Анальгетическое средство на основе плазмидной днк, кодирующей hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3 (варианты)

Анальгетическое средство на основе плазмидной днк, кодирующей hnp-1, либо hnp-2, либо hnp-3 (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение (варианты) относится к области медицины, фармакологии, биотехнологии, молекулярной биологии, генной инженерии и может быть использована для анальгезии.

Важно признать, что боль является не просто индикатором основного заболевания или процесса повреждения, а самостоятельной проблемой, наносящей большой урон отдельным людям и обществу в целом. Для улучшения качества жизни облегчение боли как таковой должно стать терапевтической целью. Перспективный подход к лечению боли, к которому переходят в настоящее время, - выявление механизма и осуществление таргетной (нацеленной на конкретные молекулы) фармакологической терапии [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007].

Известно использование пептидных амидов [US4459225 (А)], фенилгидразоновых производных, в качестве противовоспалительных или анальгетических агентов [ЕР 0952159 (В1)], синтетических пептидных амидов для профилактики и лечения боли [RU 2500685 С2]. Известно использование семейства пептидов, обладающих анальгетической активностью, общей формулы A-B-Tyr-Pro (DPro, dHPro, DdHPro, DLdhPro, Hyp)-C-X [WO 2008020778 (A1)], производного пептида, вводимого подкожно или орально, имеющего анальгетическую активность, либо анти-ноцицепивную [US 2008009448 (A1)].

Недостатком химически синтезированных пептидов и их производных является возможность получения смеси искомых веществ с энантиомерами, что может привести к непредсказуемым результатам. Понятие энантиомерии играет важную роль в фармацевтике, поскольку разные энантиомеры лекарственных веществ, как правило, имеют различную биологическую активность. Использование живых систем для получения пептидных молекул позволяет получить молекулы природной структуры, гомогенную смесь.

Известна рекомбинантная плазмида, для бактериальной экспрессии, содержащая гомологичный регулон или гетерологичную ДНК, последняя может кодировать полипептид с анальгетическим эффектом [SK 278170 (В6)]. Известно моно соединение индола с новой структурой, содержащее глубоководный макрогеномный кластер генов, синтезируемое в клетках Escherichia coli [CN 102477436 (А)]. Известен полипептид из актинии Heteractis crispa, обладающий выраженным анальгетическим действием [RU 2368621 C1, RU 2404245 C1], и способ его получения [RU 2415866 C1]. Известны пептиды с большим числом мостиковых связей, выделенных их ACTINOMADURA NAMIBIENSIS, для лечения невропатической боли, вызванной воспалением [RU 2498995 (С2)]. Однако в связи с тем, что такие молекулы происходят от организмов, далеких от человека, их действие должно быть изучено особо тщательно перед применением в человеке.

Известен гибридный белок на основе конотоксина (яда улитки) MVó А и Trx, который можно использовать в подготовке обезболивающего для последних стадий рака и СПИДа, пост-операционной боли, ожогов и т.д. [CN 1487085 (А)]. Известен способ получения конотоксина с использованием бакуловируса и клеток насекомых, либо насекомых [CN 102876683 (А)]. Известны способы анальгезии и улучшения опиатной анальгезии введением омега-конопептидов TVIA (SNX-185) или MVIIA (SNX-111) [ЕР 0625162 (В1)], способы анальгезии с использованием альфа-конотоксинов [WO 2014023129 (A1), CN 102286079 (В), CN 103374066 (А)], конотоксина Lt7b [CN 102628048 (А)]. Известно использование омега-конопептида для производства медикамента для ингибирования прогресса нейропатической боли [ЕР 1336409 (В1)]. Известен полипептид скорпиона, обладающий анальгетическим и противоопухолевым действием [US 7592309 (В2), CN 101591668 (А)], и способ его применения [US 7592309 (В2)] и получения [CN 101591668 (А)], сколопендры Scolopendra subspinipes mutilans - mu-SLPTX-Ssm6a, обладающий анальгетическим эффектом [CN 102977201 (А)]. Известны пептиды яда паука Grammostola spatulata, обладающие анальгетическим действием [US 5776896 (А)], пептид HWAP-I китайского паука-птицеееда [US 6670329 (В2)]. Известны пептидные молекулы из яда змеи и их производные, гомологи, аналоги и миметики, способные индуцировать анальгезию или облегчение боли отдельно или в комбинации с другими анальгетическими молекулами [US 6613745 (В1), US 7902152 (В2)], а также укороченный нейротоксин морской змеи Lapemis hardwickii для анальгезии [US 7294697 (В2)].

Недостатком данной группы изобретений является то, что использование токсинов, даже фармацевтически чистых, все же является риском - при передозировке вплоть до смерти.

Известно использование нового полипептида - субъединицы 9.01 [CN 1345751 (А)], субъединицы 12.65 [WO 0212310 (A1)], субъединицы 9.46 [WO 0204504 (A1)], субъединицы 11.44 [CN 1352195 (А)] G-белка человека для анальгезии. Известны полипептиды на основе рецептора G-белка HFIAO41 [US 2001016336 (A1)], HLYAZ61 [ЕР 0837128 (А2)], HUVCT36 [US 5912335 (А)], Н7ТВА62 [US 5955309 (A)], org10 [US 2003162945 (A1)], org11 [WO 0200725 (A2)] а также относящиеся к семейству IGS4 [AU 779993 (В2), US 6998255 (В1)]. Известны варианты сплайсированного рецептора G-белка, индуцированного вирусом Эпштейна-Барр EBI 3 [US 5874252 (А)].

Известны способы лечения боли, обусловленной раком кости, остеоартритом, послеоперационной боли путем введения антагониста фактора роста нервов (антитела) [RU 2389509 С2, RU 2429013 С2, RU 2338555 С2], известны партнеры специфического связывания с данной молекулой [RU 2406728 С2]. Показано, что молекулы, способные ингибировать связывание между NGF и рецептором TrkA, можно использовать в качестве анальгетиков с пролонгированным эффектом [RU 2427387 С2]. Известны и антитела против фактора роста нервов, обладающие повышенной стабильностью in vivo [RU 2011149263 А], высокой аффинностью к NGF [RU 2473564 С2], и лекарственная форма препарата гуманизированного антитела против фактора роста нервной ткани [RU 2427387 С2].

Известны способы лечения:

- боли и воспаления, с использованием пептида [RU 2011105280 А], разделением взаимодействия CRMP-2 и CaV2.2, в результате чего не происходит активация кальциевого канала N-типа (CaV2.2) [WO 2012009075 (A1)], а разделением взаимодействия LI-CAM, анкирина и потенциалзависимых кальциевых каналов лечат повреждение аксонов, ингибируют выброс нейромедиатора и передачу боли и блокируют кальциевую помпу в нейронах [US 7737250 (В2)], известен аналог пептидного токсина натриевых каналов Navl.7 для анальгезии [US2013296247 (A1)].

- боли и воспаления в нейронной ткани с применением антагонистов IL-31, гуманизированного моноклонального антитела или химерного антитела [RU 2440130 С2], простатической кислой фосфатазы ("РАР"), ее активного варианта, фрагмента или производного [WO 2009064497 (A1)],

- невропатической боли с использованием антител против CCR2 [RU 2011110169 А], нейропатической боли с применением пептидов, являющихся производными просапонина [RU 2007119313 А], пептида, содержащего аминокислотную последовательность Thr-R1-Lue-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr, где R1 является D-аланином, оказывающего воздействие на нейродегенеративное нарушение или нарушение миелинизации [RU 2266129 С2], белков с доменом цинковые пальцы, связанным с регуляторным доменом, которые способны активировать, либо подавлять экспрессию целевого гена, связанного с нейропатической болью (VR1, NaV1.8, и TrkA) [US8466267 (В2)].

- невропатической или центральной сенсибилизационной боли, с использованием последовательности выделенного гена, который регулируется в спинном мозге млекопитающего в ответ на механистически различные первую и вторую модели невропатической или центральной сенсибилизационной боли [US 2003108906 (A1), US 2003134301 (A1), US2003138803 (A1), US2004058326 (A1)],

- хронической боли с использованием полипептидов TORC [RU 98118091 А], гистогранина и его химически стабильного аналога [СА2219437 (A1)], линейных, циклических гистограниновых пептидов и псевдопептидов на их основе [US6566327 (В1)], гибридного белка, содержащего IL-10 и IL-4 [WO 2013070076 (A1)], полипептидов на основе IL-10 [US 7261882 (В2)],

- острой и хронической боли (различных форм боли) с использованием IL-13-связывающих белков [RU 2472807 С2], 1b-12/р40-связывающих белков [RU 2012124438 А], IL-12/р41-связывающих белков [RU 2008103312 А], IL-17-связывающих белков [RU 2011140335 А], простогландин Е2-связывающих белков [RU 2011104228 А], иммуноглобулинов с двойным вариабельным доменом [RU 2515108 С2], иммуноглобулинов с двойным вариабельным доменом против простогландина Е2 [RU 2011104348 А], борьбы с хроническими или острыми приступами боли с использованием ЕЕ3-семейства белков [RU 2004114989 А],

- висцеральной боли с использованием полипептида, повышающего гуанилатциклазную активность рецепторов [RU 2433133 (С2)],

- невропатической боли, остеоартритической боли, воспалительной боли с использованием IL-1-связывающих белков [RU 2012154210 А], воспалительных процессов артрита и других TNF-a опосредованных нарушений или патофизиологических механизмов, в частности различных форм боли, с применением стабильных и растворимых антител - ингибиторов TNF-a [RU 2415151 С2], боли при артрите, с применением гуманизированного антитела-антагониста CGRP [RU 2467765 С2], боли, индуцированной по меньшей мере одним противораковым агентом, с применением как минимум одного ботулинического токсина или пептида на его основе [RU 2483747 С2], в том числе совместно с опиатным производным [RU 2434637 С2], боли с применением РАМ, ассоциированного с Мус белком [RU 2345785 С2], с применением подобного рецептору галанина GPCR полипептида [US 2004053244 (A1), US 2003073115 (A1), WO 0168843 (A1)], контулакина-G и его дегликозилированной формы [US 6696408 (В1), US 6525021 (В1)], с применением пептидных ингибиторов протеинкиназы С [US 7939493 (В2)], висцеральной боли путем введения антител-антагонистов, направленных против пептида, связанного с геном кальцитонина [RU 2012106468 А],

- боли в животе, с применением пептидов предпочтительно из Lactobacillus rhamnosus [RU 2011136454 А].

Известны способы снижения болевой чувствительности при физиологических и патофизиологических условиях (например, при аллодинии и гипералгезии), особенно восприятия боли, которая связана или опосредована механической чувствительностью через TRPA1, с использованием антагонистических антител TRPA1, предпочтительно моноклональных антител [RU 2430750 С2]. Известны противоболевые/ противовоспалительные агенты, выбранные из следующих классов антагонистов рецепторов, агонистов рецепторов и ингибиторов ферментов, каждый класс, действующий по различным молекулярным механизмам действия на боль и подавления воспаления: (4) антагонисты брадикининового рецептора (пептиды), антагонисты кальцитонин-ген опосредованного пептидного (CGRP) рецептора (альфа-CGRP-(8-37), (8) антагонисты интерлейкинового рецептора (Lys-D-Pro-Thr) [RU 2180852 С2], белка бета-целлюлина (ВТС) [JP 2000198744 (А)]. Известны способы уменьшения боли при модулируемом CRF2R расстройстве с использованием агонистов рецептора кортикотропин-рилизинг фактора (CRF 2R) [RU 2385878 С2], лечения боли с использованием пептида, обладающего свойствами амилина [RU 2385878 С2], пептидного агониста NOP [RU 2012106820 А], пептидов, содержащих два и более аминокислотных остатка фрагмента 11-28 вазоактивного интестинального пептида (VIP), доставляемых в ЦНС [WO 9104041 (A1)], производного пептида на основе кальцитонина [US 5446026A], полипептидов человека CGRP-RCF [US 5710024 (A), WO 9803534 (A1)], полипептидов - гуманизированных рецепторов CGRP, в том числе для лечения головной боли, хронической головной боли от напряжения, сильной приступообразной головной боли с периодическими рецидивами, профилактики мигреней [US 7193070 (В2)], полипептидов - новых сплайсированных вариантов 11cb человека [US 6033872 (А)], агонистов и антагонистов последнего белка [WO 9928492 (A1)], рецепторов с семью трансмембранными доменами [US 5824504 (A), US 6277960 (В1), US 6277977 (В1), US 5955308 (A), US 6221627 (B1), US 2002106766 (A1), US 5994098 (A), US 6174994 (B1), US 6037146 (A), US 5874243 (А)], пептида, имеющего фосфодиэстеразную активность [WO 0166716 (A1)], полипептидов - человеческих протеин-киназ hYAK3 и HOACF72 [ЕР 0870825 (В1) и US 5972606 (А), соответственно].

Известен гибридный белок на основе нейротрофического фактора головного мозга, получаемый с использованием прокариотической системы экспрессии растворимого белка [CN 1978466 (В), WO 9942480 (A1)]. Известны полипептиды на основе рецептора нейротензина типа 2 для лечения боли [US 6008050 (А)]. Известен конъюгат нейротензина или его аналогов с терапевтическим пептидом, который может быть использован для индукции гипотермии или анальгезии [WO 2010063122 (A1)]. Известны конформационно оптимизированные аналоги альфа-меланотропина, оказывающие специфическое воздействие на ЦНС [US 4649191 (А)]. Известен синтетический пептид, модулирующий выброс нейротрансмиттера, сходный со SNARE [KR 20090041066 (А)].

Известны пептиды, обладающие множеством функций, в том числе анальгезией, такие как пептиды с большим количеством мостиковых связей, выделяемые из Actinomadura namibiensis [RU 2010144778 А], пептид структуры DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD [RU 2508296 С2], пептидный модулятор пуринергических рецепторов РТ1 [RU 2422459 C1], дипептиды, содержащие на N-концевом аминокислотном остатке 2-тиоацильную группу, в качестве ингибиторов вазопептидазы [RU 2298559 С2], тимус-специфический белок [RU 2398776 С2], полипептид, улучшающий метаболизм кальция [JPH03178993 (А)], а также пролекарственные композиции с высокой степенью проникновения на основе пептидов и родственных пептидам соединений [RU 2011149796 А].

Известен комбинированный подход к анальгезии - с использованием синергического сочетания селективного ингибитора нейронального транспортера норадреналина и анальгезирующего средства в терапевтическом лечении позвоночных животных, включая человека, для обезболивания или для профилактики или облегчения боли [US 8188048 В2]. Известны пептиды-аналоги динорфина, которые при совместном введении с наркотическими или анальгетическими средствами усиливают действие последних, в том числе энкефалинов и аналогов бета-эндорфина [ЕР 0096592 В1].

Известны способы увеличения фармакологической активности веществ при оральном и парентеральном введении композиций, с использованием пептида Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, связанного с группой-переносчиком, формирующего таким образом предшественник лекарства, используемый в том числе для лечения или облегчения боли [AU 2002228260 (В2)].

Использование одного высокоэффективного агента для анальгезии, простого и дешевого в производстве, является более выгодным вариантом.

Известно использование пептида дефенсина Нnр-1, одного или в комбинации с нейропептидом М, в качестве терапевтического агента, для профилактики и/или лечения в том числе периферических сосудистых заболеваний, включая анестезию, распространяющуюся боль, каузалгию (жгучая боль) [WO 2009/043461 А1].

Использование молекул белковой природы, которые не задумывались в качестве индукторов иммунного ответа, в том числе антительного, может быть осложнено именно этими последствиями, что может привести к побочным эффектам, например, связанным с формированием аутоантител.

Известно использование малой интерферирующей РНК, а также короткой шпилечной РНК для генного нокдауна субъединицы NR1 подкожного рецептора N-метил-D-аспартата для снижения воспалительной боли или невыносимой хронической боли, в особенности клинической хронической боли и боли при ожогах [US8372817 (В2), US8575330 (В2), US 8361985 (В2)]. Известен РНК-интерферирующий агент для лечения хронической боли [WO 2013126963 (A1)]. Однако препараты РНК довольно быстро разрушаются вне организма, также требуются специальные условия хранения, что ставит промышленную применимость препаратов на основе РНК под вопрос.

Известен способ длительной анальгезии, по которому пациенту вводят миогенные клетки, в которых с соответствующей ДНК синтезируется пептид, активирующий опиоидный рецептор, либо опосредующий связывание субстанции Ρ с рецептором [US 7166279 (В2)]. Однако осуществление данного способа довольно сложное и связано со многими рисками.

Известны методы лечения депрессии и боли, агентом может быть белок, РНК или ДНК [WO 2013177484 (A1)]. Известны лентивирусные векторы для лечения боли, содержащие G-белок вируса бешенства [ЕР 1425403 (В1)], а также аденовирус, кодирующий IL-24 [CN 101518655 (А)], в том числе для облегчения боли при раке. Известен онкостатин М, либо его гомолог, синтезирующиеся с вектора для переноса генов: лентивируса, ретровируса, вируса Сендай, аденовируса и адено-ассоциированного вируса, в том числе для лечения боли [JP 4803789 (В2)]. Известно лечение аллодинии, гипералгезии, спонтанных болей и фантомных болей с использованием кометина - полипептида, который может быть доставлен как полипептид, либо введением экспрессионного вектора для экспрессии кометина, клеточная линия, трансформированная, либо трансфецированная данным белком и капсула, содержащая указанные клетки [WO 2013034157 (A1)]. Вирусные векторы имеют ряд недостатков, в их числе то, что они дорогостоящи и могут вызывать воспалительную реакцию, что исключает повторное введение вектора. Также вирусные вектора обладают способностью реплицироваться, что снижает степень контроля над экспрессией таргетного белка, что, в свою очередь, не всегда желательно и применимо, в особенности в отношении анальгезии.

Известна рекомбинантная ДНК-вакцина на основе вектора pVAX1, нацеливающегося на опухоль, в том числе для лечения боли при онкологии, содержащего ген, кодирующий циклооксигеназу-2 (СОХ-2), мышиный убиквитин Mubi, а также ISS иммуностимулирующие последовательности ДНК (pVAX1-mUbi-ISS-COX-2-ISS) [CN 101648011 (А)]. Однако данная конструкция нацелена вызвать иммунный ответ на нее, цитотоксический, для чего в нее введены элементы, обуславливающие и усиливающие иммуногенность. Известна в том числе фармацевтическая композиция, в которой содержится вектор, в том числе плазмидная ДНК, и фармацевтически приемлемый эксципиент, либо адъювант, для облегчения, профилактики или лечения боли, вектор содержит нуклеотидную последовательность, содержащую хотя бы одну область, модулирующую экспрессию рецептора VR1 [US 2006154886 (A1)]. В данном случае анальгезия осуществляется через блокирование рецептора, связанного с ионным каналом - неспецифическим проводником катионов. Использование плазмидной ДНК, несущей ген, с которого в клетках млекопитающих синтезируется дефенсин, в качестве средства, индуцирующего анальгезию, позволит также минимизировать возможность развития патогенов в организме: как правило, при болях любой этиологии ухудшается самочувствие и уменьшается способность организма противостоять инфекциям, в результате, после, например, оперативного вмешательства, могут назначать антибиотики, а использование природного противомикробного пептида позволит объединить и анальгезию, и защитный эффект, в результате, можно отказаться от приема антибиотиков.

Близкими аналогами предлагаемого изобретения являются изобретения, описанные в патенте CN 101648011 (А) и заявке на изобретение US 2006154886 (A1), в которых раскрыты анальгетики в форме плазмидной ДНК.

Показано, что при внутримышечном введении экспрессионного ДНК вектора он поглощается мышечными клетками, и происходит экспрессия белка, закодированного в вводимом векторе [J.A. Wolff et al., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi et al., Nature 352, 815 (1991)]. Показано, что плазмиды поддерживаются в виде эписомы и не реплицируются. Постоянная экспрессия была продемонстрирована после внутримышечной инъекции также в скелетные мышцы крыс, рыб и приматов, а также сердечную мышцу крыс [H. Lin et al., Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis et al., Proc. Nati Acad. Sci. (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen et. al., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff et al., Human Mol. Genet. 1,363 (1992)]. Возможно и использование иных технологий доставки плазмидной ДНК в клетки различных тканей, например, безыгольного шприца, позволяющего осуществить доставку в клетки различных тканей живых животных [Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, (1992)].

Показано, что в норме мышечные волокна не экспрессируют антигены МНС, однако при воспалении, связанном с инфекцией, или в присутствии интерферона гамма мышечные волокна способны продуцировать антигены в составе комплекса с МНС первого класса, либо даже второго класса [MECKERT, Р.С, HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, М., CHAMBO, J., LEVIN, M., and LAGUENS, R.P. (1991). Trypanosoma cruzi: Aberrant expression of class II major histocompatibility complex molecules in skeletal and heart muscle cells of chronically infected mice. Exp. Parasitol. 72, 8-14; Hohlfeld and ENGEL, A.G. (1984) The immunobiology of muscle. Immunol. Today 15, 269-274.; MANTEGAZZA, R., and BERNASCONI, P. (1994). Cellular aspects of myositis. Curr. Opin. Rheumatol. 6, 568-574, Hartikka J, Sawdey M, Cornefert-Jensen F, Margalith M, Barnhart K, Nolasco M, Vahlsing HL, Meek J, Marquet M, Hobart P, Norman J, Manthorpe M. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle. Hum Gene Ther. 1996 Jun 20; 7(10):1205-17], в связи с чем предпочтительным является введение плазмидной ДНК, при котором травмирование мышечной ткани минимизировано.

Показано, что даже при иммуногенности в испытаниях на лабораторных животных у человека препараты на основе плазмидной ДНК не являются иммуногенными [Saade F, Petrovsky N. Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines. Expert Rev Vaccines. 2012 Feb; 11 (2): 189-209. doi: 10.1586/erv. 11.188]. Исследователям также не удалось найти доказательства патологических изменений после повторных инъекций ДНК у мышей или кроликов [Parker SE, Borellini F, Wenk ML, et al. Plasmid DNA malaria vaccine: tissue distribution and safety studies in mice and rabbits. Hum. Gene Ther. 1999; 10(5):741-758.]. В 2007 году в руководстве FDA США по ДНК-вакцинам пришли к выводу, что доклинические исследования не требуются для оценки эффекта в отношении аутоиммунных заболеваний.

Плазмидная ДНК должна содержать существенные для организмов ее поддержания и использования элементы, вкупе с соответствующими регуляторными последовательностями. Регуляторные последовательности - нуклеотидные последовательности, способные повлиять на экспрессию гена на уровне транскрипции и/или трансляции, а также на механизмы, обеспечивающие существование и поддержание функционирования плазмидной ДНК.

Существенными для прокариотической системы являются ориджин репликации и репортерный ген. Бактериальные элементы плазмидной ДНК не должны отрицательно влиять на экспрессию в клетках млекопитающих и обуславливать побочный эффект от применения плазмидной ДНК. В литературе имеются данные о том, что использование гена устойчивости к ампициллину в качестве репортерного гена может быть нежелательным в связи с развитием реакции у пациентов на ампициллин, однако авторы считают такие последствия связанными с низким качеством очистки плазмидной ДНК, но не самим элементом.

Существенными элементами плазмид для использования у млекопитающих являются промотор, лидерная последовательность мРНК, терминирующая последовательность.

Промотор является важным компонентом плазмиды, который запускает экспрессию интересующего гена. Классические промоторы для плазмидных ДНК-компонентов препаратов - это CMV человека/ немедленно-ранний или CMV-chicken-β actin (CAGG) промотор. Промоторы CMV используется для большинства ДНК-вакцин, так как они опосредуют высокие уровни конститутивной экспрессии в широком диапазоне тканей млекопитающих [Manthorpe M, Cornefert-Jensen F, Hartikka J, et al. Gene therapy by intramuscular injection of plasmid DNA: studies on firefly luciferase gene expression in mice. Hum. Gene Ther. 1993; 4(4):419-431] и не подавляют пропитывание downstream. Увеличение уровня экспрессии наблюдают при изменении CMV промотора, например, включением HTLV-1R-U5 downstream от промотора цитомегаловируса или при использовании химерного SV40-CMV промотора [Williams JA, Carnes АЕ, Hodgson СР. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009; 27(4):353-370]. Альтернативой CMV промоторам служат тканеспецифические промоторы хозяина, которые позволяют избежать конститутивной экспрессии антигенов в неподходящих тканях, что в целом приводит к снижению иммуногенности [Cazeaux Ν, Bennasser Y, Vidal PL, Li Z, Paulin D, Bahraoui E. Comparative study of immune responses induced after immunization with plasmids encoding the HIV-1 Nef protein under the control of the CMV-IE or the muscle-specific desmin promoter. Vaccine. 2002; 20(27-28):3322-3331].

Лидерная последовательность мРНК также играет большую роль. Последовательность Козака непосредственно перед стартовым кодоном ATG позволяет увеличить экспрессию [Kozak M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. EMBO J. 1997; 16(9):2482-2492]. Наличие интрона в плазмиде downstream от промотора может повысить стабильность мРНК и увеличить экспрессию гена.

Использование видоспецифичных кодонов позволяет увеличить экспрессию гена [Frelin L, Ahlen G, Alheim M, et al. Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis С virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther. 2004; 11(6):522-533].

На экспрессию генов можно повлиять путем изменения терминирующей последовательности, которая необходима для сохранения стабильности мРНК, надлежащего прекращения транскрипции и экспорта мРНК из ядра, в том числе ее укорачиванием. Во многих современных ДНК-вакцинах используют последовательность терминатора транскрипции бычьего гормона роста [Montgomery DL, Shiver JW, Leander KR, et al. Heterologous and homologous protection against influenza A by DNA vaccination: optimization of DNA vectors. DNA Cell Biol. 1993; 12(9):777-783]. Полиаденилирование (полиА) необходимо для стабилизации транскрипта. Изменение последовательности полиА может привести к увеличению уровня экспрессии гена [Norman JA, Hobart Ρ, Manthorpe Μ, Feigner Ρ, Wheeler С.Development of improved vectors for DNA-based immunization and other gene therapy applications. Vaccine. 1997;15(8):801-803]. В плазмиде pVAXl (Invitrogen, Carlsbad, С А) область терминатора бычьего гормона роста содержит область гомопурина, которая чувствительна к нуклеазе. Показано, что альтернативная полиА последовательность может значительно улучшить стабильность плазмиды к нуклеазе [Azzoni AR, Ribeiro SC, Monteiro GA, Prazeres DMF. The impact of polyadenylation signals on plasmid nuclease-resistance and transgene expression. J Gene Med. 2007; 9:392-402]. Введение двух стоп-кодонов позволяет увеличить эффективность терминатора транскрипции.

Оптимальная конструкция плазмиды для осуществления назначения должна объединять «бактериальные» и «эукариотические» элементы, с соответствующими регуляторными последовательностями, чтобы обеспечить высокую копийность в процессе производства и высокий уровень экспрессии у млекопитающих [Saade F, Petrovsky Ν. Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines. Expert Rev Vaccines. 2012 Feb; 11 (2): 189-209. doi: 10.1586/erv.l 1.188].

Для создания анальгетического средства по настоящему изобретению можно использовать плазмидную ДНК, как минимум, стандартно применяющуюся для доставки генов и их экспрессии в организме млекопитающего, в том числе человека, а также оптимизированную по вышеперечисленным параметрам, в том числе подробно описанным в статье Williams et al., 2009 [Williams JA, Carnes AE, Hodgson CP. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009; 27(4):353-370]. В руководстве FDA (2007) заявлено, что исследования биораспределения вещества после его введения в организм могут быть отменены для ДНК-вакцин, производимых клонированием нового гена в плазмидный вектор, в отношении которого ранее документально установлено приемлемые биораспределение и профиль интеграции. В руководстве ВОЗ (2007) заявлено, что исследования биологического распределения и сохранения требуются, если еще не имеется значительный опыт работы с почти идентичным или аналогичным продуктом. В руководстве ЕМЕА (2006) заявлено, что опыт работы с векторной системой позволит оптимизировать и сфокусироваться на доклинических исследованиях. Исследования по безопасности с использованием ДНК-векторов с различными клонированными генами продемонстрировали аналогичное биораспределение [Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Duffy С, Nason M, Andrews C, Kong WP, Nabel GJ, Gomez PL. Biodistribution of DNA plasmid vaccines against HIV-1, Ebola, Severe Acute Respiratory Syndrome, or West Nile virus is similar, without integration, despite differing plasmid backbones or gene inserts. Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Duffy C, Nason M, Andrews C, Kong WP, Nabel GJ, Gomez PL. Toxicol Sci. 2006 Jun; 91(2):610-9. Epub 2006 Mar 28.] и токсикологию [Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Andrews C, Bailer R, Rathmann J, Gomez PL. Toxicological safety evaluation of DNA plasmid vaccines against HIV-1, Ebola, Severe Acute Respiratory Syndrome, or West Nile virus is similar despite differing plasmid backbones or gene-inserts. Toxicol Sci. 2006 Jun; 91(2):620-30. Epub 2006 Mar 28]. Для плазмидной ДНК для применения у млекопитающих, кроме человека, требования менее строгие, в связи с чем возможно использование более широкого спектра плазмид.

Для ДНК, предназначенной для использования человеком, может быть полезно иметь конечный продукт ДНК в фармацевтически приемлемом носителе или буферном растворе. Фармацевтически приемлемые носители или буферные растворы известны из уровня техники и включают те, которые описаны в различных текстах, таких как, например, Remington's Pharmaceutical Sciences.

Прототипом вариантов изобретения является изобретение, раскрытое в заявке на изобретение WO 2009/043461 A1: применение дефенсина HNP-1 для лечения в том числе боли.

Дефенсины составляют большое семейство низкомолекулярных (3-5-кДа) цистеин-богатых катионных пептидов, стабилизированных несколькими (как правило, тремя) дисульфидными связями [Ganz, Т. 2002. Immunology: Versatile defensins. Science 298: 977-979, Lehrer, R.I. and Ganz, T. 2002. Defensins of vertebrate animals. Curr. Opin. Immunol. 14: 96-102.], которые способны к киллингу широкого спектра патогенов, включая разнообразные бактерии, грибы, а также оболочечные вирусы. У человека это семейство представлено α-субсемейством (HNP) и β-субсемейством (hBD) дефенсинов. Альфа-дефенсины наиболее представлены в нейтрофилах и клетках Панета. HNP-1 и HNP-3 содержат в своем составе всего 30 аминокислотных остатков, эти пептиды идентичны друг другу за исключением замены аланина на аспарагин в положении 1. HNP-2 - протеолитический продукт HNP-1 и HNP-3, содержит 29 аминокислотных остатков (отсутствует первая аминокислота с N-конца). Наличие дисульфидных связей обеспечивает сохранение устойчивости молекул дефенсинов к многочисленным лейкоцитарным и микробным протеиназам и сохранение антибиотических свойств в очаге воспаления и тканевой деструкции [Levy О. Antimicrobial proteins and peptides: anti-infective molecules of mammalian leukocytes. J. of Leukocyte Biology.2004; 76: 909-926]. Получение данных молекул правильной пространственной структуры является довольно сложной задачей.

Гены, кодирующие дефенсины, образуют кластер в локусе р22-23 на 8 хромосоме. HNP 1-3 кодируются двумя генами HDEFA1 и HDEFA3. Каждый ген дефенсинов содержит несколько экзонов, которые кодируют препропептид.

Вначале дефенсины синтезируются в виде предшественников, как препропептиды, длина которых составляет 94 аминокислотных остатка. Препропептиды содержат сигнальный участок (в среднем 19 аминокислотных остатков), анионный участок (в среднем 45 аминокислотных остатков) и собственно «зрелый» пептид. В результате протеолитического отщепления в эндоплазматическом ретикулуме от препропептида происходит удаление сигнального участка и образование продефенсина (в среднем 75 аминокислотных остатков). Последующее созревание (отщепление 45 аминокислотных) остатков происходит в зрелых гранулах нейтрофилов. α-Дефенсины обнаружены также в NK клетках, В-лимфоцитах, γδ Т-лимфоцитах, моноцитах/макрофагах и эпителиальных клетках [А.С. Будихина, Б.В. Пинегин. Дефенсины - мультифункциональные катионные пептиды человека. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2008, №2:31-40]. Авторами настоящего изобретения впервые продемонстрировано, что введение плазмидной ДНК, несущей ген, кодирующий ΗΝΡ-1/ ΗΝΡ-2/ ΗΝΡ-3, приводит к анальгезии, причем при этом наблюдали увеличение уровня бета-эндорфина в сыворотке.

Недостатки аналогов и прототипа приведены непосредственно после их описания. Заявленное изобретение (варианты) свободно от этих недостатков.

Технический результат от использования вариантов изобретения выражается, во-первых, в расширении спектра анальгетических средств. При плохой переносимости или непереносимости аналогов представитель предложенных вариантов анальгетика позволит осуществить анальгезию, за счет чего пациент получит возможность осуществить действия, которые не мог, либо не хотел осуществить без анальгезии, например, решиться на требуемую процедуру, а также улучшит качество жизни, например, получит меньше неприятных ощущений, чем без использования анальгетика, либо сможет облегчить острую, либо хроническую боль. Указанный технический результат достигается тем, что используют анальгетик по настоящему изобретению (варианты).

Кроме того, технический результат заключается в увеличении длительности анальгезии и достигается тем, что используют плазмидную ДНК, с которой после введения в организм синтезируется альфа дефенсин человека HNP-1/HNP-2/HNP-3; а также тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая дефенсин человека, содержит элементы, обуславливающие стабильность мРНК и, соответственно, увеличивающие время полужизни мРНК, в результате синтез белка с одной молекулы мРНК осуществляется большее количество раз, а также в результате увеличивается количество синтезируемого белка; а также тем, что нуклеотидная последовательность, в которой закодирован непосредственно препробелок альфа дефенсин человека, кодонно оптимизирована для экспрессии в млекопитающих, в результате синтез белка идет интенсивнее. При внедрении в практику это позволит существенно снизить количество вводимой плазмидной ДНК (в 10-50 раз), по сравнению с дозами, используемыми в настоящее время в отечественной и мировой практике при генной терапии.

Помимо этого, технический результат заключается в увеличении безопасности анальгезии. Указанный технический результат достигается тем, что в качестве действующего вещества используется не белок, на который могут образоваться антитела, что при применении молекулы, используемой в организме ее происхождения, может вызвать серьезные побочные эффекты, а плазмидная ДНК, которая существует в виде эписомы и не интегрирует в геном, с которой синтезируется и затем секретируется из клетки белок человека, в результате осуществляется неиммуногенное, безопасное использование дефенсина человека для анальгезии. Указанный технический результат также достигается тем, что синтезируемый в организме с плазмидной ДНК белок подвергается естественному посттрансляционному процессингу, а также обеспечивается правильный фолдинг белка за счет клеточных шаперонов. Данные модификации труднодостижимы при производстве белков, что может драматически сказаться на ряде их функций. Указанный технический результат также достигается за счет того, что используются природные механизмы метаболизма и катаболизма действующего вещества, без образования токсичных продуктов, благодаря естественной природе плазмидной конструкции и кодируемого ею белка, а также идентичности образуемого белка эндогенному аналогу. Указанный технический результат также достигается тем, что плазмидная ДНК не реплицируется после введения в организм млекопитающего, что позволяет осуществлять контроль над количеством синтезируемого белка, и, соответственно, над анальгезией. Указанный технический результат достигается и за счет наличия в плазмидной ДНК таких регуляторных последовательностей, как сайленсер и/или инсулятор, в одном из вариантов изобретения, благодаря чему также осуществляется контроль над количеством синтезируемого белка, и, в принципе, синтезом белка, как таковым, и, соответственно, над анальгезией: при необходимости есть возможность в быстрый срок остановить, либо уменьшить экспрессию гена. В последнем варианте возможно и осуществление тканеспецифической экспрессии при необходимости.

Технический результат также заключается в упрощении и удешевлении производства анальгетика за счет избегания сложностей производства и процессов очистки белковых препаратов in vitro, благодаря тому, что синтез белка происходит in vivo. Производство, очистка и хранение ДНК препаратов экономически выгоднее, чем белковых, так как первые более стабильны, их можно нарабатывать в больших количествах и с меньшими затратами.

Показано, что изменение концентрации бета-эндорфина в плазме крови находится в прямой зависимости от вида болевого синдрома, его интенсивности и эффективности анальгезии, что может служить критерием оценки эффективности обезболивания [Бета-эндорфин - маркер эффективности обезболивания при острой боли и хроническом болевом синдроме у онкологических больных / З.В. Павлова [и др.] // Проблемы клинической медицины. - 2007. - N1. - С. 36-40. - ISSN 1817-8359]. При введении анальгетика по настоящему изобретению наблюдали увеличение уровня бета-эндорфина в сыворотке (Фиг. 3).

По временным характеристикам можно выделить два типа боли:

- острую боль - новую, недавнюю боль, неразрывно связанную с вызвавшим ее повреждением и, как правило, являющуюся симптомом какого-либо заболевания, исчезает при устранении повреждения [Eddy N.B., Leimbach D. J. // Pharmacol Exp Ther. - Mar; 107(3):385-93. - 1953] (в том числе пред- и послеоперационная, посттравматическая, при ожогах, острая боль во время рождения ребенка, боль, вызванная травмой спинного мозга, острая головная боль, боль при ВИЧ/СПИДе, кризисе серповидных клеток, при невралгии тройничного нерва, панкреатите и других болях в ЖКТ, при инфаркте миокарда и других крупных сердечных событиях, интервенционная боль (при диагностических и терапевтических процедурах), острая при хронической боли [WHO Normative Guidelines on Pain Management, Geneva June 2007], которая длится до 2-3 месяцев, причем может иррадиировать, и

- хроническую боль - продолжающуюся длительный период времени (свыше 2-3 месяцев) даже после устранения причины, ее вызвавшей, часто приобретает статус самостоятельной болезни, например, воспалительного процесса [Eddy N.B., Leimbach D.J. // Pharmacol Exp Ther. - Mar; 107(3):385-93. - 1953], причем наблюдается снижение эффективности анальгетиков. К хронической боли можно отнести хроническую боль при злокачественной болезни (включая боль у больных раком, ВИЧ/СПИД, при боковом амиотрофическом склерозе (ALS), рассеянном склерозе, при конечной стадии отказа органа, расширенной хронической обструктивной болезни легких, расширенной застойной сердечной