Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab

Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к полиспецифичным, особенно биспецифичным антителам, включающим антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты Fab, к способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и к их применению.

Предпосылки создания изобретения

В недавнем прошлом разработан широкий спектр форматов полиспецифичных рекомбинантных антител, например, четырехвалентных биспецифичных антител, полученных путем слияния, например, антител формата IgG и одноцепочечных доменов (см., например, M.J.Coloma и др., Nature Biotech, 15, 1997, cc.159-163, WO 2001/077342 и S.L.Morrison, Nature Biotech, 25,2007, cc.1233-1234).

Также разработано несколько других новых форматов, в которых уже не сохраняется структура ядра антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), например, ди-, три- или тетратела, минитела, несколько одноцепочечных форматов (scFv, Bis-scFv), которые способны к связыванию с двумя или несколькими антигенами (Р.Holliger и др., Nature Biotech, 23, 2005, cc. 1126-1136, N.Fischer, O. Léger, Pathobiology, 74, 2007, cc.3-14, J.Shen и др., Journal of Immunological Methods, 318, 2007, cc.65-74, С.Wu и др., Nature Biotech., 25, 2007, cc.1290-1297).

Во всех таких форматах используют линкеры, либо для слияния ядра антитела (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) с дополнительным связывающим белком (например, ScFv), либо для слияния, например, двух Фрагментов Fab или scFv (N.Fischer, О.Léger, Pathobiology, 74, 2007, cc.3-14). Следует учитывать, что возможно сохранение эффекторных функций, например, комплементзависимой цитотоксичности (complement dependent cytotoxicity - CDC) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC), которые опосредованы через связывание с рецептором Fc, путем поддержания высокой степени сходства с природными антителами.

В WO 2007/024715 описывают иммуноглобулины с двойственными вариабельными доменами, сконструированными в виде поливалентных и полиспецифичных связывающих белках. Способ получения димеров антител биологического действия описан в US 6897044. Поливалентная конструкция фрагмента антитела Fy, имеющая по меньшей мере четыре вариабельных домена, которые связаны друг с другом посредством пептидных линкеров, описана в US 7129330. Димерные и полимерные антигенсвязывающие структуры описаны в US 2005/0079170. В US 6511663 сообщают о трех- или четырехвалентном моноспецифичном антигенсвязывающем белке, включающем три или четыре фрагмента Fab, ковалентно связанных друг с другом через связывающую структуру, при этом белок не является природным иммуноглобулином. В WO 2006/020258 сообщают о четырехвалентных биспецифичных антителах, которые могут эффективно экспрессироваться в прокариотических и эукариотических клетках и которые полезны в терапевтических и диагностических методах. Метод разделения или предпочтительно синтеза димеров, которые связаны с помощью по меньшей мере одной межцепочечной дисульфидной связи, от димеров, которые не связаны с помощью по меньшей мере одной межцепочечной дисульфидной связи, в смеси, включающей два типа полипептидных димеров, сообщают в US 2005/0163782. В US 5959083 сообщают о биспецифичных четырехвалентных рецепторах. В WO 2001/077342 C сообщают о создании антител с тремя и более функциональными антигенсвязывающими участками в WO 2001/077342.

Полиспецифичные и поливалентные антигенсвязывающие полипептиды описаны в WO 1997/001580. В WO 1992/004053 сообщают о гомоконъюгатах, обычно получаемых из моноклональных антител класса IgG, которые связываются с одной и той же антигенной детерминантой и которые ковалентно связаны посредством синтетических перекрестных сшивок. В заявке WO 1991/06305 сообщают об олигомерных моноклональных антителах с высокой авидностью к антигену, причем секретируются олигомеры, обычно класса IgG, с двумя или более мономерами иммуноглобулина, связаны вместе для формирования четырехвалентных или шестивалентных молекул IgG. В US 6350860 сообщают об антителах, производных от овец, и о сконструированных конструкциях антител, которые можно применять для лечения заболеваний, в которых активность интерферона гамма является патогенной. В US 2005/0100543 сообщают о конструкциях, нацеливаемых на мишень, которые являются поливалентными носителями биспецифичных антител, т.е. каждая молекула конструкции, нацеливаемой на мишень, может служить в качестве носителя двух или нескольких биспецифичных антител. В WO 1995/009917 сообщают о генно-инженерных биспецифичных четырехвалентных антителах. В WO 2007/109254 сообщают о стабилизированных связывающих молекулах, которые состоят из стабилизированного фрагмента scFv или включают его.

В кн.: D.Müller и др. «Handbook of Therapeutic antibodies», 2008, ч. III, гл. 2, cc.345-378, сообщают о биспецифичных антителах, например, об антителе полной длины, к которому посредством пептидного линкера на С-конце тяжелой цепи присоединены два фрагмента scFv (см. также WO 1995/009917). В работе М.Hust и др., ВМС Biotechnology, 2007, с.7, сообщают об одноцепочечных фрагментах Fab (scFab).

Поскольку существуют различные проблемы и задачи, связанные с полиспецифичными антителами (например, фармакокинетические и биологические свойства, стабильность, агрегация, выход экспрессии), имеется необходимость в дальнейшей разработке других форматов полиспецифичных антител. Например, генно-инженерные биспецифичные четырехвалентные антитела, описанные в WO 1995/009917 и в кн.: D. Müller и др. «Handbook of Therapeutic antibodies», 2008, ч.III, гл.2, cc.345-378, показали слишком низкие выходы экспрессии.

Краткое описание изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является полиспецифичное антитело, включающее

а) антитело полной длины, специфически связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) один или несколько одноцепочечных фрагментов Fab, специфически связывающихся с одним или до четырех дополнительных антигенов (предпочтительно специфически связывающихся с одним дополнительным антигеном),

в котором указанные одноцепочечные фрагменты Fab по пункту б) гибридизированы с указанным антителом полной длины по пункту а) посредством пептидного коннектора с С- или N-конца тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины.

Предпочтительным объектом настоящего изобретения является полиспецифичное антитело, включающее

а) антитело полной длины, специфически связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) от одного до четырех одноцепочечных фрагментов Fab, специфически связывающихся с одним или до четырех дополнительных антигенов (предпочтительно специфически связывающихся с одним дополнительным антигеном),

в котором указанные одноцепочечные фрагменты Fab по пункту б) гибридизированы с указанным антителом полной длины по пункту а) посредством пептидного коннектора с С- или N-конца тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины.

Предпочтительно указанное полиспецифичное антитело включает один или два одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном (биспецифичное антитело).

Предпочтительно указанное полиспецифичное антитело включает два одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном (биспецифичное антитело).

Предпочтительно указанное полиспецифичное антитело включает два одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном и третьим антигеном (трехспецифичное антитело).

Другим объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанное полиспецифичное антитело, в котором одноцепочечный фрагмент Fab гибридизирован с С- или N-концом тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины.

Кроме того, дополнительным объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая указанное полиспецифичное антитело.

Полиспецифичные антитела по настоящему изобретению показали ценные свойства, например, высокую стабильность, низкую тенденцию к агрегации (см., например, пример 2), например, по сравнению с антителом полной длины, к которому присоединены два фрагмента scFv посредством пептидного линкера с С-конца тяжелой цепи (см. WO 1995/009917 или кн.: D.Müller и др. «Handbook of Therapeutic antibodies», 2008, ч.III, гл.2, c. 345-378).

С одной стороны полиспецифичные антитела по настоящему изобретению показывают новые свойства из-за способности связываться с другими антигенами, а с другой стороны они применимы для получения и технологии приготовления лекарственного средства, благодаря их хорошей стабильности, низкой агрегации и ценным фармакокинетическим и биологическим свойствам. Благодаря ядру Ig и способности вырабатываться в экспрессирующих системах млекопитающих, они все же сохраняют свойства природных антител, например ADCC и CDC.

Подробное описание изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является полиспецифичное антитело, включающее

а) антитело полной длины, специфически связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) один или несколько одноцепочечных фрагментов Fab, специфически связывающихся с одним или до четырех дополнительных антигенов (предпочтительно специфически связывающихся с одним дополнительным антигеном),

в котором указанные одноцепочечные фрагменты Fab по пункту б) соединены с указанным антителом полной длины по пункту а) посредством пептидного коннектора с С- или N-конца тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины.

Предпочтительным объектом настоящего изобретения является полиспецифичное антитело, включающее

а) антитело полной длины, специфически связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) от одного до четырех одноцепочечных фрагментов Fab, специфически связывающихся с одним или до четырех дополнительных антигенов (предпочтительно специфически связывающихся с одним дополнительным антигеном),

в котором указанные одноцепочечные фрагменты Fab по пункту б) гибридизированы с указанным антителом полной длины по пункту а) посредством пептидного коннектора с С- или N-конца тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения один или два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, соединены с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с С-конца тяжелых или легких цепей указанного антитела полной длины.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения один или два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, соединены с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с С-конца тяжелых цепей указанного антитела полной длины.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения один или два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, соединены с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с С-конца легких цепей указанного антитела полной длины.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, соединены с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с С-конца каждой тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, гибридизированы с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с С-конца каждой тяжелой цепи указанного антитела полной длины.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, гибридизированы с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с С-конца каждой легкой цепи указанного антитела полной длины.

Понятие «антитело полной длины» означает антитело, состоящее из двух «тяжелых цепей антитела полной длины» и двух «легких цепей антитела полной длины» (см. фиг.1). «Тяжелая цепь антитела полной длины» представляет собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца к С-концу из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 тяжелой цепи антитела (СН1), шарнирной области антитела (HR), константного домена 2 тяжелой цепи антитела (СН2) и константного домена 3 тяжелой цепи антитела (СН3), сокращенно обозначаемый VH-CH1-HR-CH2-CH3, и необязательно константного домена 4 тяжелой цепи антитела (СН4) в случае антитела подкласса IgE. Предпочтительно «тяжелая цепь антитела полной длины» является полипептидом, состоящим в направлении от N-конца к С-концу из VH, СН1, HR, CH2 и СН3. «Легкая цепь антитела полной длины» представляет собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца к С-концу из вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL), сокращенно обозначаемый VL-CL. Константный домен легкой цепи антитела (CL) может быть доменом к (каппа) или λ (лямбда). Две цепи антитела полной длины связаны вместе посредством межполипептидных дисульфидных связей между CL доменом и СН1 доменом, и между шарнирными областями тяжелых цепей антитела полной длины. Примерами типичных антител полной длины являются природные антитела, например IgG (например, IgG 1 или IgG2), IgM, IgA, IgD и IgE. Антитела полной длины по настоящему изобретению могут происходить от одного вида, например человека, или они могут являться химерными или гуманизированными антителами. Антитела полной длины по настоящему изобретению включают два сайта связывания антигена, каждый из которых образован парой VH и VL, причем оба специфически связываются с одним и тем же антигеном. С-конец тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины означает последнюю аминокислоту на С-конце указанной тяжелой или легкой цепи. N-конец тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины означает последнюю аминокислоту на N-конце указанной тяжелой или легкой цепи.

«Одноцепочечный фрагмент Fab» (см. фиг.2) представляет полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 антитела (СН1), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), константного домена легкой цепи антитела (CL) и линкера, в котором указанные домены антитела и указанный линкер имеют одну из следующих последовательностей в направлении от N-конца к С-концу:

a) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-CH1, в) VH-CL-линкер-VL-CH1 или г) VL-CH1-линкер-VH-CL, и в котором указанный линкер представляет полипептид, состоящий по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно из 32-50 аминокислот. Указанные одноцепочечные фрагменты Fab a) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-CH1, в) VH-CL-линкер-VL-СН1 и г) VL-CH1-линкер-VH-CL стабилизированы посредством природной дисульфидной связи между доменом CL и доменом СН1. Понятие «N-конец» означает последнюю аминокислоту N-конца. Понятие «С-конец» означает последнюю аминокислоту С-конца.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные домены антитела и указанный линкер в указанном одноцепочечном фрагменте Fab имеют одну из следующих последовательностей в направлении от N-конца к С-концу: a) VH-CH1-линкер-VL-CL или б) VL-CL-линкер-VH-СН1, более предпочтительно VL-CL-линкер-VH-CH1.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные домены антитела и указанный линкер в указанном одноцепочечном фрагменте Fab имеют одну из следующих последовательностей в направлении от N-конца к С-концу: а) VH-CL-линкер-VL-СН1 или б) VL-CH1-линкер-VH-CL.

Необязательно в указанном одноцепочечном фрагменте Fab, помимо природной дисульфидной связи между доменом CL и доменом СН1, также вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) стабилизированы дисульфидом посредством введения дисульфидной связи между следующими положениями:

i) положением 44 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 100 вариабельного домена легкой цепи,

ii) положением 105 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 43 вариабельного домена легкой цепи или

iii) положением 101 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 100 вариабельного домена легкой цепи, (нумерация всегда соответствует индексу ЕС по К-abat).

Такая дополнительная дисульфидная стабилизация одноцепочечных фрагментов Fab достигается посредством введения дисульфидной связи между вариабельными доменами VH и VL одноцепочечных фрагментов Fab. Методы введения неприродных дисульфидных мостиков с целью стабилизации одноцепочечного фрагмента Fv описаны, например, в WO 94/029350, V.Rajagopal и др., Prot. Engin., 10, 1997, c.1453-1459, H.Kobayashi и др., Nuclear Medicine & Biology, 25, 1998, c.387-393 или М.Schmidt и др., Oncogene, 18, 1999, cc.1711-1721. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения необязательная дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечных фрагментов Fab, включенных в антитело по настоящему изобретению, находится между положением 44 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 100 вариабельного домена легкой цепи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения необязательная дисульфидная связь между вариабельными доменами одноцепочечных фрагментов Fab, включенных в антитело по настоящему изобретению, находится между положением 105 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 43 вариабельного домена легкой цепи (нумерация всегда соответствует индексу ЕС по Kabat).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительны одноцепочечные фрагменты Fab без указанной необязательной дисульфидной стабилизацией между вариабельными доменами VH и VL одноцепочечных фрагментов Fab.

Понятие «пептидный коннектор» в контексте настоящего изобретения означает пептид с аминокислотной последовательностью, предпочтительно синтетического происхождения. Эти пептидные коннекторы по настоящему изобретению используют для присоединения одноцепочечных фрагментов Fab к С- или N-концу антитела полной длины для формирования полиспецифичного антитела по настоящему изобретению. Предпочтительно указанные пептидные коннекторы по пункту б) являются пептидами с аминокислотной последовательностью, длина которой состоит по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно длиной по меньшей мере из 5-100, более предпочтительно из 10-50 аминокислот. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанным пептидным коннектором является (GxS)n или (GxS)nGm, где G = глицин, S = серин и (х=3, n=3, 4, 5 или 6, и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5, и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4 и n=2 или 3, более предпочтительно х=4, n=2. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанным пептидным коннектором является (G₄S)₂.

Понятие «линкер» в контексте настоящего изобретения означает пептид с аминокислотными последовательностями, предпочтительно синтетического происхождения. Эти пептиды по настоящему изобретению используют для связывания a) VH-CH1 с VL-CL, б) VL-CL с VH-CH1, в) VH-CL с VL-CH1 или г) VL-CH1 с VH-CL для образования следующих одноцепочечных фрагментов Fab по настоящему изобретению а) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-СН1, в) VH-CL-линкер-VL-СН1 или г) VL-СН1-линкер-VH-CL. Указанный линкер в одноцепочечных фрагментах Fab является пептидом с аминокислотной последовательностью, длина которой состоит по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно длиной из 32-50 аминокислот. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанным линкером является (GxS)n, где G = глицин, S = серин, (х=3, n=8, 9 или 10 и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4 и n=6, 7 или 8 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4, n=6 или 7 и m=0, 1, 2 или 3, более предпочтительно х=4, n=7 и m=2. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанным линкером является (G₄S)₆G₂.

К каждому С- или N-концу тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины одновременно можно присоединить только один из одноцепочечных фрагментов Fab по пункту б). Таким образом, с указанным антителом полной длины можно гибридизировать до восьми одноцепочечных фрагментов Fab. Предпочтительно полиспецифичное антитело по настоящему изобретению включает от одного до четырех одноцепочечных фрагментов Fab. Более предпочтительно полиспецифичное антитело по настоящему изобретению включает два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab (предпочтительно VL-CL-линкер-VH-СН1), оба из которых присоединены к двум С-концам двух тяжелых цепей или к двум С-концам двух легких цепей указанного антитела полной длины по пункту а). Такая гибридизация приводит к двум идентичным гибридным пептидам [либо i) тяжелой цепи и одноцепочечного фрагмента Fab, либо ii) легкой цепи и одноцепочечного Фрагмента Fab], которые совместно экспрессируются либо с i) легкой цепи, либо с тяжелой цепи антитела полной длины с образованием полиспецифичного антитела по настоящему изобретению (см. фиг.3, 4 и 5).

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полиспецифичное антитело по настоящему изобретению включает два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab (предпочтительно VH-CH1-линкер-VL-CL), оба из которых присоединены к двум N-концам двух тяжелых цепей или к двум N-концам двух легких цепей указанного антитела полной длины по пункту а). Такая гибридизация приводит к двум идентичным гибридным пептидам (либо i) тяжелой цепи и одноцепочечного фрагмента Fab, либо ii) легкой цепи и одноцепочечного фрагмента Fab), которые совместно экспрессируются либо с i) легкой цепи, либо с тяжелой цепи антитела полной длины с образованием полиспецифичного антитела по настоящему изобретению.

Обе части полиспецифичного антитела по настоящему изобретению включают сайты связывания антигена (антитело полной длины по настоящему изобретению включает два, и каждый одноцепочечный Fab-фрагмент включает один сайт связывания антигена). Понятия «сайт связывания» или «сайт связывания антигена» в контексте настоящего изобретения означают область (области) указанного полиспецифичного антитела по настоящему изобретению, с которыми действительно специфически связывается соответствующий антиген. Каждый из сайтов связывания антигена, или в антителе полной длины, или в одноцепочечном фрагменте Fab, сформирован парой, состоящей из вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH).

Сайты связывания антигена, которые специфически связываются с требуемым антигеном (например, EGFR), могут быть получены а) из известных антител к антигену (например, анти-EGFR антител), или б) из новых антител или фрагментов антител, вновь полученных посредством методов иммунизации, используя среди прочего или антигенный белок, или нуклеиновую кислоту, или их фрагменты, или посредством фагового дисплея.

Сайт связывания антигена у антитела по настоящему изобретению содержит шесть комплементарность-детерминирующих областей (complementary determining region - CDR), которые влияют на варьирующую степень сродства сайта связывания с антигеном. Имеется три области CDR вариабельного домена тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три области CDR вариабельного домена легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3). Протяженность CDR и каркасных участков (framework regions - FR) определяют путем сравнения с аминокислотными последовательностями сводной базы данных, в которых эти участки установлены по вариабельности среди последовательностей.

Специфичность антитела относится к селективному распознаванию антителом конкретного эпитопа антигена. Природные антитела, например, являются моноспецифичными. Понятие «полиспецифичное» антитело в контексте настоящего изобретения означает антитело, которое имеет два или несколько сайтов связывания антигена, из которых по меньшей мере два связываются с различными антигенами или различными эпитопами одного и того же антигена. «Биспецифичными антителами» по настоящему изобретению являются антитела, которые обладают двумя различными антигенсвязывающими специфичностями. Антитела настоящего изобретения являются, например, полиспецифичными по отношению, по меньшей мере, к двум различным антигенам, т.е. EGFR в качестве первого антигена и IGF-1R в качестве второго антигена. В одном варианте осуществления настоящего изобретения полиспецифичное антитело по настоящему изобретению является биспецифичным. В другом варианте осуществления настоящего изобретения полиспецифичное антитело по настоящему изобретению является трехспецифичным.

Понятие «моноспецифичное» антитело в контексте настоящего изобретения означает антитело, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.

Понятие «валентный» в контексте настоящей заявки означает присутствие конкретного числа сайтов связывания в молекуле антитела. Например, природное антитело или антитело полной длины по настоящему изобретению имеет два сайта связывания и является двухвалентным. Таким образом, понятия «трехвалентное», «четырехвалентное», «пятивалентное» и «шестивалентное» относятся к присутствию двух сайтов связывания, трех сайтов связывания, четырех сайтов связывания, пяти сайтов связывания и шести сайтов связывания, соответственно, в молекуле антитела. Полиспецифичные антитела по настоящему изобретению являются по меньшей мере «трехвалентными». Предпочтительно они являются «трехвалентными», «четырехвалентными», «пятивалентными» или «шестивалентными», более предпочтительно они являются «трехвалентными» или «четырехвалентными».

Антитела по настоящему изобретению имеют три или более сайтов связывания и являются полиспецифичными, предпочтительно биспецифичными или трехспецифичными. Поскольку полиспецифичные антитела по настоящему изобретению могут быть биспецифичными даже в тех случаях, когда присутствует более трех сайтов связывания (т.е. когда антитело является четырехвалентным, пятивалентным, шестивалентным или поливалентным). У антител более чем с двумя сайтами связывания антигена, некоторые сайты связывания могут быть идентичными, при этом белок имеет сайты связывания для двух разных антигенов.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является полиспецифичное антитело, включающее

а) антитело полной длины, специфически связывающееся с первым антигеном и состоящее из:

аа) двух идентичных тяжелых цепей антитела, состоящих в направлении от N-конца к С-концу из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена тяжелой цепи антитела 1 (СН1), шарнирного участка антитела (HR), константного домена тяжелой цепи антитела 2 (СН2) и константного домена тяжелой цепи антитела 3 (CH3), и

аб) двух идентичных легких цепей антитела, состоящих в направлении от N-конца к С-концу из вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL) (VL-CL), и

б) от одного до четырех одноцепочечных фрагментов Fab специфически связывающихся с одним или до четырех дополнительных антигенов (предпочтительно специфически связывающихся с одним дополнительным антигеном), в котором одноцепочечные фрагменты Fab состоят из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена антитела 1 (СН1), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), константного домена легкой цепи антитела (CL) и линкера, и в котором указанные домены антитела и указанный линкер имеют одну из следующих последовательностей в направлении от N-конца к С-концу:

ба) VH-CH1-линкер-VL-CL, бб) VL-CL-линкер-VH-CH1, бв) VH-CL-линкер-VL-CH1 или бг) VL-CH1-линкер-VH-CL,

в котором указанный линкер является пептидом по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно из 32-50 аминокислот,

и в котором указанные одноцепочечные фрагменты Fab по пункту б) гибридизированы с указанным антителом полной длины по пункту а) посредством пептидного коннектора с С- или N-конца тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины,

в котором указанный пептидный коннектор является пептидом по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно из 10-50 аминокислот.

В рамках указанного осуществления настоящего изобретения предпочтительно один или два, более предпочтительно два, одноцепочечных фрагмента Fab ба) VH-СН1-линкер-VL-CL или бб) VL-CL-линкер-VH-СН1, предпочтительно бб) VL-CL-линкер-VH-СН1, специфически связывающихся со вторым антигеном, гибридизированы с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с С-конца тяжелой цепи указанного антитела полной длины, и одноцепочечные фрагменты Fab не стабилизированы дисульфидами.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения представляет полиспецифичное антитело по настоящему изобретению, в котором один или два одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, гибридизированы с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с С-конца тяжелых цепей указанного антитела полной длины (биспецифичное антитело).

Предпочтительно полиспецифичное антитело по настоящему изобретению включает два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, которые оба либо соединены с тяжелой цепью, либо оба из которых соединены с С- или N-концами легкой цепи (биспецифичное антитело).

Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет полиспецифичное антитело по настоящему изобретению, в котором два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab VL-CL-линкер-VH-СН1 или VH-СH1-линкер-VL-CL, предпочтительно VL-CL-линкер-VH-CH1, связывающихся со вторым антигеном, гибридизированы своими N-концами с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с двух С-концов двух тяжелых цепей или с двух С-концов двух легких цепей указанного антитела полной длины (четырехвалентное, биспецифичное антитело). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное полиспецифичное антитело (предпочтительно указанное четырехвалентное, биспецифичное антитело) по настоящему изобретению содержит IgG полной длины и два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab по настоящему изобретению, согласно вышеуказанному, и специфически связывается с IGF-1R человека, а также с EGFR человека. Эти молекулы предпочтительно основаны на сайтах связывания антигена антител человека против IGF-1R антител <IGF-1R>HUMAB клон 18 (DSM АСС 2587, WO 2005/005635, обозначение в виде аббревиатуры <IGF-1R> клон 18 или <IGF-1R>AK18) и гуманизированном <EGFR>ICR62 (в WO 2006/082515 обозначение в виде аббревиатуры <EGFR>ICR62). Эти молекулы одновременно нацелены и интерферируют с действием двух рецепторных тирозинкиназ на опухолевых клетках. Такое двойное действие приводит к явному улучшению противоопухолевого действия по сравнению с антителами, которые интерферируют только с одним из этих рецепторов. Схема, состав, получение и описание этих молекул показаны в примерах 1-6.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое полиспецифичное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что

i) указанное антитело полной длины специфически связывается с IGF1R и включает в вариабельном домене тяжелой цепи участок CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, участок CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и участок CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, а в вариабельном домене легкой цепи участок CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, участок CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и участок CDR1 последовательности SEQ ID NO:6, и

ii) указанный одноцепочечный фрагмент Fab специфически связывается с EGFR и включает в вариабельном домене тяжелой цепи участок CDR3 последовательности SEQ ID NO:9, участок CDR2 последовательности SEQ ID NO:10 и участок CDR1 последовательности SEQ ID NO:11, а в вариабельном домене легкой цепи участок CDR3 последовательности SEQ ID NO:12, участок CDR2 последовательности SEQ ID NO:13 и участок CDR1 последовательности SEQ ID NO:14.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения такое полиспецифичное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что

i) указанное антитело полной длины специфически связывается с IGF-1R и включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:7 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:8, и

ii) указанный одноцепочечный фрагмент Fab специфически связывается с EGFR и включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи последовательность SEQ ID NO:15 и в качестве вариабельного домена легкой цепи последовательность SEQ ID NO:16.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое полиспецифичное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что

i) указанное антитело полной длины специфически связывается с EGFR и включает в вариабельном домене тяжелой цепи участок CDR3 последовательности SEQ ID NO:9, участок CDR2 последовательности SEQ ID NO:10 и участок CDR1 последовательности SEQ ID NO:11, а в вариабельном домене легкой цепи участок CDR3 последовательности SEQ ID NO:12, участок CDR2 последовательности SEQ ID NO:13 и участок CDR1 последовательности SEQ ID NO:14, и

ii) указанный одноцепочечный фрагмент Fab специфически связывается с IGF-1R и включает в вариабельном домене тяжелой цепи участок CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, участок CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и участок CDR1 последовательности SEQ ID N0:3, а в вариабельном домене легкой цепи участок CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, участок CDR2 последовательности SEQ ID N0:5 и участок CDR1 последовательности SEQ ID N0:6.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения такое полиспецифичное антитело по настоящему изобретению отличается тем, что

i) указанное антитело полной длины специфически связывается с EGFR и включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:15 и в качестве вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:16, и

ii) указанный одноцепочечный фрагмент Fab специфически связывается с IGF1R и включает в качестве вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:7 и в качестве вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:8.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является полиспецифичное антитело по настоящему изобретению, в котором два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab VL-CL-линкер-VH-CH1 или VH-CH1-линкер-VL-CL, предпочтительно VL-CL-линкер-VH-CH1, связывающихся со вторым антигеном, присоединены своими С-концами к указанному антителу полной длины посредством пептидного коннектора с двух N-концов двух тяжелых цепей или с двух N-концов двух легких цепей указанного антитела полной длины.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является полиспецифичное антитело по настоящему изобретению, в котором один одноцепочечный фрагмент Fab, связывающийся со вторым антигеном, соединен с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с С-или N-конца одной тяжелой цепи или одной легкой цепи указанного антитела полной длины. Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является полиспецифичное антитело по настоящему изобретению, в котором один одноцепочечный фрагмент Fab, связывающийся со вторым антигеном, соединен с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с N-конца одной тяжелой цепи или одной легкой цепи указанного антитела полной длины. Одним вариантом осуществления настоящего изобретения является полиспецифичное антитело по настоящему изобретению, в котором один одноцепочечный фрагмент Fab, связывающийся со вторым антигеном, соединен с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора на С-конце одной тяжелой цепи или одной легкой цепи указанного антитела полной длины (см., например, фиг.6).

Предпочтительно полиспецифичное антитело по настоящему изобретению включает два одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном и третьим антигеном (трехспецифичное антитело) (см., например, фиг.7).

В другом объекте настоящего изобретения полиспецифичное антитело по настоящему изобретению включает

а) антитело полной длины, связывающееся с одним антигеном, состоящее из двух идентичных тяжелых цепей антитела VH-CH1-HR-CH2-CH3 и двух идентичных легких цепей антитела VL-CL, и

б) от одного до четырех одноцепочечных фрагментов Fab ба) VH-CH1-линкер-VL-CL или бб) VL-CL-линкер-VH-CH1, связывающихся с одним или до четырех дополнительных антигенов, причем указанные одноцепочечные фрагменты Fab связаны с указанным антителом полной длины посредством пептидного коннектора с С- или N-конца тяжелой и легкой цепи указанного антитела полной длины.

Антитела полной длины настоящего изобретения включают константные участки иммуноглобулина одного или нескольких классов иммуноглобулинов. Классы иммуноглобулинов включают изотипы IgG, IgM, IgA, IgD и IgE и, в случае IgG и IgA, их подтипы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело полной длины н