Изопропиловый эфир [(1r,2s,5r)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты, родственные соединения и их применение в терапии

Изопропиловый эфир [(1r,2s,5r)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты, родственные соединения и их применение в терапии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННАЯ ЗАЯВКА

Настоящая заявка является родственной по отношению к заявке на патент США №12/928184, поданной 06 декабря 2010 г., полное содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в целом относится к области охлаждающих агентов и лекарственной терапии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к некоторым антиноцицептивным агентам, таким как изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты, которые обеспечивают сильное, долговременное и селективное охлаждение тканей неороговевающего эпителия по сравнению с тканями ороговевающего эпителия и подходят, например, для лечения (например, облегчения симптомов, смягчения) сенсорного дискомфорта в ткани многослойного неороговевающего эпителия (МНЭ) и, таким образом, для лечения сенсорного дискомфорта поверхности глаз, век, краев век, передней части глазного яблока, конъюнктивы, слезной системы, прекорнеальной пленки или роговицы, слизистой оболочки полости рта, внутренней части губ, поверхности глотки, поверхности пищевода или поверхности аногенитальной области; дискомфорта глаз, например, вызванного длительным ношением контактных линз, напряжением и/или усталостью глаз, загрязнителями из воздуха, чрезмерным воздействием солнечного света, конъюнктивитом, синдромом сухого глаза; сенсорного дискомфорта, связанного с оральным мукозитом; сдавленности дыхательных путей (например, гортани, трахеи и/или бронхов), дискомфорта в дыхательных путях (например, в гортани, трахее и/или бронхах), удушья, кашля и/или одышки, например, связанных с астмой и/или хроническими обструктивными болезнями легких (ХОБЛ).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящей заявке упоминается ряд публикаций с целью более полного описания и раскрытия настоящего изобретения и области техники, к которой относится настоящее изобретение. Содержание каждого из упомянутых документов полностью включено в настоящее описание посредством ссылки в той же степени, как если бы содержание каждого отдельного документа было конкретно и независимо включено посредством ссылки.

Во всем описании настоящего изобретения, включая следующую за ним формулу изобретения, если из контекста не следует иное, слово «включать» («содержать») и варианты, такие как «включает» («содержит») и «включающий» («содержащий»), подразумевают включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключение любого другого целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий.

Следует отметить, что в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения неопределенные и определенные формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст ясно не предписывает иное. Так, например, ссылка на «фармацевтический носитель» включает смеси двух или более таких носителей и т.п.

В настоящей заявке диапазоны часто выражают как от «примерно» одного конкретного значения и/или до «примерно» другого конкретного значения. Когда диапазон выражен таким образом, другой вариант реализации включает от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Аналогично, когда значения выражены в виде приблизительных величин с помощью ранее упомянутого «примерно», будет понятно, что конкретное значение составляет другой вариант реализации.

Настоящее описание включает информацию, которая может быть полезна для понимания настоящего изобретения. При этом не предполагается, что любая информация, приведенная в настоящей заявке, представляет собой известный уровень техники или имеет отношение к заявленному изобретению, или что любая публикация, упоминаемая прямо или косвенно, представляет собой известный уровень техники.

Ноцицепция

Ноцицепция может быть определена как происходящие в нервной системе процессы кодирования и обработки болевых стимулов. Особый интерес представляют антиноцицептивные лекарственные средства, обладающие периферическим действием. Термин «антиноцицептивные» означает, что лекарство подавляет физическое или физиологическое восприятие болевых стимулов. Термин «периферическое» означает, что первичное место действия лекарственного средства расположено за пределами центральной нервной системы, то есть за пределами головного и спинного мозга.

В настоящее время существует два основных класса антиноцицептивных лекарственных средств, обладающих периферическим действием по ослаблению передачи ноцицептивных (болевых) сигналов в центральную нервную систему. К первому классу относятся местные анестетики, такие как прокаин и лидокаин, которые действуют на периферические нервные волокна, подавляя проведение ноцицептивных сигналов по нервам в направлении центральной нервной системы. К другому классу относятся агенты, такие как аспирин и ибупрофен, которые ингибируют синтез некоторых простагландинов. Указанные простагландины при высвобождении из тканей во время повреждения или воспаления снижают порог для возбуждения сенсорных нервных волокон, которые реагируют на вредные стимулы. К еще одному классу антиноцицептивных лекарственных средств относятся наркотические анальгетики, которые не подавляют боль посредством периферического действия, а наоборот, действуют непосредственно на элементы нейронов головного и спинного мозга.

Боль, определенная сэром Чарльзом Шеррингтоном как "психическое дополнение к императивному защитному рефлексу", активируется повышенным разрядом немиелинизированных чувствительных волокон малого диаметра, называемых полимодальными C-волокнами. Боль разделяют на ноцицептивную и невропатическую. Ноцицептивная боль вызывается повреждением клеток, а невропатическая боль вызывается повреждением, нанесенным нервным волокнам, которые передают болевые сигналы. Существует большое количество факторов, которые вызывают боль, наиболее распространенными из которых являются, например, травма, воспаление и иммунные нарушения. Ощущениями, которые могут сопровождать боль, являются раздражение, зуд и чувство недомогания и недовольства. В настоящей заявке указанные психические дополнения к ноцицепции вместе составляют категорию "сенсорного дискомфорта".

Существуют четыре основных типа тканей животных: соединительная ткань, мышечная ткань, нервная ткань и эпителиальная ткань. Эпителиальные клетки выстилают полости и поверхности органов по всему телу. Если толщина слоя составляет одну клетку, то это слой называется простым эпителием. Если в эпителии два или более слоев клеток, он называется многослойным эпителием. Многослойный эпителий состоит в основном из чешуйчатых (плоских) клеток и нескольких кубических клеток. На коже, на внешней части губ и на языке внешний слой клеток многослойного эпителия мертвый и становится грубым, это водонепроницаемый белок, называемым кератином. Многослойный чешуйчатый эпителий, не содержащий кератин, присутствует на поверхности глаз, включая края век, переднюю часть глазного яблока, конъюнктиву, слезную систему, прекорнеальную пленку и роговицу; на слизистой оболочке полости рта, включая внутреннюю часть губ; на поверхности глотки; на поверхности пищевода и на поверхности аногенитальной области. Ороговевающие ткани противостоят травмам лучше, чем неороговевающие. Поверхности неороговевающего эпителия должны поддерживаться во влажном состоянии секретами желез (серозных или слизистых) для предотвращения высыхания.

Существующие местные антиноцицептивные (болеутоляющие) соединения имеют ограниченную эффективность по отношению к боли, связанной с многослойным неороговевающим эпителием (МНЭ). Это особенно касается дискомфорта, связанного с поверхностью глаз.

Соединения-местные анестетики, такие как лидокаин, применяют при боли и дискомфорте на поверхностях аногенитальной области (например, при вульвовагинальной боли) и в глотке (например, при кашле и фарингите), но эти лекарственные средства могут вызывать аллергические реакции и имеют нежелательное свойство, проявляющееся в онемении тканей при прикосновении и давлении. Местные анестетики могут быть использованы в случае крайней необходимости при боли, связанной с поверхностью глаз, особенно боли в роговице, но их продолжительное применение опасно, поскольку данный класс лекарственных средств подавляет рост эпителиальных клеток.

Нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НПВЛС), например, кеторолак, можно применять на поверхности глаз в течение короткого периода времени, например, для уменьшения острой боли при проведении хирургической операции по удалению катаракты, но не для продолжительного применения для глаз. Местные НПВЛС не действуют на боль, связанную с МНЭ аногенитальной области или полости рта.

Ментол имеет некоторое ограниченное обезболивающее действие в виде мази от дискомфорта при геморрое. В леденцах и кондитерских изделиях ментол оказывает положительное действие при раздраженном горле или при кашле. Ментол сильно раздражает глаза, но применяется в некоторых глазных каплях в Японии. На ороговевшую кожу ментол может быть нанесен в высокой концентрации (например, более 2% по массе) без непосредственного раздражения кожи. Например, местные пластыри, содержащие 5% ментола по массе (например, медицинский пластырь IcyHot; Chattem, Inc.), могут быть нанесены на кожу тела для уменьшения мышечной боли. Однако для неороговевающего эпителия раздражающее действие ментола ограничивает его применение; например, пастилки, содержащие более 8 мг ментола на штуку, имеют неприятный вкус.

Существует потребность в новом классе фармакологических агентов, которые могут подавлять сенсорный дискомфорт, возникающий из-за МНЭ, но не вызывать проблемы, связанные с раздражением и токсичностью.

Уотсон с соавторами (Watson et al.), 1978 г., описывает ряд соединений, обладающих физиологическим охлаждающим действием на ороговевающий эпителий, такой как эпителий кожи и языка. Описанные исследования составляют уровень техники для обнаружения других соединений с более селективным действием на МНЭ.

Уотсон с соавторами, 1979 г., описывает «N-замещенные карбоксамиды пара-ментана» следующей формулы. Среди примеров в данной работе представлены соединения, в которых R′ представляет собой -H и R′′ представляет собой -CH₂C(=O)OCH₃, -CH₂C(=O)OCH₂CH₃ или -CH₂C(=O)OCH₂CH₂CH₃. Соответствующее соединение, в котором R′′ представляет собой -CH₂C(=O)OCH(CH₃)₂ не представлено.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один из аспектов настоящего изобретения относится к соединению ИПЭ согласно настоящему описанию.

Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей соединение ИПЭ согласно настоящему описанию.

Другой аспект настоящего изобретения относится к соединению ИПЭ согласно настоящему описанию для лечения организма человека или животного посредством терапии.

Другой аспект настоящего изобретения относится к соединению ИПЭ согласно настоящему описанию для лечения сенсорного дискомфорта у человека согласно настоящему описанию.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения сенсорного дискомфорта у человека согласно настоящему описанию, включающему введение терапевтически эффективного количества соединения ИПЭ согласно настоящему описанию.

Другой аспект настоящего изобретения относится применению соединения ИПЭ согласно настоящему описанию для получения лекарственного средства для лечения сенсорного дискомфорта у человека согласно настоящему описанию.

Как очевидно специалисту в данной области, признаки и предпочтительные варианты одного аспекта изобретения также относятся и к другим аспектам настоящего изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соединения

Автором настоящего изобретения было обнаружено, что некоторые соединения неожиданно являются эффективными охлаждающими агентами для ткани многослойного неороговевающего эпителия (МНЭ). Данные соединения обеспечивают сильное, долговременное и селективное охлаждение для тканей неороговевающего эпителия по сравнению с тканями ороговевающего эпителия.

В настоящем описании такие соединения собирательно обозначены как "соединения изопропиловых эфиров" или "соединения ИПЭ" и представляют собой:

изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты ("Gly-O-iPr"), и

изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-метиламино]-уксусной кислоты ("N-Gly-O-iPr");

и их фармацевтически приемлемые соли, гидраты и сольваты.

Таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения предложено соединение, представляющее собой:

изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты ("Gly-O-iPr"), или

изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-метиламино]-уксусной кислоты ("N-Gly-O-iPr");

или их фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват.

Соединения Gly-O-iPr и N-Gly-O-iPr представлены в следующей таблице.

Обозначение	Химическое название	Химическая структура
Gly-O-iPr	изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты
W-Gly-O-iPr	изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-метиламино]-уксусной кислоты

Эти соединения по структуре являются родственными (-)-ментолу и имеют те же хиральные центры в той же конфигурации, что и в (-)-ментоле.

Название	Химическое название	Химическая структура
(-)-ментол	(1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанол

С позиции структуры указанные соединения могут быть традиционно описаны как изопропиловый эфир, образованный с глицином глицинового амида и N-метил-глицинового амида, соответственно, карбоновой кислоты, соответствующей (-)-ментолу.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложенное соединение представляет собой изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложенное соединение представляет собой изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложенное соединение представляет собой изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты.

Химический синтез

Согласно одной из методик, алкиловые эфиры, образованные с глицином глицинового амида карбоновой кислоты, соответствующей (-)-ментолу, могут быть получены в результате реакции галогенангидрида (например, хлорангидрида) карбоновой кислоты, соответствующей (-)-ментолу, с соответствующим алкиловым эфиром глицина, например, как показано ниже.

Схема 1

Многие алкиловые эфиры глицина (включая метиловый и этиловый эфиры глицина) доступны в продаже, например, в компании Sigma-Aldrich. Другие алкиловые эфиры глицина могут быть получены специалистами с применением известных и/или традиционных методов.

Например, соединение в виде этилового эфира (в котором R представляет собой Et), обозначенное в настоящем описании как Gly-O-Et, было получено следующим образом: 1,0 г гидрохлорида этилового эфира глицина (Sigma-Aldrich) растворяли в 28 мл диэтилового эфира и 1 мл дважды дистиллированной воды и охлаждали до 0°C. Добавляли щепотку диаминопиримидина в качестве катализатора. По каплям добавляли 1,62 мл п-ментолилхлорида, после чего добавляли 2 мл триэтиламина. В смеси, перемешиваемой в течение ночи при комнатной температуре, появлялись комки белого осадка. Осадок собирали, растворяли в этилацетате, промывали дважды дистиллированной водой и сушили над сульфатом натрия. Далее органическую фазу выпаривали при пониженном давлении с получением конечного продукта (2 г), который кристаллизовали при комнатной температуре. При анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) был выявлен одиночный пик, соответствующий более 95% целевого вещества. Для подтверждения идентичности использовали методы масс-спектрометрии (МС) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Изопропильное соединение (в котором R представляет собой iPr), обозначенное в настоящем описании как Gly-O-iPr, было получено компанией Phoenix Pharmaceuticals, Бурлингейм, Калифорния (www.phoenixpeptide.com): партия №427497; C₁₆H₂₉NO₃; молекулярная масса 283,41; чистота ≥95% по массе; внешний вид: белый кристаллический порошок. Дополнительные соединения были получены компанией ООО «ДИАФАРМ» (Diapharm Ltd.), Санкт-Петербург, Россия.

Были получены следующие соединения.

#	Обозначение	Химическое название	Химическая структура
1	Gly-O-Me	метиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты
2	Gly-O-Et	этиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты
3	Gly-O-nPr	н-пропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты
4	Gly-O-iPr	изопропиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты
5	Gly-O-nBu	н-бутиловый эфир [((1R,2S,5R)-2-изопропил-5-метилциклогексанкарбонил)-амино]-уксусной кислоты

Биологическая оценка

Химические соединения, которые вызывают температурные ощущения охлаждения, обладают несколькими свойствами, которые можно наблюдать при проведении исследований соединений на людях. Во-первых, это само ощущение, например, у субъекта можно спросить, ощущает ли он умеренную прохладу, прохладу или холод. Во-вторых, существует интенсивность ощущения, например, у субъекта можно спросить: ощущает ли он освежающую прохладу, сильную прохладу, интенсивный холод или обжигающий холод. В-третьих, существует продолжительность действия; у субъекта можно спросить: как долго продолжается действие. Продолжительность действия обычно определяется началом и окончанием ощущения и обычно составляет несколько минут или несколько часов. В-четвертых, существует активность; активность конкретного исследуемого соединения по обеспечению охлаждения обычно выражают с использованием применяемой концентрации (например, % по массе, мг/мл и т.п.) или дозы (например, мг на единицу массы тела).

Биологическое исследование на многослойном ороговевающем эпителии: исследование на губном желобке

Губной желобок представляет собой канавку на срединной линии выше границы верхней губы. Местом исследования действия лекарственного средства была кожа над верхней губой (над красной каймой губ), на губном желобке, сбоку от губного желобка до носогубных складок и иногда на нижней ноздре (в точке соединения носовой перегородки и верхней губы). Известно, что эта часть лица густо иннервирована рецепторами прохлады/холода, вторые находятся только на поверхностях глазного яблока и аногенитальной области. Также из научной литературы известно, что область около губ имеет высокую плотность «холодных точек» (см., например, Дакка с соавторами (Dhaka et al.), 2008).

Для определения антиноцицептивной активности исследуемое соединение сначала растворяли (5 мг/мл) в мази (Аквафор (Aquaphor®), которая содержала 41% петролатума, а остальное - минеральное масло, церезин и ланолиновый спирт) и однократно наносили (от 40 до 70 мг) на поверхность кожи губного желобка при помощи пластиковой палочки. На данном участке ощущения прохлады и холода на коже могут быть почувствованы и оценены по времени начала действия и интенсивности. Интенсивности субъективного ощущения дают оценки 0, 1, 2 или 3, где 0 - отсутствие изменений; 1 - легкая прохлада или холод; 2 - четкий сигнал о прохладе или холоде и 3 - сильная прохлада или холод. Интервалы для записи оценок составляли 5 и 10 минут, и запись продолжали до тех пор, пока не было получено два отчетливых нуля. За время начала действия лекарственного средства принимают время достижения 2 единиц интенсивности охлаждения, а время прекращения действия лекарственного средства представляет собой время, когда после достижения оценки выше 2 единиц интенсивность охлаждения падает ниже 2 единиц.

Продолжительность охлаждающего действия определяют как время прекращения действия минус время начала действия. Неактивным соединением считают соединение, оценка которого не превышает 2 единиц охлаждения в течение 5 минут при любом времени после нанесения.

Уотсоном с соавторами, 1979, описано исследование свойств N-замещенных карбоксамидов п-ментана на добровольцах, которым прикладывали фильтровальную бумагу (1×1 см), пропитанную известным количеством исследуемого соединения, на дорсальную поверхность языка. Через 30 секунд субъекта просили сообщить о наличии или отсутствии охлаждающего действия. Эти данные отмечали как «Порог, мкг» и считали пороговым количеством исследуемого соединения, которое вызывает охлаждающие ощущения при нанесении на язык у людей из группы волонтером. Средний порог для (-)-ментола для 6 субъектов составил 0,25 мкг, однако было 100-кратное различие в индивидуальной чувствительности. Дорсальная поверхность языка ороговевшая (кератинизированная). Кератин представляет собой компонент пальцеобразных выступов, называемых сосочками, которые отвечают за вкусовые ощущения. Сигналы об охлаждении, определенные с применением метода, описанного Уотсоном с соавторами, 1979, может не отражать действие лекарственных средств на МНЭ.

Биологическое исследование на многослойном неороговевающем эпителии: исследование на поверхности глаз

Для проведения исследования на поверхности глаз в качестве средства доставки использовали влажную салфетку, содержащую исследуемое соединение. Исследуемое соединение растворяли сначала в абсолютном этаноле, а затем в дистиллированной воде с получением стандартного раствора с концентрацией 1 мг/мл в растворе этанола в воде с концентрацией от 3 до 5% по массе. Далее три мл исследуемого соединения добавляли на прямоугольник (50 мм × 60 мм) из хлопка массой 0,4 г (CS-being, Daisan Cotton, Япония) и отдельно герметично упаковывали с использованием вакуумного устройства (Foodsaver®, Jarden Corp.). Образцы хранили в морозильнике или в холодильники и перед применением их температуру доводили до комнатной. При протирании хлопковым тампоном на закрытые веки доставляется от 40 до 45 мкл жидкой композиции (~20-22 мкл на поверхность одного глаза). Таким образом, если концентрация исследуемого соединения составляла мг/мл, доза, доставляемая на оба глаза, составляла ~40-42 мкг или ~20 мкг на один глаз. Наличие или отсутствие ощущений прохлады на поверхности глаз отмечали по наличию или отсутствию в интервалы от 5 до 10 минут до тех пор пока отсутствие охлаждения не было отмечено в двух соответствующих исследуемых интервалах. Записывали только период охлаждения поверхности глаз без попыток количественной оценки интенсивности ощущений.

Биологическое исследование на многослойном неороговевающем эпителии: исследование на поверхности ротоглотки

Количество раздражителей оценивали по вызыванию ощущения кашля как меры чувствительности глотки (см., например, Морис с соавторами (Morice et al.), 2001). Обычно лимонную кислоту или капсаицин вводят добровольцам путем ингаляций и подсчитывают, сколько раз они кашляли. Автором настоящего изобретения было обнаружено, что ощущения в нижней части глотки, связанные с желанием откашляться, могут быть воспроизведены путем размещения (при помощи шприца или пластмассовой палочки) от 0,2 до 0,25 мл соуса из перца чили на заднюю часть дорсальной поверхности языка. Соус из перца чили смешивается со слюной, и слюна затем остается на задней части ротоглотки. В качестве соуса из перца чили использовали соус из перца чили Yank Sing® (YS Gourmet Productions, Inc., PO Box 26189, Сан-Франциско, CA 94126), который является хорошо известной приправой для использования с дим-сам (китайская закуска к чаю). Ощущения, связанные с соусом из перца чили, исходят с задней стенки полости рта, эти ощущения четко распознаются субъектом, на котором проводят исследования, и связаны с желанием откашляться. Ощущения, вызванные соусом из перца чили, могут быть легко подавлены, если выпить холодную воду или использовать таблетку для рассасывания (ТДР), содержащую охлаждающий ингредиент, однако на них не влияют ТДР, содержащие только наполнитель.

Для приготовления ТДР брали ингредиент, растворяли его в абсолютном этаноле, а затем добавляли 10% по массе мальтита и 90% по массе маннита, а затем равный объем дистиллированной воды. Смесь перемешивали стеклянной палочкой и наносили на кусок вощеной бумаги одноразовой пластиковой пипеткой. Отдельные высушенные таблетки весили в среднем 150 мг каждая и при нахождении на дорсальной поверхности языка полностью растворяются в слюне и покрывают поверхность ротоглотки. В среднем, количество исследуемого соединения составляло от 2,5 до 3 мг на таблетку.

Для исследования антиноцицептивной активности ТДР, содержащую исследуемое соединение, сначала вводили на дорсальную поверхность языка, а через 45-50 минут вводили раздражитель в виде соуса из перца чили. В это время ощущения прохлады от исследуемого соединения исчезали, и задачей исследования было определить, сохраняется ли антиноцицептивное действие. Были отмечены следующие результаты: если не было ослабления действия раздражителя, то ставили (0), если было частичное подавление, то ставили (+), и если было полное ослабление сигнала раздражителя, ставили (++). В присутствии ТДР, содержащей активный ингредиент, дающий (++), раздражающие сигналы полностью отсутствовали, но можно было легко идентифицировать и почувствовать соленый вкус соевого соуса, используемого в приправе.

Исследование 1

Данные, полученные для многослойного ороговевающего эпителия и многослойного неороговевающего эпителия (МНЭ) приведены в следующей таблице.

#	Обозначение	Многослойный ороговевающий эпителий	Многослойный неороговевающий эпителий (МНЭ)
Кожа губного желобка (мин)(1)	Поверхность глаз (мин)(2)	Поверхность ротоглотки(3)
1	Gly-O-Me	10	5	0
2	Gly-O-Et	24	15	0
3	Gly-O-nPr	42	54	0
4	Gly-O-iPr	27	300	++
5	Gly-O-nBu	38	35	0
(1) наносили на кожу губного желобка в дозе 5 мг/мл в виде масла Aquaphor®.
(2) наносили на закрытые веки с использованием влажной салфетки с 1 мг/мл в 5%-95% об./об. растворе этанол-дистиллированная вода.
(3) наносили на дорсальную поверхность в конце языка в виде ТДР, содержащей от 2,5 до 3 мг активного ингредиента, а через 45 минут на указанную поверхность языка наносили соус из перца чили и записывали субъективные ощущения. Если был отмечен ответ (++), раздражающие свойства соуса из перца чили больше не обнаруживались.

Продолжительность действия Gly-O-iPr на ороговевающем эпителии одна из самых коротких и, напротив, на неороговевающем эпителии Gly-O-iPr имеет наибольшую продолжительность действия. Самое продолжительное действие Gly-O-iPr на поверхности глаз было как удивительным, так и неожиданным. Охлаждающее действие длилось в среднем 5 часов. Повышение исследуемой концентрации Gly-O-iPr с 1 мг/мл до 1,5 мг/мл дополнительно увеличило продолжительность действия на поверхности глаз до 6,5 часов. Для сравнения, если концентрацию Gly-O-Et увеличивали с 1 мг/мл до 2 мг/мл или даже до 5 мг/мл, интенсивность ощущения охлаждения увеличивалась, но продолжительность увеличивалась только на 15-22 минуты, соответственно. Селективное действие Gly-O-iPr на неороговевающих поверхностях глаз является следствием различий в типе фармакологической активности и зависит не только от введенной дозы.

Шесть субъектов согласились испытать на себе салфетки для глаз с Gly-O-Et, Gly-O-iPr и Gly-O-nPr в рандомизированном двойном слепом исследовании с тремя испытаниями для каждой салфетки. Результаты были однозначными и демонстрировали продолжительность действия, при которой Gly-O-iPr>>Gly-O-nPr>Gly-O-Et.

На поверхности ротоглотки и Gly-O-iPr, и Gly-O-Et вызывали ощущение освежающей прохлады. Однако, Gly-O-iPr вызывал более долгое и продолжительное освежающее «чувство» в полости рта, которое не ощущалось ни при использовании Gly-O-Et, ни при использовании Gly-O-nPr, и которое блокировало ответ на соус из перца чили. В тех же условиях проведения исследования Gly-O-Et и Gly-O-nPr не были эффективными.

Таким образом, Gly-O-iPr обладает удивительными и неожиданными свойствами, которые отличаются от свойств Gly-O-Me, Gly-O-Et, Gly-O-nPr и Gly-O-nBu.

Исследование 2

Тест Эймса (назван в честь профессора Б.Н. Эймса (B.N. Ames) из Калифорнийского университета в Беркли) представляет собой анализ, проводимый на бактериях, для определения мутагенного потенциала исследуемого соединения. Если тест дает положительный результат, исследуемое соединение может взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами и представлять опасность для генетического материала. Тест Эймса является стандартным инструментом для оценки безопасности.

В паспорте безопасности вещества для Gly-O-Et (MSDS номер 2984, 09 ноября 2005 г., SCM Europe SA/NV, 141 Rue St. Lambert Suite 2, B-1200, Брюссель, Бельгия) в категории «мутагенность» указано, что «В тесте Эймса для [Gly-O-Et] был получен результат «слабая мутагенность» в отношении штамма ТА1535 в условиях проведения теста. Ответы были малыми и демонстрировали степень воспроизводимости».

Оценка Gly-O-iPr на мутагенную активность в отношении тест-штамма Salmonella typhimurium ТА1535 (тест Эймса для данного штамма) была проведена в компании Notox, BV, Hambakenwetering, РО Box 34763, Хертогенбош, Нидерланды (исследовательская организация, специализирующаяся на оценке безопасности и тестировании, проводившая исследования по контракту). Gly-O-iPr исследовали на ТА1535 в присутствии или отсутствии смеси S9-mix (S9-mix из печени крыс, индуцированная комбинацией фенобарбитала и β-нафтофлавона). Gly-O-iPr предоставляли в виде белого кристаллического порошка, синтезированного в компании Phoenix Pharmaceuticals, Inc. (Бурлингейм, Калифорния) с чистотой ≥95% по массе, и растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО).

Gly-O-iPr исследовали в концентрациях от 3 до 5000 мкг/чашку при 8 дозировках. Gly-O-iPr не осаждался на чашках в наивысшей дозе, составляющей 5000 мкг/чашку. Бактериальный фон не снижался ни при одной из исследуемых концентраций, и биологически значимого уменьшения количества ревертантов не наблюдалось.

Gly-O-iPr не вызывал дозозависимого увеличения количества ревертантных (His⁺) колоний ТА1535 в отсутствии или присутствии S9-метаболической активации. В данном исследовании значения для отрицательного контроля и штаммспецифичного положительного контроля (индуцированного азидом натрия или 2-аминоантраценом) были в пределах диапазонов, которые получали в данной лаборатории ранее, что говорит о том, что условия проведения исследований были адекватными и что система метаболической активации работала должным образом. На основании результатов данного исследования можно сделать вывод, что Gly-O-iPr не является мутагенным в отношении тест-штамма Salmonella typhimurium ТА1535.

Таким образом, Gly-O-iPr не имеет токсикологических свойств, присущих Gly-O-Et. Данный результат был удивительным и неожиданным, поскольку структуры данных двух соединений очень близки.

Исследование 3

Ученый в лаборатории страдал от сезонного аллергического конъюнктивита. Это состояния сильно усугублялось, когда он начинал проводить эксперименты на лабораторных животных (крысах и мышах), и он стал чувствительным к соответствующим аллергенам. Конъюнктивит не может быть облегчен путем пероральных или местных глазных капель, содержащих антигистаминные лекарственные средства, также у указанного субъекта не было желания рассматривать вопрос о применении противовоспалительных стероидных мазей. При осмотре его глаза были налитыми кровью и водянистыми, и он продолжал тереть веки пальцами, даже зная, что данное действие может в дальнейшем усилить его зуд и дискомфорт. Он вызвался попробовать салфетки для глаз, содержащие 1,0 мг/мл Gly-O-iPr. Облегчение зуда и дискомфорта было достигнуто в течение 5 минут и продолжалось по меньшей мере несколько часов.

Субъект использовал салфетки по мере необходимости в течение трех дней и был удивлен, увидев, что все его зуд и покраснение были значительно уменьшены.

Исследование 4

Дочь 52-летнего мужчины переехала из своего района, чтобы пойти в колледж, и ему надо было ухаживать за двумя ее кошками. Сначала все было в порядке, но потом, он стал чувствительным к пыли из ящика для мусора, которая образовывалась, когда он убирал за кошками. У него развилась сухость, першение в горле и кашель и это состояние сильно усугублялось его сезонной аллергией на пыльцу растений, поэтому он постоянно прочищал горло. Стандартные неседативные антигистамины не облегчали его раздражение в верхних дыхательных путях. Примерно через две недели кашля и дискомфорта он согласился попробовать Gly-O-iPr, сначала нанесенный по 3 мг на пластины жевательной резинки Wrigley spearmint, а затем в виде таблетки для рассасывания, содержащей 3 мг на единичную дозу. И лекарственная жевательная резинка, и ТДР обеспечивали облегчение через пять минут после введения. Чувство дискомфорта в горле ослаблялось, действие продолжалось в течение примерно пяти часов и дозирование может быть повторено с тем же положительным результатом. Данный человек предпочел способ доставки в виде ТДР, поскольку он счел его более эффективным, чем жевательная резинка. После применения по мере необходимости ДТР, содержащих Gly-O-iPr, в течение десяти дней кашель и першение в горле у субъекта прошли и сейчас он чувствует себя хорошо.

Исследование 5

60-летний венчурный капиталист жил напряженной жизнью и выкуривал по две пачки сигарет в день. У него был кашель курильщика, и, как он сообщил, диагноз его врача был таков, что он находился на грани хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Он попробовал ТДР, содержащую 2,5 мг Gly-O-iPr, и сказал, что чувствовал себя хорошо, но боялся, что при ее использовании он стал бы больше курить. Вечером того же дня он пошел на банкет с Северно-Китайской кухней и начал кашлять, когда ел кусок рыбы, которая была сильно приправлена перцем чили. Все за столом были встревожены его кашлем, который был довольно интенсивным и из-за которого его лицо стало ярко красным. Он сразу же принял две ТДР, содержащие Gly-O-iPr, и, ко всеобщему удивлению, кашель прекратился в течение нескольких минут.

Исследование 6

У 66-летнего мужчины за последние десять лет развилась приобретенная астма, которая усугублялась сезонной аллергией на пыльцу деревьев. Он лечился с применением ингалятора с бронхолитическим средством и средства Singulair®, а также антигистаминных препаратов и стероидов в виде ингаляций на периодической основе. Мужчина часто кашлял и жаловался на сдавленность и дискомфорт в области груди вокруг грудины. Он согласился попробовать ТДР, содержащую 3 мг Gly-O-iPr совместно с 12 мг ицилина, приговленные в виде таблетки 180 мг с маннитом в качестве вспомогательного вещества. После приема первой ТДР, содержащей Gly-O-iPr/ицилин, он чувствовал себя гораздо лучше в течение первых 15 минут, но повторная доза обеспечила облегчение дискомфорта в горле и дыхательных путях, которое продолжалось 10 часов. Мужчина чувствовал, что может двигаться гораздо легче и с меньшим дискомфортом. Он продолжал принимать ТДР, содержащие Gly-O-iPr/ицили