Конъюгаты и композиции для иммунотерапии и противоопухолевого лечения

Конъюгаты и композиции для иммунотерапии и противоопухолевого лечения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и более конкретно к области композиций, способных стимулировать как врожденный иммунный ответ, так и адаптивный иммунный ответ индивидуума. Эти композиции пригодны для лечения всех заболеваний, требующих более высокой активности иммунной системы, таких как опухолевые и инфекционные заболевания.

Известный уровень техники

Интерлейкин 15 (IL15 или IL 15) представляет собой жизненно важный цитокин для активности NK, NKT клеток и CD8 Т-лимфоцитов памяти. Он осуществляет свою функцию, действуя через рецептор, состоящий из 3 субъединиц, известных как α, β и γ. Субъединицы β и γ являются общими с рецептором IL-2. α Цепь рецептора IL15 является уникальной для IL15 и необходима для секреции цитокинов во внеклеточную среду [Duitman, E.H., et al., Mol Cell Biol, 2008. 28:4851-61] и «представляет» IL15 субъединицам IL15Rβ и IL15Rγ.

Благодаря стимулирующим свойствам для иммунной системы этот интерлейкин обладает противоопухолевыми свойствами, зависимыми от присутствия NK клеток (Suzuki, 2001, J. Leuokoc. Biol., 69:531-537) и Т-клеток (Hazama, 1999, Br. J. Cancer, 80:1420-1426, Meazza, 2000, Int. J. Cancer, 87:574-581 и Klebanoff, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101:1969-1974). IL15 вовлечен также в защиту против вирусных инфекций и в развитие и поддержание Т-клеточного иммунного ответа при иммунизации и развитии дендритных клеток.

Следовательно, IL15 может быть полезным терапевтическим агентом для лечения заболеваний, в которые вовлечена иммунная система. Однако исследованиям функции IL15 in vivo частично препятствуют отсутствие доступного рекомбинантного IL15 и низкий уровень секреции, наблюдаемый при экспрессии IL15 с природного гена. Более того, большинство цитокинов имеют очень низкий период полужизни в плазме, обусловленный тем, что они продуцируются in vivo местно и транзиторно. Следовательно, использование IL15 in vivo требует применения относительно высоких доз и частого введения, приводя к различным вторичным эффектам, которые могут возникать у больных раком, не переносящих лечение.

С целью преодоления этих недостатков IL15 используют в противоопухолевом лечении в сочетании с другими видами лечения, такими как антитела против CD-40, IL-7 или IL-6 [Chou, P.C., et al., 2009, Vet Immunol Immunopathol, 130:25-34; Lin, C.Y., et al., Cancer Lett, 2008. 272(2): p. 285-95; Zhang, M., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106:7513-8 и Cha, E., et al., Breast Cancer Res Treat, 2009]. Эти сочетания вызывают синергичный эффект, делая возможным достижение сходного действия при более низких дозах IL15.

Другая возможность повышения активности IL15 состоит в его совместном введении со слитым белком, который включает константную область иммуноглобулина и растворимую область α цепи рецептора IL15, что вызывает 50-кратное повышение активности IL15 (Rubinstein M.P. et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9166-71 и Stoklasek T.A. et al., 2006, J. Immunol.; 177:6072-80).

Недавно было показано, что полипептид, образованный аминокислотами с 1 по 77 аминоконца α цепи рецептора IL15 (так называемым «доменом Sushi»), является агонистом IL15 (Mortier, E., et al., J Biol Chem, 2006, 281(3); p. 1612-9). Таким образом, введение слитого белка, содержащего указанный домен и IL15, вызывает более сильное противоопухолевое действие, чем действие IL15, приводя к 65% снижению легочных метастазов опухоли B16F10 и к снижению количества метастазов опухоли HCT-116 человека, имплантированной в слепую кишку голых мышей [Bessard, A., et al., Mol Cancer Ther, 2009, 8(9): p. 2736-45].

Другая альтернатива достижения улучшения эффекта IL15 без возникновения нежелательных вторичных эффектов состоит в модификации молекулы с точки зрения повышения периода ее полужизни. Таким образом, в патенте США US2006257361 описываются слитые белки, включающие константную область иммуноглобулина и IL15, обладающие после введения более высоким периодом полужизни в сыворотке по сравнению с немодифицированным IL15.

Однако в данной области техники существует потребность в альтернативных составах IL15, в которых белок поддерживает свою стимулирующую иммунный ответ активность, но позволяет вторичным эффектам, связанным с IL15, снижаться в максимально возможной степени.

Краткое изложение сущности изобретения

В первом аспекте изобретение относится к композиции, включающей совместно или раздельно,

(i) первый компонент, выбранный из группы

(a) полипептида, включающего полипептид Apo A или его функционально эквивалентный вариант, обладающий по меньшей мере 70% идентичностью с указанным полипептидом Apo A, и

(b) полинуклеотида, кодирующего полипептид Apo A или его функционально эквивалентный вариант, обладающий по меньшей мере 70% идентичностью с указанным полипептидом Apo A, и

(ii) второй компонент, выбранный из группы

(a) IL15 или его функционально эквивалентного варианта, обладающего по меньшей мере 70% идентичностью с IL15, и

(b) полинуклеотида, кодирующего IL15 или его функционально эквивалентный вариант, обладающий по меньшей мере 70% идентичностью с IL15, и

(iii) третий компонент, выбранный из группы

(a) домена Sushi альфа цепи рецептора IL15 или его функционально эквивалентного варианта, обладающего по меньшей мере 70% идентичностью с доменом Sushi альфа цепи рецептора IL15, и

(b) полинуклеотида, кодирующего домен Sushi альфа цепи рецептора IL15 или его функционально эквивалентный вариант, обладающий по меньшей мере 70% идентичностью с доменом Sushi альфа цепи рецептора IL15.

Во втором аспекте изобретение относится к слитому белку, включающему

(i) область A, образованную полипептидом Apo A или его функционально эквивалентным вариантом, обладающим по меньшей мере 70% идентичностью с указанным полипептидом Apo A,

(ii) область B, образованную IL15 или его функционально эквивалентным вариантом, обладающим по меньшей мере 70% идентичностью с IL15, и

(iii) область C, образованную доменом Sushi альфа цепи рецептора IL15 или его функционально эквивалентным вариантом, обладающим по меньшей мере 70% идентичностью с доменом Sushi альфа цепи рецептора IL15.

В дополнительных аспектах изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему слитый белок по изобретению, к вектору или генной конструкции, включающим полинуклеотид по изобретению, к клетке-хозяину, включающей слитый белок по изобретению, к полинуклеотиду по изобретению, к вектору по изобретению или к генной конструкции по изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей композицию по изобретению, слитый белок по изобретению, полинуклеотид по изобретению, вектор или генная конструкция по изобретению, клетку-хозяина по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте изобретение относится к способу стимуляции in vitro экспансии антигенспецифических Т-лимфоцитов, включающему контактирование популяции лимфоцитов, экспонированных ранее in vivo с указанным антигеном, с композицией по изобретению, слитым белком по изобретению, полинуклеотидом по изобретению, вектором или генной конструкцией по изобретению, клеткой-хозяином по изобретению.

Кроме того, изобретение относится к композиции по изобретению, слитому белку по изобретению, полинуклеотиду по изобретению, вектору или генной конструкции по изобретению, клетке-хозяину по изобретению для применения в медицине или для лечения заболеваний, которые требуют стимуляции иммунного ответа индивидуума.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Кинетика экспрессии hIL15 (нг/мл) во времени t (ч: часы). Группы мышей C57B16, получавшие гидродинамическую инъекцию плазмид pApo-hIL15+pSushi, pApo-hIL15, phIL15+pSushi, phIL15, pApo или физиологический раствор (S). Через 8, 24, 96, 168 и 240 часов получали кровь и концентрацию hIL15 в сыворотке определяли методом ELISA. Показано среднее и стандартное отклонение среднего репрезентативного эксперимента с 2-3 животными на группу. Результаты статистически обрабатывали с помощью анализа ANOVA с повторными измерениями с последующим тестом Бонферрони. Статистические различия наблюдаются между уровнями hIL15 через 8 и 24 часа у группы с pApo-hIL15 по сравнению с другими группами (p<0,001).

Фиг.2. Определение функциональной пролиферации при гидродинамическом введении pApo-hIL15 совместно с pSushi. Клетки CTLL2 культивировали в серийных разведениях сывороток, полученных через 24 часа после обработки мышей pApo-hIL15 и pApo-hIL15+pSushi. Через 48 часов в качестве пролиферативного индекса (имп/мин) исследовали включение меченного тритием тимидина в клетки CTLL2, выявив, что сыворотки мышей, обработанных pApo-hIL15 и pSushi одновременно, индуцировали более высокую степень пролиферации, чем сыворотки мышей, обработанных только pApo-hIL15 (p<0,001). Показано среднее и стандартное отклонение среднего репрезентативного эксперимента с 4-5 животными на группу. Результаты статистически обрабатывали с помощью ANOVA с повторными измерениями.

Фиг.3. Повышение общего количества и процента CD8⁺ Т-клеток относительно суммарных спленоцитов в зависимости от времени (t (д) в днях). Группы мышей C57B16, получавших гидродинамическую инъекцию различных конструкций плазмид, забивали на 3, 4, 5, 6 и 7 дни и селезенки удаляли. Измеряли количество CD8⁺ Т-клеток (A), процент CD8⁺ Т-клеток относительно суммарных спленоцитов (B), количество CD8⁺CD44⁺ Т-клеток памяти (C) и процент CD8⁺CD44⁺ Т-клеток памяти относительно суммарных спленоцитов (D). У группы мышей, которым вводили плазмиды pApo-hIL15 и pSushi (■), представлено более высокое количество CD8⁺ Т-клеток относительно других групп: pApo-hIL15 (□), phIL15+pSushi (▲), phIL15 (∆), pApo (○) и физиологический раствор в качестве носителя (*). Показано среднее и стандартное отклонение среднего репрезентативного эксперимента с 2 животными на группу. Данные анализировали с помощью анализ ANOVA с повторными измерениями с последующим тестом Бонферрони, сравнивая группу pApo-hIL15+pSushi и группу phIL15+pSushi, *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

Фиг.4. Повышение процента CD8⁺ Т-клеток относительно суммарного количества лимфоцитов в печени в зависимости от времени (t (д) в днях). Мыши C57B16 получали гидродинамическое введение различных конструкций. Через 3, 4, 5, 6 и 7 дней животных забивали и выделяли печень. Измеряли процент CD8⁺ Т-клеток относительно суммарного количества лимфоцитов. У группы мышей, которым вводили плазмиды pApo-hIL15 и pSushi (■), представлен более высокий процент CD8⁺ Т-клеток, чем у оставшихся групп: pApo-hIL15 (□), phIL15+pSushi (▲), phIL15 (∆), pApo (○) и физиологический раствор в качестве носителя (*). Показано среднее и стандартное отклонение среднего репрезентативного эксперимента с 2 животными на группу. Данные анализировали с помощью анализа ANOVA с повторными измерениями с последующим тестом Бонферрони, сравнивая группу pApo-hIL15+pSushi и группу phIL15+pSushi, *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

Фиг.5. Повышение суммарного количества и процента CD8⁺ Т-клеток относительно лимфоцитов периферической крови. Мышам C57B16 гидродинамически вводили различные конструкции с phIL15. Через 3, 4, 5 и 6 дней получали кровь и измеряли процент CD8⁺ Т-лимфоцитов (A), CD8⁺CD44⁺ Т-клеток памяти (B), и проценты эффекторных клеток памяти CD8⁺CD44⁺CD62L^- (C) и центральных клеток памяти CD8⁺CD44⁺CD62L⁺ (D). Во всех исследованных популяциях у группы мышей, получавших плазмиды pApo-hIL15 и pSushi (■), представлен более высокий процент CD8⁺ Т-клеток относительно других групп: pApo-hIL15 (□), phIL15+pSushi (▲), phIL15 (∆), pApo (●), pSushi (▽) и физиологический раствор в качестве носителя (*). Показано среднее и стандартное отклонение среднего репрезентативного эксперимента с 3 животными на группу. Данные анализировали с помощью анализа ANOVA с повторными измерениями с последующим тестом Бонферрони, сравнивая группы pApo-hIL15+pSushi и группы phIL15+pSushi, *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

Фиг.6. Противоопухолевый эффект конструкций в зависимости от времени (t (д), в днях) в модели подкожной опухоли CT26. Мыши Balb/c получали 5×10⁵ клеток CT26 подкожно и через 3 дня им гидродинамически вводили pApo-hIL15, pApo-hIL15+pSushi, phIL15, phIL15+pSushi, pApo или физиологический раствор (S). Опухоли измеряли в мм² с использованием цифрового штангенциркуля каждые 2 дня (A) с выявлением времени выживания животных (% SV) (B). У мышей, которым вводили плазмиды pApo-hIL15 и pSushi, как наблюдалось, представлена задержка опухолевого роста и более высокая степень выживаемости по сравнению с мышами из других групп. Показано среднее и стандартное отклонение среднего репрезентативного эксперимента с 8 животными на группу.

Фиг.7. Противоопухолевый эффект плазмид в зависимости от времени (t (д): в днях) в модели подкожной опухоли MC38. Мышам C57B16 вводили 5×10⁵ клеток MC38 подкожно и через 6 дней им гидродинамически вводили pApo-hIL15, pApo-hIL15+pSushi, phIL15, phIL15+pSushi, pApo или физиологический раствор (S). Опухоли измеряли в мм² с использованием цифрового штангенциркуля каждые 2 дня (A) с выявлением времени выживания животных (% SV) (B). У мышей, которым вводили плазмиды pApo-hIL15 и pSushi, как наблюдалось, представлена задержка опухолевого роста. Показано среднее и стандартное отклонение среднего репрезентативного эксперимента.

Фиг.8. Антиметастатический эффект различных плазмид в модели внутриселезеночной опухоли MC38. Мышам C57B16 внутриселезеночно вводили 5×10⁵ клеток MC38 подкожно и на следующий день им гидродинамически вводили pApo-hIL15, pApo-hIL15+pSushi, phIL15, phIL15+pSushi, pApo или физиологический раствор (S). Через 19 дней мышей забивали и делили на 3 группы: I: мыши, умершие из-за печеночных метастазов или генерализованных метастазов; II: мыши, имеющие метастазов в части печеночной ткани; III: мыши, не имеющие печеночных метастазов. Показаны данные репрезентативного эксперимента.

Фиг.9. Действие различных плазмид у мышей, «нокаутных» по рецептору α IL15. Четырем мышам с отсутствующим рецептором α IL15 гидродинамически вводили плазмиды pApo-hIL15 и pSushi, phIL15 и pSushi, pApo и pApo-hIL15. Животных забивали через 5 дней, выделяли селезенку и измеряли селезеночные популяции NK клеток и CD8⁺ Т-лимфоцитов памяти с помощью проточной цитометрии с использованием маркера CD3 для дифференциации. Фигура также включает популяции NK клеток и CD8⁺ Т-клеток памяти немутантной мыши C57B16. Показан процент NK клеток (A), CD8⁺ Т-лимфоцитов (B) и субпопуляции CD8⁺CD44⁺ (C). Указаны проценты клеток относительно суммарных спленоцитов.

Фиг.10. Повышение суммарного количества спленоцитов и CD8⁺ Т-клеток и NK1.1 клеток. Группам мышей C57B16 гидродинамически вводили плазмиды: 1) pmSushi-mIL15-mApo; 2) pApo-hIL15 в сочетании с pSushi (pApo-hIL15+pSushi); 3) pApo-hIL15; 4) phIL15 в сочетании с pSushi (phIL15+pSushi); 5) phIL15 и 6) pApo. Через 6 дней животных забивали и извлекали селезенку. Исследование с помощью проточной цитометрии было сделано для A) суммарной популяции спленоцитов; B) CD8⁺ Т-лимфоцитов памяти (CD8⁺CD3⁺); и C) NK клеток (NK1.1⁺CD3⁺). У группы мышей, которым вводили pmSushi-mIL15-mApo, было представлено более высокое количество CD8⁺ Т-клеток по отношению к суммарным спленоцитам по сравнению с другими группами. Показано среднее и стандартное отклонение среднего репрезентативного эксперимента с 2-3 животными на группу. Данные анализировали с помощью однофакторного анализа ANOVA с последующим тестом Бонферрони, сравнивая группу pmSushi-mIL15-mApo с оставшимися группами с введением плазмид, кодирующих указанные белки, *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001.

Фиг.11. Сравнение влияния изоформ IL15 человека или мыши на рост общего количества спленоцитов и на процент CD8⁺ Т-клеток и NK клеток от общего количества спленоцитов. Группам мышей C57BL/6 гидродинамически вводили плазмиды: 1) pmIL15; 2) phIL15; 3) pmIL15 в сочетании с pSushi; и 4) phIL15 в сочетании с pSushi. Через 4 дня животных забивали и извлекали селезенки, подсчитывая общее количество спленоцитов (A), количество CD8 Т-клеток относительно суммарного количества спленоцитов (B), и количество NK клеток относительно суммарного количества спленоцитов (C). Показано среднее и стандартное отклонение среднего (где это применимо) репрезентативного эксперимента с 1-2 животными на группу. Данные анализировали с помощью теста Крускалла-Уоллиса с последующим множественным сравнением с использованием критерия Данна. На фигуре показано, что mIL15 и hIL15 повышают количество спленоцитов, CD8 Т-клеток и NK клеток в селезенке сходным образом.

Фиг.12. Влияние гибрида mSushi с mIL15 и ApoAI на процент NK клеток в селезенке (A) и в печени (B). Группам мышей C57BL/6 гидродинамически вводили плазмиды: 1) pmSushi-mIL15-mApo, вводимую в разных дозах 1 мкг/мышь, 2,5 мкг/мышь и 5 мкг/мышь, соответственно; и 2) pmSushi-mIL15 в сочетании с pApo, обе вводили в тех же самых 3 дозах. Через 4 дня животных забивали и извлекали селезенки (A) и печени (B), выделяя маркированные NK клетки (NK1.1⁺CD3⁺). При всех исследованных дозах у группы мышей с введением плазмиды pmSushi-mIL15-mApo был представлен более высокий процент NK клеток по сравнению с другими группами. Показан каждый повтор и среднее репрезентативного эксперимента с 2-3 животными на группу. Данные анализировали с помощью однофакторного анализа ANOVA.

Фиг.13. Противоопухолевый эффект гибрида mSushi с mIL15 и ApoAI в модели подкожной опухоли MC38. Мышам C57B16 вводили 5×10⁵ клеток MC38 подкожно и через 8 и 19 дней им гидродинамически вводили плазмиды: 1) pApo; 2) pmSushi-mIL15-mApo и 3) pApo-hIL15 в сочетании с pSushi (pApo-hIL15+pSushi). Опухоли измеряли в мм² с использованием цифрового штангенциркуля каждые 2-3 дня. У мышей, которым вводили pmSushi-mIL15-mApo, как наблюдалось, представлена задержка опухолевого роста. Показано среднее и стандартное отклонение репрезентативного эксперимента с 5-9 животными на группу.

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что совместное введение нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, включающий IL15, соединенный с белком ApoA, вместе с доменом sushi α цепи рецептора IL15 (в настоящем описании далее IL15αR-sushi), придает более высокую активность IL15, чем наблюдаемая при совместном введении IL15 и IL15αR-sushi. Указанная более высокая активность является не только результатом получаемых более высоких и более длительно сохраняющихся уровней IL15, как показано в примере 3 настоящего изобретения, но также результатом способности индуцировать пролиферацию CTLL2 клеток (пример 4 настоящего изобретения), способности стимулировать пролиферацию внутриселезеночных CD8 Т-лимфоцитов и CD8 Т-клеток памяти, внутрипеченочных CD8 Т-лимфоцитов и CD8 Т-лимфоцитов крови (пример 5 настоящего изобретения), а также результатом более сильного противоопухолевого эффекта в двух экспериментальных моделях опухолей (пример 7 настоящего изобретения) и антиметастатического эффекта (пример 8 настоящего изобретения).

Не основываясь без необходимости на какой-либо теории, считается, что синергичное действие, возникающее в результате введения IL15 в форме слитого белка с ApoA, является результатом действия IL15 в тканях-мишенях, которые экспрессируют на своей клеточной поверхности рецепторы ApoA, таким образом, что IL15 может осуществлять свое действие на отличные или дополнительные ткани по сравнению с теми, которые считались ими до сих пор. Эта гипотеза поддерживается синергичным эффектом, наблюдаемым также у мышей с делецией гена рецептора α IL15.

Еще более неожиданным является выявление того, что введение нуклеиновой кислоты, кодирующей и разрешающей экспрессию тройного слитого белка, включающего белок ApoA1, соединенный с IL15 и IL15αR-sushi, вызывает пролиферацию CD8 лимфоцитов и NK клеток намного сильнее, чем пролиферация, получаемая при введении нуклеиновой кислоты, кодирующей IL15, либо одной, либо в сочетании с другой, кодирующей IL15αR-sushi, или с нуклеиновой кислотой, кодирующей слитый белок ApoA1 с IL15, либо одной, либо в сочетании с другой, кодирующей IL15αR-sushi.

Композиции по изобретению

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к композиции, включающей совместно или раздельно,

(i) первый компонент, выбранный из группы

(a) полипептида, включающего полипептид Apo A или его функционально эквивалентный вариант, обладающий по меньшей мере 70% идентичностью с указанным полипептидом Apo A, и

(b) полинуклеотида, кодирующего полипептид Apo A или его функционально эквивалентный вариант, обладающий по меньшей мере 70% идентичностью с указанным полипептидом Apo A, и

(ii) второй компонент, выбранный из группы

(a) IL15 или его функционально эквивалентного варианта, обладающего по меньшей мере 70% идентичностью с IL15, и

(b) полинуклеотида, кодирующего IL15 или его функционально эквивалентный вариант, обладающий по меньшей мере 70% идентичностью с IL15, и

(iii) третий компонент, выбранный из группы

(a) домена Sushi альфа цепи рецептора IL15 или его функционально эквивалентного варианта, обладающего по меньшей мере 70% идентичностью с доменом Sushi альфа цепи рецептора IL15, и

(b) полинуклеотида, кодирующего домен Sushi альфа цепи рецептора IL15 или его функционально эквивалентный вариант, обладающий по меньшей мере 70% идентичностью с доменом Sushi альфа цепи рецептора IL15.

Применяемый в настоящем описании термин «композиция» относится композиции веществ, содержащих указанные компоненты, другими словами полипептид Apo A, IL15 и домен Sushi альфа цепи рецептора IL15, а также любой другой продукт, прямо или непрямо происходящий из сочетания различных компонентов в любом их количестве. Специалист в данной области техники должен понимать, что композиция может быть составлена в виде единой композиции или может быть представлена как состав каждого из компонентов отдельно, так чтобы они могли объединяться для совместного использования в форме объединенного препарата. Композиция может представлять собой набор частей, где каждый компонент составлен и упакован отдельно.

Термин «белок», применяемый в настоящем описании наравне с полипептидом, относится к аминокислотной цепи любой длины, в которой различные аминокислоты соединены друг с другом пептидными связями или дисульфидными мостиками.

Применяемый в настоящем описании термин «полинуклеотид» относится к полимеру, образованному вариабельным количеством мономеров, где мономеры представляют собой нуклеотиды, включая рибонуклеотиды, а также дезоксирибонуклеотиды. Полинуклеотиды включают мономеры, модифицированные метилированием, а также немодифицированные формы. Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используются в настоящем изобретении без их различия, и включают мРНК, кДНК и рекомбинантные полинуклеотиды. При применении в настоящем описании полинуклеотиды не ограничиваются полинуклеотидами, представленными в природе, и включают также полинуклеотиды, в которых присутствуют неприродные нуклеотидные аналоги и межнуклеотидные связи. Неограничивающие примеры этого типа неприродных структур включают полинуклеотиды, в которых сахар отличается от рибозы, полинуклеотиды, в которых появляются фосфодиэфирные связи 3'-5' и 2'-5', полинуклеотиды, в которых появляются инвертированные связи (3'-3' и 5'-5'), и разветвленные структуры. Полинуклеотиды по изобретению включают также неприродные межнуклеотидные связи, такие как в пептидо-нуклеиновых кислотах (PNA), блокированных нуклеиновых кислотах (LNA), C1-C4 алкилфосфонатные связи метилфосфоната, связи фосфорамидатного, C1-C6 алкилфосфотриэфирного, фосфортиоатного и фосфордитиоатного типа. В любом случае полинуклеотиды по изобретению сохраняют способность гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами-мишенями сходным с природными полинуклеотидами способом.

Первый компонент композиции по изобретению

Первый компонент композиции по изобретению выбран из группы полипептида Apo A или его функционально эквивалентного варианта и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Apo A или его функционально эквивалентный вариант.

Применяемый в настоящем описании термин «полипептид Apo A» относится к любому члену семейства Apo A, образующего часть липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), и способному специфически взаимодействовать с рецепторами на поверхности клеток печени, гарантируя тем самым свою способность транспортировать представляющие интерес молекулы к этому органу, совместно с белком Apo A. Предпочтительно молекулы Apo A, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, выбраны из группы ApoA-I, ApoA-II, ApoA-III, ApoA-IV и ApoA-V или их функционально эквивалентных вариантов.

В предпочтительном варианте осуществления белок Apo A, который используют в настоящем изобретении, представляет собой белок ApoA-I. ApoA-I в контексте настоящего изобретения понимается как форма зрелого белка пре-проАроА-I, который образует часть липопротеидов высокой плотности (ЛПВП). ApoA-I синтезируется в виде предшественника (пре-проАроА-I), содержащего сигнальную последовательность секретируемых белков, которая удаляется, создавая путь для секреции предшественника. Сигнальная последовательность состоит из 18 аминокислот, пропептид из 6 и форма зрелого белка из 243 аминокислот. Предпочтительно используется форма зрелого белка, не имеющего сигнального пептида и после процессинга. В предпочтительном варианте осуществления белок ApoA-I происходит от человека, и его аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, представленную SEQ ID NO:1 (номер поступления UniProt P02647). В другом предпочтительном варианте осуществления белок ApoA-I происходит от мышей, в частности, от мыши, и его аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, представленную SEQ ID NO:2 (номер поступления UniProt Q00623). В другом предпочтительном варианте осуществления белок ApoA-I происходит от мышей, в частности, от крысы, и его аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, представленную SEQ ID NO:3 (номер поступления UniProt P04639).

«Функционально эквивалентный вариант ApoA-I» понимается как обозначающий все те полипептиды, которые происходят в результате вставки, замены или делеции одной или более аминокислот в указанной выше последовательности ApoA-I, поддерживая по существу интактной их способность взаимодействовать с так называемым «рецептором-мусорщиком класса B типа I» (SR-BI), образующим рецептор ЛПВП, представленный в клетках печени. Способность взаимодействовать с рецептором ЛПВП определяют главным образом как описано Monaco et al (EMBO J., 1987, 6:3253-3260), или путем исследований связывания ApoA-I с мембраной гепатоцитов, или с помощью определения способности ApoA-I или его вариантов ингибировать связывание ЛПВП с рецепторами мембран гепатоцитов. Предпочтительно константа диссоциации связывания варианта ApoA-I с мембранами гепатоцитов составляет по меньшей мере 10^-8 М, 10^-7 М, 10^-6 М, 10^-5 М или 10^-4 М.

В контексте настоящего изобретения рассматриваемые варианты ApoA-I включают полипептиды, сходные или идентичные полипептидам ApoA-I по меньшей мере на 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90% или 95%. Степень идентичности между двумя полипептидами определяют с использованием алгоритмов компьютерных программ и способов, широко известных специалистам в данной области техники. Степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями предпочтительно определяют с использованием алгоритма BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. et al., J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410).

Предпочтительно варианты ApoA-I, используемые в контексте изобретения, имеют большой период полужизни в сыворотке относительно указанного выше ApoA-I, делая возможным достижение уровней [вариантов] ApoA-I в сыворотке, более высоких, чем уровни, наблюдаемые у ApoA-I. Методы определения периода полужизни белка в сыворотке и, в частности, ApoA-I, известны в данной области техники и включают среди прочего использование методов, основанных на метаболическом промечивании маркерными белками, описанных Eisenberg, S. et al (J.Lipid Res., 1973,14:446-458), Blum et al. (J. Clin. Invest., 1977, 60:795-807) и Graversen et al (J Cardiovasc Pharmacol., 2008, 51:170-177). Примером указанных вариантов, имеющих более высокий период полужизни, является, например, вариант, известный как Milano (который содержит мутацию R173C).

Первый компонент по изобретению может представлять собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один из ApoA и вариантов ApoA, указанных выше. Таким образом, в случае нуклеиновой кислоты, кодирующей ApoA, она может происходить от человека, соответствуя последовательности с номером поступления NCBI X02162 (SEQ ID NO:4), от мышей, соответствуя последовательности с номером поступления NCBI X64262 (SEQ ID NO:5), от крысы, соответствуя последовательности с номером поступления NCBI M00001 (SEQ ID NO:6).

Специалист в данной области техники должен понимать, что нуклеиновой кислоте, составляющей первый компонент по изобретению, необходимо экспрессироваться внутри клетки и в конечном итоге в вести к секреции в среду, в связи с чем последовательность, кодирующая ApoA или его функционально эквивалентный вариант, может присутствовать на 5'-конце последовательности, кодирующей сигнал секретируемых белков. Выражение «сигнальная последовательность для секретируемых белков» при применении в настоящем изобретении относится к аминокислотной последовательности, способной стимулировать доступ к секреторному пути для всех тех белков, которые презентируют указанную последовательность на их N-концевом участке. Подходящие сигнальные последовательности для использования в настоящем изобретении включают среди прочего сигнальную последовательность тканевого активатора плазминогена (tPA), гормона роста, GM-CSF и иммуноглобулинов и, в частности, Igκ или IgVχ. Предпочтительно сигнальная последовательность, составляющая часть компонента A по изобретению, представляет собой сигнальную последовательность самого ApoA, как определено ранее.

Альтернативно, первый компонент по изобретению может представлять собой нуклеиновую кислоту, идентичную по последовательности по меньшей мере на 70% по меньшей мере на 75% по меньшей мере на 80% по меньшей мере на 85% по меньшей мере на 90% по меньшей мере на 91% по меньшей мере на 92% по меньшей мере на 93% по меньшей мере на 94% по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96% по меньшей мере на 97% по меньшей мере на 98% по меньшей мере на 99% любым указанным выше последовательностям, где процент идентичности определяется с использованием алгоритмов типа GAP, BESTFIT или FASTA, чья компьютерная разработка представлена в Wisconsin Genetics Software Package Release 7 (Wisconsin Genetics Software Package Release 7,0, Genetics Computer Group,575 Science Dr., Madison, Wis.) и которая использует локальные алгоритмы Smith and Waterman (adv. Appl. Math., 1981, 2:482), Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 1970, 48: 443) или Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1988, 85:2444) с использованием для различных параметров величин по умолчанию.

Альтернативно первый компонент композиции по изобретению представляет собой полинуклеотид, кодирующий ApoA или его вариант, способный специфически гибридизоваться с любой из природных последовательностей, соответствующих ApoA различных указанных ранее млекопитающих. «Полинуклеотиды, способные специфически гибридизоваться с полинуклеотидом-мишенью», в контексте настоящего изобретения понимаются как обозначающие те полинуклеотиды, которые способны гибридизоваться в жестких условиях, жесткие условия понимаются как обозначающие условия, которые дают возможность гибридизоваться двум нуклеиновым кислотам при температуре, например, приблизительно 65°С, в растворе 6×SSC, 0,5% SDS, 5% растворе Денхардта и неспецифической денатурированной ДНК в концентрации 100 мкг/мл любого другого раствора с эквивалентной ионной силой и с последующей стадией отмывки при 65°С в присутствии раствора, например, 0,2% SSC и 0,1% SDS, и любого другого раствора с эквивалентной ионной силой. Тем не менее, жесткие условия могут быть адаптированы специалистом в данной области техники в соответствии с размером последовательности, подвергаемой гибридизации, в соответствии с содержанием ГЦ и в соответствии с другими параметрами. Пригодные методы для выбора подходящих условий гибридизации описаны Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd Edition, Laboratory Press, cold Spring Harbor, New York).

Второй компонент композиции по изобретению

Второй компонент по изобретению выбран из группы IL15 или его функционально эквивалентного варианта и нуклеиновой кислоты, кодирующей IL15 или его функционально эквивалентный вариант.

Термин «IL15» или «IL-15» при использовании в настоящем изобретении относится к цитокину, выделение, клонирование и последовательность которого описаны Grabstein et al. (патент США US5747024 и Grabstein et al., 1994, Science 246: 965-968). Термин IL15 включает любую полипептидную форму с аминокислотной последовательностью природного IL15. Примеры IL15, которые могут быть использованы, создавая часть композиций и слитых белков по изобретению, включают IL15 грызунов (мыши, крысы, хомячка), человека, приматов, собак, кошек, свиней, лошадей, коров, овец и тому подобного. Полипептиды IL15 млекопитающих, которые могут составлять часть композиций и слитых белков по изобретению, включают без ограничения IL15, происходящий от человека, чья аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, представленную в P40933 (SEQ ID NO:7); IL15 мыши, чья аминокислотная последовательность представлена в P48346 (SEQ ID NO:8); IL15 крысы, чья аминокислотная последовательность представлена в P97604 (SEQ ID NO:9); IL15 кошки, чья аминокислотная последовательность представлена в O97687 (SEQ ID NO:10) и IL15 быка, чья аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, представленную в Q28028 (SEQ ID NO:11).

«Функционально эквивалентный вариант IL15» понимается как обозначающий все те полипептиды, которые возникают в результате вставки, замены или делеции одной или более аминокислот в указанных выше последовательностях IL15 и которые поддерживают по существу интактной по меньшей мере одну из функций IL15, где указанная функция выбрана из:

- способности стимулировать пролиферацию CD8+ Т-клеток, определенную, например, с помощью метода, описанного Montes, et al, (Clin. Exp. Immunol., 2005, 142:292-302), основанного на инкубации популяции периферических мононуклеарных клеток крови с пептидом-антигеном в присутствии варианта IL15 с последующим определением процента клеток, которые могут быть меченными специфическими антителами против CD8,

- способности стимулировать активацию NK клеток после презентации в преобразованном виде дендритными клетками. Эта способность может быть определена путем измерения включения меченного тритием тимидина в часть CD56+ NK клеток в присутствии IL15 или путем измерения секреции NK клетками цитокина GM-CSF. Методы определения обеих функций IL15 описаны Carson, W. et al. (J.Exp.med., 1994, 180:1395-1403), в отношении макрофагов и нейтрофилов,

- способности IL15 ингибировать опосредуемый Fas апоптоз предшественников В-клеток, как описано Demirci et al. (Cell Mol Immunol. 2004, 1:123-8), который может быть определен с использованием стандартных методов определения апоптоза, таких как TUNEL или определение фрагментации ДНК с помощью гель-электрофореза и окрашивания бромидом этидия.

В контексте настоящего изобретения рассматриваемые варианты IL15 включают полипептиды, сходные или идентичные полипептидам IL15 млекопитающих, указанным выше по меньшей мере на 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90% или 95%. Степень идентичности между двумя полипептидами определяют с использованием алгоритмов компьютерных программ и способов, широко известных специалистам в данной области техники. Степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями предпочтительно определяют с использованием алгоритма BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. et al., J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410).

Второй компонент по изобретению может представлять собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один из природного IL15 и указанных выше вариантов IL15. Нуклеиновые кислоты, кодирующие IL15 млекопитающих, могут быть получены из депозитариев и включают без ограничения полинуклеотиды, чьи последовательности определены с помощью номеров поступления U14407 (человек, SEQ ID NO:12), U14332 (мышь, SEQ ID NO:13), U69272 (крыса, SEQ ID NO:14), AF108148 (кошка, SEQ ID NO:15) и U42433 (бык, SEQ ID NO:16).

Указанные полинуклеотиды включают полинуклеотиды, идентичные по последовательности по меньшей мере на 70% по меньшей мере на 75% по меньшей мере на 80% по меньшей мере на 85% по меньшей мере на 90% по меньшей мере на 91% по меньшей мере на 92% по меньшей мере на 93% по меньшей мере на 94% по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96% по меньшей мере на 97% по меньшей мере на 98% по меньшей мере на 99% любым указанным выше последовательностям, где процент идентичности определяется с использованием одного из алгоритмов, указанных выше.

Альтернативно, полинуклеотиды, образующие второй компонент по изобретению, представляют собой полинуклеотиды, способные специфически гибридизоваться с указанными ранее полинуклеотидами. Методы определения способности полинуклеотидов специфически гибридизоваться с последовательностью-мишенью подробно описаны в контексте первого компонента по изобретению.

Специалист в данной области техники должен понимать, что нуклеиновая кислота, составляющая второй компонент