Например, предпочтительные группы Ar типа -CH₂-CONH-CH₂-Ph могут быть получены в результате взаимодействия полисахарида PsAc с бензиламином. В качестве следующего примера, предпочтительные группы Ar типа -CH₂-CONH-CH₂-Ph-пара-OH могут быть получены в результате взаимодействия полисахарида PsAc с пара-гидроксибензиламином. Предпочтительно реакцию осуществляют в присутствии 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимида.

Связывающие полимеры согласно изобретению, которые снабжены реакционно-способными группами F (полимеры типа «PsAcArF») могут быть получены, исходя из полимеров типа PsAc (таких как полученные выше), в результате модификации части групп Ac с одной стороны до групп F, и с другой стороны до групп Ar. Указанные две стадии модификации могут быть осуществлены в любом порядке.

Другими словами, первый полимер типа PsAcAr может быть получен из полимера PsAc (который описан выше), затем такой полимер типа PsAcAr может быть модифицирован, чтобы получить полимер типа PsAcArF. Также можно получить полимер типа «PsAcF» сначала из полимера PsAc и затем модифицировать такой полимер типа PsAcF, чтобы получить полимер типа PsAcArF (способ, применяемый для такой второй модификации, такой же, как способ, используемый для модификации полимера типа PsAc в полимер типа PsAcAr).

Преимущество таких различных методик заключается в том, что они позволяют модулировать степени замещения в соответствии с тем, требуется ли более высокий уровень групп Ar или более высокий уровень группы F.

Что касается общей формулы (I), приведенной ниже:

то полимер PsAcF представляет собой полимер формулы (I), в котором некоторые группы R₁, R₂ и R₃ представляют собой атом водорода, другие группы R₁, R₂ и R₃ представляют собой группу карбоновой кислоты, и третья и последняя часть групп R₁, R₂ и R₃ представляют собой реакционно-способную группу (отличную от группы карбоновой кислоты); и полимер PsAcArF представляет собой полимер формулы (I), в котором некоторые группы R₁, R₂ и R₃ представляют собой атом водорода, другие группы R₁, R₂ и R₃ представляют собой группу карбоновой кислоты, другие группы R₁, R₂ и R₃ представляют собой ароматическую группу, и четвертая и последняя часть групп R₁, R₂ и R₃ представляют собой реакционно-способную группу (отличную от группы карбоновой кислоты).

Реакционно-способные группы F имеют форму -Y-Z', где Y означает связывающую группу (имеющую такое же значение, которое указано выше), и Z' означает группу, которая способна связываться, в частности, ковалентно, с улавливающим элементом, который более подробно описан ниже. Согласно предпочтительному варианту группа Z' способна образовывать ковалентную связь с полипептидом.

Y предпочтительно представляет собой амидную группу формы -X-CONH-, где X имеет такое же значение, которое указано выше в отношении групп Ac (и X предпочтительно означает CH₂).

Согласно первому предпочтительному варианту группы Z' являются азидными группами (и, в частности, алкилазидами), и группы F предпочтительно являются группами формы -X-CONH-X'-N₃, где каждый из X и X' означает замещенную или незамещенную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, следовательно группы F могут представлять собой, например, группы -CH₂-CONH-(CH₂)₃-N₃. Такие группы особенно применимы в качестве промежуточных групп, позволяющих получать, например, группы типа триазола (смотри третий вариант ниже). Они также могут связываться с некоторыми улавливающими элементами.

Согласно второму предпочтительному варианту группы Z' представляют собой группы гидразида, и группы F предпочтительно являются группами формы -X-CONH-NH₂, где X означает замещенную или незамещенную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, следовательно, группы F могут представлять собой, например, группы -CH₂-CONH-NH₂. Такие группы F способны связываться, например, с альдегидной функцией пептидов. Они также могут способствовать адсорбции полипептидов (нековалентной иммобилизации).

Согласно третьему предпочтительному варианту группы Z' представляют собой группы триазола, предпочтительно замещенные одним или несколькими неразветвленными или разветвленными, замещенными или незамещенными алкильными цепями, содержащими от 1 до 6 атомов углерода, и, следовательно, группы F могут представлять собой, например, группы формулы (II):

,

в которой R₄ означает группу формулы (III):

Группы F такого типа могут связывать некоторые конкретные улавливающие элементы. Группы F группы формулы (II), указанной выше, где R₄ означает -(CH₂)₃OH, используют в качестве негативных контролей в примерах.

Согласно четвертому предпочтительному варианту группы Z' имеют следующую формулу (IV):

,

в которой X' означает неразветвленную или разветвленную алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, необязательно снабженную заместителями типа галогена (в частности Cl или Br). Предпочтительно X' означает (CH₂)₂. Следовательно, согласно указанному четвертому варианту группы F предпочтительно имеют следующую формулу (V):

,

в которой X и X' имеют значение, указанное выше. Согласно особенно предпочтительному варианту X означает CH₂ и X' означает (CH₂)₂.

Группы F, соответствующие указанному четвертому варианту, могут взаимодействовать с молекулами, несущими бета-аминотиольную или гамма-аминотиольную функцию, например, полипептидами, имеющими цистеин или гомоцистеин в N-концевом положении, с образованием амидной связи. Таким образом, связывающие полимеры, соответствующие указанному четвертому варианту, могут связываться с улавливающими элементами, образованными полипептидами, имеющими цистеин или гомоцистеин в N-концевом положении.

Таким образом, в случае цистеина получают связывающий полимер, в котором группы F связывающиеся с улавливающими элементами, имеют формулу (V'):

,

при этом X и X' имеют указанное выше значение, и Pep означает фрагмент пептида, т.е. часть полипептида, содержащую, по меньшей мере, один аминокислотный остаток (предпочтительно последовательность нескольких аминокислотных остатков), с C-концевой функцией (например, COOH или CONH₂).

Все группы F группы могут быт идентичными, или в ином случае может быть предусмотрена прививка разных групп F.

Стадию модификации части групп Ac полимера PsAc (соответственно и полимера PsAcAr) для получения полимера PsAcF (соответственно и полимера PsAcArF) можно осуществлять за счет взаимодействия полимера PsAc (соответственно полимера PsAcAr) с соединением типа R-Z', где Z' имеет такое же значение, которое указано выше, и R означает функцию, которая взаимодействует с карбоксильной функцией. Предпочтительно R означает аминную функцию, способную образовывать амидную связь с группами Ac.

Некоторые группы F могут быть привиты в результате прививки сначала промежуточных реакционно-способных групп F', а затем химической модификации групп F' с получение групп F после осуществления отдельной стадии взаимодействия.

Например, группы F типа -CH₂-CONH-NH₂ могут быть получены в результате взаимодействия полисахарида PsAc (или полимера PsAcAr) с гидразином (предпочтительно в присутствии 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимида.

Группы F типа -CH₂-CONH-(CH₂)₃-N₃ могут быть получены в результате взаимодействия полисахарида PsAc (или полимера PsAcAr) с гидрохлоридом 3-азидопропиламмония (предпочтительно в присутствии 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимида).

Группы F формулы (II), указанной выше, могут быть получены в результате взаимодействия полимера PsAcF (или полимера PsAcArF), снабженного реакционно-способными группам типа -CH₂-CONH-(CH₂)₃-N₃, с соединением формулы (VI):

(предпочтительно в присутствии ионов меди(II) и аскорбата натрия).

В таком случае получают полимер PsAcF (или полимер PsAcArF), в котором либо все группы F имеют формулу (II), приведенную выше, либо часть групп F имеют формулу (II), приведенную выше, а часть групп F являются группами типа -CH₂-CONH-(CH₂)₃-N₃ (в случае неполного замещения соединениями формулы (VI)).

Группы F формулы (V), приведенной выше, могут быть получены в результате взаимодействия полисахарида PsAc (или полимера PsAcAr) с соединением формулы (VII):

(предпочтительно в присутствии 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимида), в которой X' имеет значение, указанное выше. Соединение формулы (VII) может быть получено, как указано в примерах ниже.

В общем, степень замещения группами Ac, Ar и F можно корректировать в зависимости, с одной стороны, от порядка, в котором осуществляют прививку групп (Ac, затем Ar, затем F или в другом случае Ac, затем F, затем Ar), и с другой стороны, от подбора условий прививки и, в частности, от молярного соотношения между полисахаридом и реагентом, ответственным за прививку соответствующей группы.

Полимеры, полученные из декстранов и соответствующие общей формуле связывающих полимеров, приведенной выше, с сульфатными и сульфонатными группами в качестве реакционно-способных групп F, а также применение таких полимеров для терапевтических целей, описаны в документах WO 99/29734, WO 00/76452, WO 00/76562, WO 01/91742 и FR 2891149.

Предпочтительно связывающие полимеры согласно изобретению не имеют сульфатных или сульфонатных функций. Действительно, такие функции могут взаимодействовать с большим количеством белков, которые вредны для оптимального выявления. Кроме того, отсутствие сульфатных или сульфонатных функций особенно полезно, когда улавливающие элементы сами являются сульфатированными (в частности, олигосахариды).

Функционализация поверхностей

Связывающие полимеры согласно изобретению (типа PsAcAr или PsAcArF) могут быть нанесены на подложку, чтобы функционализировать поверхность указанной подложки. Подложка состоит из пластика (твердого материала полимерной природы, которому обычно придают форму в горячем виде и под давлением), который предпочтительно выбран из полистирола, поликарбоната, поли(метилметакрилата) и полипропилена.

Таким образом, изобретение позволяет, например, функционализировать поверхность прозрачных или непрозрачных пластиковых пластин или в ином случае полистироловых планшетов для микротитрования (например, 96-луночных), шариков (магнитных или немагнитных), планшетов для культивирования из полистирола (например, 96-луночных), полосок или палочек ил полистирола.

Функционализация обычно включает в себя две стадии: первую стадию фиксации связывающих полимеров на поверхности подложки и вторую стадию фиксации улавливающих элементов на связывающих полимерах. Альтернативно связывающие полимеры могут быть связаны с улавливающими элементами перед фиксацией связывающих полимеров на поверхности подложки (особенно, когда связь между связывающими полимерами и улавливающими элементами является связью ковалентного типа).

Фиксацию связывающих полимеров на поверхности подложки осуществляют, в частности, в случае плоских поверхностей, погружением поверхности, которую необходимо обработать, в раствор, содержащий полимер PsAcAr или PsAcArF. В случае формованных поверхностей, которые могут содержать жидкость (наприме