Антитело к противоопухолевому антигену и способы применения
Патент 2598711
Авторы
Правообладатели
Классы МПК
Антитело к противоопухолевому антигену и способы применения
Иллюстрации
Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, которое связывается с ассоциированным с опухолью антигеном EphA2. Изобретение может быть использовано для терапии, диагностики и скрининга раковых заболеваний. 4 н.п. ф-лы, 83 ил., 7 табл., 7 пр.
Реферат
Перекрестная ссылка
Эта заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США №61/366823, поданной 22 июля 2010, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
Заявление о том, что исследование финансировалось из федерального бюджета
Это изобретение было сделано при правительственной поддержке по гранту № СА058207, присужденного Национальным институтом здоровья. Правительство имеет бесспорные права на изобретение.
Введение
Расширенные исследования транскрипционных паттернов рака привели к открытию молекулярных мишеней для различения злокачественного новообразования с самого начала и самых агрессивных раков от тех, которые являются менее агрессивными. Раки часто сверхэрепрессируют множество белков, включая определенные антигены клеточной поверхности, например, рецепторы клеточной поверхности. Антитела, которые связываются с такими сверхэкспрессируемыми антигенами клеточной поверхности, могут способствовать выявлению и лечению таких раков. Для производства антител к поверхностным рецепторам раковых клеток применяется множество подходов, которые можно использовать как потенциально терапевтические. Идентификация сверхэкспрессируемых рецепторов клеточной поверхности и антител, которые связываются с ними, представляет путь для разработки раковой терапии, особенно для подтипов рака с плохим прогнозом и устойчивостью к традиционной терапии. CD44 и EphA2 представляют собой два сверхэкспрессируемых рецептора клеточной поверхности, и по транскрипционному профилированию и протеомному анализу известно, что они сверхэкспрессируются при базальных раках молочной железы.
Антитела, специфические к рецепторам клеточной поверхности, сверхэкспрессируемых при множестве раков, используются для разработки целевой иммунотерапии. Например, HER2, CD20 и EGFR сверхэкспрессируются во множестве опухолей и антитела, распознающие эти рецепторы, разработаны для лечения метастатического рака молочной железы (трастузамаб), лимфомы (ритуксимаб) и колоректального рака (цетуксимаб). Несколько терапевтических подходов, включая конъюгаты антитело-лекарство, иммунотоксины и целевую доставку нуклеиновых кислот, требуют антител, которые не только связываются с рецептором, но также интернализируются клеткой после связывания.
Сущность изобретения
В настоящей заявке раскрыты антитела, которые связываются с ассоциированным с опухолью антигеном CD44 или с ассоциированным с опухолью антигеном EphA2, а также соответствующие композиции и способы, где они используются. Способы применения включают в себя методы терапии, диагностики и скрининга рака. В определенных вариантах воплощения изобретения антитела связывают антиген клеточной поверхности млекопитающего (например, антиген клеточной поверхности млекопитающего, представленный на дрожжах), в других они подвергаются эндоцитозу после связывания с клетками млекопитающего.
В одном воплощении изобретения предоставляется изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом CD44, который специфически связывается с антителом F2-1A6, или конкурирует с антителом F2-1A6 за связывание с CD44. Упомянутое антитело может эндоцитироваться (клеткой), когда связывается с CD44 на поверхности живой клетки млекопитающего. В одном варианте воплощения упомянутое антитело содержит VH CDR1 из F2-1A6, VH CDR2 из F2-1A6 и VH CDR3 из F2-1A6. В другом воплощении изобретения, упомянутое антитело содержит VL CDR1 из F2-1A6, VL CDR2 из F2-1A6 и VL CDR3 из F2-1A6. В еще одном воплощении изобретения упомянутое антитело конкурирует за связывание с эпитопом CD44 с антителом, содержащим полноразмерный VH из F2-1A6 и полноразмерный VL из F2-1A6.
В другом воплощении изобретения предоставляется изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом CD44, который специфически связывается с антителом F2-1H9, или конкурирует с антителом F2-1H9 за связывание с CD44. Упомянутое антитело может эндоцитироваться (клеткой), когда связывается с CD44 на поверхности живой клетки млекопитающего. В одном варианте воплощения упомянутое антитело содержит VH CDR1 из F2-1H9, VH CDR2 из F2-1H9 и VH CDR3 из F2-1H9. В другом варианте воплощения изобретения упомянутое антитело содержит VL CDR1 из F2-1H9, VL CDR2 из F2-1H9 и VL CDR3 из F2-1H9. В еще одном варианте воплощения изобретения упомянутое антитело содержит полноразмерный VH из F2-1H9 и полноразмерный VL из F2-1H9.
В другом варианте воплощения изобретения предоставляется изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом CD44, который специфически связывается с антителом, выбранным из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 и НН3; или конкурирует с антителом, выбранным из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 и НН3 за связывание с CD44. В одном варианте воплощения, упомянутое антитело содержит: VH CDR1 из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 или НН3; VH CDR2 из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 или НН3; и VH CDR3 из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 или НН3. В другом варианте воплощения изобретения упомянутое антитело содержит: VL CDR1 из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 или НН3; VL CDR2 из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 или НН3; и VL CDR3 из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 или НН3. В другом варианте воплощения изобретения упомянутое антитело содержит: полноразмерный VH из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 или НН3; и полноразмерный VL из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 или НН3.
В другом варианте воплощения изобретения предоставляется изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом EphA2, который специфически связывается антителом 2D6, или конкурирует с антителом 2D6 за связывание с EphA2. Упомянутое антитело может эндоцитироваться, когда связывается с EphA2 на поверхности живой клетки млекопитающего.
В другом варианте воплощения изобретения предоставляется изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом EphA2, который специфически связывается антителом D2-1A7, или конкурирует с антителом D2-1А7 за связывание с EphA2. Упомянутое антитело может эндоцитироваться, когда связывается с EphA2 на поверхности живой клетки млекопитающего.
В другом варианте воплощения изобретения предоставляется изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом EphA2, который специфически связывается с антителом D2-1A9, или которое конкурирует с антителом D2-1A9 за связывание с EphA2. Упомянутое антитело может эндоцитироваться, когда связывается с EphA2 на поверхности живой клетки млекопитающего.
В другом аспекте изобретения предоставляется изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом EphA2, который специфически связывается с антителом D2-1B1, или которое конкурирует с антителом D2-1B1 за связывание с EphA2. Упомянутое антитело может эндоцитироваться, когда связывается с EphA2 на поверхности живой клетки млекопитающего.
В другом варианте воплощения изобретения предоставляется изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом EphA2, который специфически связывается с антителом, выбранным из А3Н9, A3G3, A3D10, A3D1, А3С8, 1А3, 1А5, 1А8, 1А12, 1В2, 1С2, 1С7, 1D8 и 15Н11, или которое конкурирует с антителом, выбранным из А3Н9, A3G3, A3D10, A3D1, А3С8, 1А3, 1А5, 1А8, 1А12, 1В2, 1С2, 1С7, 1D8 и 15Н11, за связывание с EphA2. В одном варианте воплощения изобретения упомянутое антитело содержит: VH CDR1 из А3Н9, A3G3, A3D10, A3D1, A3C8, 1А3, 1А5, 1А8, 1А12, 1В2, 1С2, 1С7, 1D8 или 15Н11; VH CDR2 из А3Н9, A3G3, A3D10, A3D1, A3C8, 1А3, 1А5, 1А8, 1А12, 1В2, 1С2, 1С7, 1D8 или 15Н11; и VH CDR3 из А3Н9, A3G3, A3D10, A3D1, A3C8, 1А3, 1А5, 1А8, 1А12, 1В2, 1С2, 1С7, 1D8 или 15Н11. В другом варианте воплощения изобретения упомянутое антитело содержит: VL CDR1 из А3Н9, A3G3, A3D10, A3D1, A3C8, 1А3, 1А5, 1А8, 1А12, 1В2, 1С2, 1С7, 1D8 или 15Н11; VL CDR2 из А3Н9, A3G3, A3D10, A3D1, A3C8, 1А3, 1А5, 1А8, 1А12, 1В2, 1С2, 1С7, 1D8 или 15Н11; и VL CDR3 из А3Н9, A3G3, A3D10, A3D1, A3C8, 1А3, 1А5, 1А8, 1А12, 1В2, 1С2, 1С7, 1D8 или 15Н11.
В определенных вариантах воплощений изобретения любое из вышеупомянутых моноклональных антител представляет собой одноцепочечный Fv (scFv), IgG, Fab, (Fab')2 или (scFv')2. Любое из упомянутых антител может быть помечено и/или конъюгировано со средством против рака.
В одном варианте воплощения изобретения предоставляется липидная наночастица, содержащая внешнюю поверхность и внутреннее пространство, упомянутое внутреннее пространство содержит средство против рака, при этом любое одно или более из вышеупомянутых изолированных антител присоединено к поверхности упомянутой липидной наночастицы. В одном варианте воплощения изобретения, когда липидная наночастица контактирует с экспрессирующимся на клеточной поверхности EphA2 или CD44 на клеточной поверхности, упомянутое антитело связывается с EphA2 на клеточной поверхности или CD44 на клеточной поверхности и липидная наночастица эндоцитируется.
В одном варианте воплощения изобретения предоставляется композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и любое из вышеупомянутых антител или любую из вышеупомянутых липидных наночастиц. Упомянутая композиция может быть разработана для парентерального введения. Альтернативно, упомянутая композиция может быть разработана для внутривенного, интратекального или внутрижелудочкового введения или для конвекционной доставки. В одном варианте воплощения изобретения предоставляется набор, содержащий композицию.
В другом варианте воплощении изобретения предоставляется способ лечения пациента, имеющего рак, упомянутый способ, содержащий введение упомянутому пациенту некоего количества любого из вышеупомянутых антител или любой из вышеупомянутых липидных наночастиц, отличающийся тем, что упомянутое количество является достаточным для замедления роста рака. В одном варианте воплощения изобретения упомянутое антитело интернализируется раковой клеткой.
В одном варианте воплощения изобретения предоставляется способ детекции раковых клеток у пациента, включающий в себя контакт любого одного из вышеупомянутых антител с клеткой упомянутого пациента, которая подозревается как раковая, и детекцию упомянутого антитела, связавшегося с клеткой.
В другом варианте воплощения изобретения предоставляется изолированная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность из: VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела из клона F2-1A6; VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела из клона F2-1A6; VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела из клона F2-1H9; VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела из клона F2-1H9; VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела, выбранного из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 и HH3; или VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела, выбранного из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 и HH3. В одном варианте воплощения изобретения упомянутая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность из: VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела из клона F2-1A6 и VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела из клона F2-1A6; VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела из клона F2-1H9 и VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела из клона F2-1H9; или VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела, выбранного из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 и HH3 и VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела, выбранного из Е8Н11, Е8Н7, E8G12, E8F11, Е8С9, D6G9, D6D3, D1C5, D1D1, НВ8, НС2, НС4, НЕ3, HF1 и HH3.
В другом варианте воплощения изобретения предоставляется изолированная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность из: VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела из клона 2D6, VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела из клона 2D6, VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела из клона D2-1A7, VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела из клона D2-1A7.VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела из клона D2-1A9, VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела из клона D2-1A9, VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела из клона D2-1B1, VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела из клона D2-1B1; VH, содержащего VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 антитела, выбранного из А3Н9, A3G3, A3D10, A3D1, A3C8, 1А3, 1А5, 1А8, 1А12, 1В2, 1С2, 1С7, 1D8 и 15Н11; VL, содержащего VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 антитела, выбранного из А3Н9, A3G3, A3D10, A3D1, A3C8, 1А3, 1А5, 1А8, 1А12, 1В2, 1С2, 1С7, 1D8 и 15Н11; или изолированная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность из 1) и 2); 3) и 4); 5) и 6); 7) и 8); или 9) и 10).
В одном варианте воплощения изобретения предоставляется вектор экспрессии, который содержит любую из вышеупомянутых нуклеиновых кислот. В другом варианте воплощения изобретения предоставляется рекомбинантная клетка-хозяин ("генетически модифицированная клетка-хозяин"), содержащая упомянутый вектор. В одном варианте воплощения изобретения клетка экспрессирует анти-EphA2 антитело или анти-CD44 антитело.
Краткое описание фигур
Фигура 1. Дисплей (представление) антигенных доменов на поверхности дрожжей. Панель А, внеклеточный домен (ECD) рецептора EphA2 был представлен на поверхности дрожжей и распознан посредством анти-EphA2 антитела и рекомбинантным мышиным Эфрином A1 (R&D, Minneapolis), как определено путем анализа проточной цитометрии. Панель В, линкерный домен CD44 (домен 1 или D1) был представлен на поверхности дрожжей и распознан посредством анти-CD44 кроличьего моноклонального антитела, как определено путем анализа проточной цитометрии. Как анти-EphA2, так и анти-CD44 антитела не распознавали нерелевантный белок, представленный на поверхности дрожжей.
Фигура 2. Восстановление фаговых антител из представленных на дрожжах антигенов. Панель А, сравнение восстановления фагового антитела, известного связыванием с EphA2 (2D6) с дрожжей, на которых представлен EphA2 ECD (Y-EphA2) по сравнению с дрожжами, на которых представлен нерелевантный белок (Y-CON). Анти-EphA2 фаговые антитела 2D6 общим числом 1011 инкубировались с каждым из представленных на дрожжах антигенов. Панель В, влияние элюирующего буфера на титр EphA2 фагового антитела, элюированного с поверхности дрожжей, на которых представлен EphA2 ECD. Анти-EphA2 фаговые антитела 2D6 общим числом 1011 инкубировались с каждым из представленных на дрожжах антигенных белков перед элюированием. Панель С, влияние введенного фагового титра на элюированный фаговый титр. Указанный титр анти-EphA2 фагового антитела 2D6 инкубировался с дрожжами, на которых представлен EphA2 ECD или нерелевантный белок, и определялся титр элюированного фага.
Фигура 3. Стратегия селекции интернализирующихся антиген-специфических фаговых антител. Панель А, после двух циклов селекции на интернализацию на клеточной линии базального рака молочной железы MDAMB231, пул фаговых антител вначале инкубировался с нерелевантными контрольными дрожжами для удаления любых связавшихся с дрожжами антител, после чего следовал пэннинг дрожжей, представляющих или EphA2 ECD, или CD44 домен 1. Панель В, сигнал связывания пула поликлональных фаговых антител к EphA2 ECD или CD44 домену 1 после 2 циклов пэннинга был подсчитан с использованием проточной цитометрии. Нерелевантные контрольные дрожжи окрашивались библиотекой неселектированных фаговых антител (R0), поликлональными фагами цикла 1 (R1) и цикла 2 (R2). Панель С, частота антиген-специфичных фаговых антител после одного и двух циклов селекции на антиген, представленный на дрожжах. Частота связывания определялась путем анализа 96 случайно отобранных фаговых антител на связывание с антигеном, представленным на дрожжах, путем проточной цитометрии. Индуцированные дрожжевые клетки, представляющие нерелевантный белок, EphA2-ECD или CD44 домен 1, были окрашены неселектированной фаговой библиотекой (R0) и поликлональными фагами из R1 и R2, соответственно. Неиндуцированные дрожжевые клетки (только дрожжи), нерелевантная фаговая библиотека (фаговый контроль) и библиотека неселектированных фаговых антител использовались как контроль.
Фигура 4. Специфичность связывания моноклинальных фаговых антител, полученных биопэннингом с дрожжевым антигеном. Панель А, связывание моноклональных фаговых антител с антигенными доменами, представленными на дрожжах, как определено посредством проточной цитометрии. Индуцированные дрожжевые клетки, представляющие нерелевантный белок (Y-CON), EphA2-ECD (Y-EphA2 BCD), CD44 линкерный домен (Y-CD44 ECD D1) и CD44 полноразмерный BCD (Y-CD44 ECD), окрашивались моноклональными фаговыми антителами, изолированными после Y-EphA2 и Y-CD44 D1 селекции. Панель В показывает связывание моноклональных фаговых антител с MDAMB231 клетками, как определено при помощи проточной цитометрии. Панель С показывает различное связывание моноклональных фаговых антител с клеточными линиями рака молочной железы, включая люминальные клеточные линии рака молочной железы SUM52PE и MCF7, и клеточную линию базального рака молочной железы MDAMB231.
Фигура 5. Характеризация scFv антител с помощью вестерн-блота и проточной цитометрии. Панель А, анти-EphA2 scFv 2D6 или D2-1A7 и анти-CD44 scFv F2-1A6 были использованы для иммунопреципитации являющихся их мишенями антигенов из клеток MDAMB231. Антиген определялся при помощи вестерн-блоттинга с использованием или анти-EphA2 антитела D7 (Upstate Biotech, Billerica), или анти-CD44 антитела Ab-4 (NeoMarkers, Fremont). Панель В, EphA2 антитела D2-1A7, D2-1A9 и 2D6 конкурируют с эфрином А1 за связывание с клетками MDAMB231. Способность фаговых антител D2-1A7, D2-1A9 и 2D6 связываться с клетками MDAMB231 в присутствии возрастающих концентраций EphA2 лиганда эфрина А1 определялась путем проточной цитометрии.
Фигура 6. Фаговые антитела, специфичные к EphA2 и CD44, эндоцитируются клетками MDAMB231. Культивируемые клетки инкубировались с нерелевантным фагом (панель А), анти-EphA2 фагом D2-1A7 (панель В) и D2-1A9 (панель С), анти-CD44 фагом F2-1A6 (панели D и Е) в течение 3 ч при 37°С, после чего промывались глицин буфером. Эндоцитоз определялся путем детекции внутриклеточного фага анти-fd антителом, и анализировался с помощью конфокальной микроскопии.
Фигура 7. Аминокислотные последовательности полноразмерных VH и VL антител, специфичных к CD44 из различных клонов. Также указаны каркас и участки, определяющие комплементарность. SEQ ID NOs относится к полноразмерному вариабельному участку.
Фигура 8. Аминокислотные последовательности полноразмерных VH и VL антител, специфичных к EphA2 из различных клонов. Также указаны каркас и участки, определяющие комплементарность. SEQ ID NOs относится к полноразмерному вариабельному участку.
Фигуры 9А и 9В. Аминокислотные последовательности и кодирующие последовательности нуклеиновых кислот для полноразмерных антител из клона 2D6.
Фигуры 10А и 10В. Аминокислотные последовательности и кодирующие последовательности нуклеиновых кислот для полноразмерных scFv антител из клона D2-1А7.
Фигуры 11А и 11В. Аминокислотные последовательности и кодирующие последовательности нуклеиновых кислот для полноразмерных scFv антител из клона D2-1А9.
Фигуры 12А и 12В. Аминокислотные последовательности и кодирующие последовательности нуклеиновых кислот для полноразмерных scFv антител из клона D2-1В1.
Фигуры 13А и 13В. Аминокислотные последовательности и кодирующие последовательности нуклеиновых кислот для полноразмерных scFv антител из клона F2-1А6.
Фигуры 14А и 14В. Аминокислотные последовательности и кодирующие последовательности нуклеиновых кислот для полноразмерных scFv антител из клона F2-1Н9.
Фигуры 15A и 15В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:90) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:91) для полноразмерных scFv антител из клона Е8Н11.
Фигуры 16А и 16В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:58) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:59) для полноразмерных scFv антител из клона Е8Н7.
Фигуры 17А и 17В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:92) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:93) для полноразмерных scFv антител из клона E8G12.
Фигуры 18А и 18В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:63) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:64) для полноразмерных scFv антител из клона E8F11.
Фигуры 19А и 19В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:72) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:73) для полноразмерных scFv антител из клона Е8С9.
Фигуры 20А и 20В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:85) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:86) для полноразмерных scFv антител из клона D6G9.
Фигуры 21А и 21В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:127) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:128) для полноразмерных scFv антител из клона D6D3.
Фигуры 22А и 22В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:129) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:130) для полноразмерных scFv антител из клона А3Н9.
Фигуры 23А и 23В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:135) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:136) для полноразмерных scFv антител из клона A3G3.
Фигуры 24А и 24В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:137) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:138) для полноразмерных scFv антител из клона A3D10.
Фигуры 25А и 25В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:305) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:306) для полноразмерных scFv антител из клона A3D1.
Фигуры 26А и 26В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:307) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:308) для полноразмерных scFv антител из клона A3C8.
Фигуры 27А и 27В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:309) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:310) для полноразмерных scFv антител из клона 1А3.
Фигуры 28А и 28В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:311) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:312) для полноразмерных scFv антител из клона 1А5.
Фигуры 29А и 29В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:313) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:314) для полноразмерных scFv антител из клона 1А8.
Фигуры 30А и 30В. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:315) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:316) для полноразмерных scFv антител из клона 1А12.
Фигуры 31А и 31В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:317) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:318) для полноразмерных scFv антител из клона 1В2.
Фигуры 32А и 32В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:319) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:320) для полноразмерных scFv антител из клона 1С2.
Фигуры 33А и 33В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:321) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:322) для полноразмерных scFv антител из клона 1С7.
Фигуры 34А и 34В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:323) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:324) для полноразмерных scFv антител из клона 1D8.
Фигуры 35А и 35В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:325) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:326) для полноразмерных scFv антител из клона 15Н11.
Фигуры 36А и 36В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:327) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:328) для полноразмерных scFv антител из клона D1C5.
Фигуры 37А и 37В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:329) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:330) для полноразмерных scFv антител из клона D1D1.
Фигуры 38А и 38В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:331) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:332) для полноразмерных scFv антител из клона HI В 8 (также обозначаемого в настоящей заявке как "НВ8").
Фигуры 39А и 39В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:333) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:334) для полноразмерных scFv антител из клона Н1С2 (также обозначаемого в настоящей заявке как "НС2").
Фигуры 40А и 40В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:335) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:336) для полноразмерных scFv антител из клона Н1С4 (также обозначаемого в настоящей заявке как "НС4").
Фигуры 41А и 41В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:337) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:338) для полноразмерных scFv антител из клона Н1Е3 (также обозначаемого в настоящей заявке как "НЕ3").
Фигуры 42А и 42В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:339) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:340) для полноразмерных scFv антител из клона H1F1 (также обозначаемого в настоящей заявке как "НР1").
Фигуры 43А и 43В. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:127) и последовательность кодирующей нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:128) для полноразмерных scFv антител из клона Н1Н3 (также обозначаемого в настоящей заявке как "HH3").
Фигура 44. Аминокислотные последовательности полноразмерных VH и VL антител, специфичных к CD44 из различных клонов. Также указаны каркас и участки, определяющие комплементарность. SEQ ID NOs относится к полноразмерному вариабельному участку. Представлены VH последовательности Е8Н11 (SEQ ID NO:90); Е8Н7 (SEQ ID NO:342); E8G12 (SEQ ID NO:343); E8F11 (SEQ ID NO:344); E8C9 (SEQ ID NO:345); D6G9 (SEQ ID NO:346); и D6D3 (SEQ ID NO:347). Представлены VL последовательности Е8Н11 (SEQ ID NO:348); Е8Н7 (SEQ ID NO:349); E8G12 (SEQ ID NO:350); E8F11 (SEQ ID NO:351); E8C9 (SEQ ID NO:352); D6G9 (SEQ ID NO:353); и D6D3 (SEQ ID NO:354).
Фигуры 45А и 45В. Аминокислотные последовательности полноразмерных VH и VL антител, специфичных к CD44 из различных клонов. Также указаны каркас и участки, определяющие комплементарность. SEQ ID NOs относится к полноразмерному вариабельному участку. Представлены VH последовательности D1C5 (SEQ ID NO:355); D1D1 (SEQ ID NO:356); HB8 (SEQ ID NO:357); HC2 (SEQ ID NO:358); HC4 (SEQ ID NO:359); HE3 (SEQ ID NO:360); HF1 (SEQ ID NO:361); и HH3 (SEQ ID NO:347). Представлены VL последовательности D1C5 (SEQ ID NO:362); D1D1 (SEQ ID NO:363); HB8 (SEQ ID NO:364); HC2 (SEQ ID NO:365); HC4 (SEQ ID NO:366); HE3 (SEQ ID NO:367); HF1 (SEQ ID NO:368); и HH3 (SEQ ID NO:354).
Фигура 46. Аминокислотные последовательности полноразмерных VH и VL антител, специфичных к EphA2 из различных клонов. Также указаны каркас и участки, определяющие комплементарность. SEQ ID NOs относится к полноразмерному вариабельному участку. Представлены VH последовательности А3Н9 (SEQ ID NO:369); A3G3 (SEQ ID NO:370); A3D10 (SEQ ID NO:371); A3D1 (SEQ ID NO:372); и A3C8 (SEQ ID NO:373). Представлены VL последовательности А3Н9 (SEQ ID NO:374); A3G3 (SEQ ID NO:375); A3D10 (SEQ ID NO:376); A3D1 (SEQ ID NO:377); и A3C8 (SEQ ID NO:378).
Фигура 47. Аминокислотные последовательности полноразмерных VH и VL антител, специфичных к EphA2 из различных клонов. Также указаны каркас и участки, определяющие комплементарность. SEQ ID NOs относится к полноразмерному вариабельному участку. Представлены VH последовательности 1А3 (SEQ ID NO:379); 1А5 (SEQ ID NO:380); 1A8 (SEQ ID NO:381); 1A12 (SEQ ID NO:382); 1B2 (SEQ ID NO:383); 1C2 (SEQ ID NO:384); 1C7 (SEQ ID NO:385); и 1D8 (SEQ ID NO:386). Представлены VL последовательности 1А3 (SEQ ID NO:387); 1А5 (SEQ ID NO:388); 1A8 (SEQ ID NO:389); 1A12 (SEQ ID NO:390); 1B2 (SEQ ID NO:391); 1C2 (SEQ ID NO:392); 1C7 (SEQ ID NO:393); и 1D8 (SEQ ID NO:394).
Определения
Следующие аббревиатуры могут быть использованы в настоящей заявке: CDR, участок, определяющий комплементарность; Fab, антиген-связывающий фрагмент иммуноглобулина с вариабельным доменом и первым константным доменом; FACS, сортировка флюоресцентно активированных клеток; IgG, иммуноглобулин G; KD, константа равновесия при диссоциации; kon, константа скорости ассоциации; koff, константа скорости диссоциации; mAb, моноклональное антитело; MFI, средняя интенсивность флюоресценции; PBS, фосфатно-солевой буфер; ПЦР, полимеразная цепная реакция; scFv, одноцепочечный формат вариабельных участков антитела; VH, вариабельный участок тяжелой цепи; VL, вариабельный участок легкой цепи; ТАА, ассоциированный с опухолью антиген; EGFR, рецептор эпидермального фактора роста; ECD, внеклеточный домен; IMAC, аффинная хроматография на иммобилизированных ионах металла; ILs, иммунолипосомы; IPTG, изопропил-β-D-тиогалактопиранозид; 2-МЕА, 2-меркаптоэтиламин; DTT, дитиотриэтол; TEA, триэтиламин; TBS-T, Трис-буферный солевой Tween-20; Ni-NTA, никель-нитрилтрехуксусная кислота; РЕ, фикоэритрин; НМЕС, эпителиальные клетки млекопитающего, являющегося человеком.
При использовании здесь, "EphA2" означает член семейства рецепторных тирозинкиназ, который может связывать ЭфринА лиганды, и также может быть назван "киназой эпителиальных клеток (ECK)". Термин "EphA2" может относиться к любым природным изоформам EphA2. Аминокислотная последовательность EphA2 известна и ее можно найти под номером доступа GenBank No. NP_004422.2.
Как используется здесь, "CD44" означает рецептор для гиалуроновой кислоты (НА) и также может называться "фагоцитный гликопротеин I", "рецептор гиалуроновой кислоты" или "CD44 антиген". Например, термин "CD44" может означать любую из природных изоформ CD44. Аминокислотная последовательность известна и самую длинную изоформу CD44 можно найти под номером доступа GenBank No. NP_000601.3.
Термины "полипептид", "пептид" или "белок" используются здесь взаимозаменяемо для обозначения линейных последовательностей аминокислотных остатков, связанных одна с другой пептидными связями между альфа-амино и карбоксильными группами расположенных рядом остатков. Кроме того, аминокислоты, в дополнение к 20 "стандартным" генетически кодируемым аминокислотам, включают аналоги аминокислот. Далее, следует заметить, что тире в начале или конце аминокислотной последовательности указывает или на пептидную связь со следующей последовательностью одного или более аминокислотных остатков, или на ковалентную связь с карбоксильной или гидроксильной концевой группой. Однако отсутствие тире не должно означать, что такие пептидные связи или ковалентная связь с карбоксильной или гидроксильной концевой группой не присутствуют, если в репрезентации аминокислотных последовательностей пропуск такового является обычным.
"Антитело" охватывает соединения, содержащие антиген-связывающий белок, отдельно или как препарат, содержащий их в большом количестве, имеющий один или более полипептидов, которые могут генетически кодироваться генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов, или который содержит CDR, полученные или происходящие из иммуноглобулинов, и который связывается с представляющим интерес антигеном. Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда. Тяжелые цепи могут классифицироваться как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, что в свою очередь определяет классы иммуноглобулина, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно.
Примером антитела является таковое, имеющее структурную единицу тетрамера, составленного из двух пар полипептидных цепей, каждая часть имеет одну "легкую" и одну "тяжелую" цепь. N-терминальный участок каждой цепи определяет вариабельный участок, который опосредует связывание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (VL) и вариабельная тяжелая цепь (VH) относятся к легким и тяжелым цепям, соответственно.
"Антитело" также охватывает одноцепочечные антитела, которые содержат тяжелую цепь и легкую цепь, связанные вместе как один полипептид, каждая из связанных тяжелых или легких цепей, безотносительно этого обозначается здесь как тяжелая цепь или легкая цепь. Антитело может также относиться к антителам только с тяжелой цепью, таким как тяжелоцепочечные или HCAbs.
Как отмечено выше, "антитело" охватывает интактные иммуноглобулины, а также антиген-связывающие фрагменты антител. Таким образом, термин "антитело", при использовании здесь, также включает антиген-связывающий участок антитела, который может быть произведен путем модификации целых антител или синтезирован de novo с использованием методологий рекомбинантных ДНК. Примеры включают, но не ограничиваются тем самым. Fab', Fab'2, scFv, нанотела, унитела и диатела. "Нанотело" означает наименьший антиген-связывающий фрагмент одноцепочечного антитела, также обозначаемый как VHH или однодоменные антитела (dAbs).
"Моноклональное антитело" означает композицию, содержащую одно или более антител, полученных из популяции по существу гомогенных антител, т.е. популяции отдельных антител, которые идентичны за исключением любых естественным образом появляющихся мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направлены против единственного антигенного сайта и обычно к единственному эпитопу на антигене. Модификатор "моноклональный" указывает на характер антитела как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не требует того, что антитело было произведено по любому определенному способу или являлось единственным антителом в композиции.
Одноцепочечный Fv ("scFv") полипептид является ковалентно связанным VH::VL гетеродимером, который может экспрессироваться из нуклеиновой кислоты, включающей VH- и VL- кодирующие последовательности, соединенные либо напрямую, либо соединенные кодирующим полипептид линкером (Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883). Множество структур доступны для конвертации легкой и тяжелой полипептидных цепей из V участка антитела в scFv молекулу, которая будет складываться в трехмерную структуру, по существу подобную структуре антиген-связывающего сайта. Кроме диател, scFvs могут также присутствовать как тритела или тетратела.
Следует заметить, что хотя различные фрагменты антител определяются в терминах расщепления интактного антитела, специалисты поймут, что такие фрагменты могут синтезироваться de novo или химически, или с использованием рекомбинантной ДНК-методологии.
Термин "антитело" охватывает поликлональные и моноклональные антитела, и кроме того, охватывает антитела любого класса (например, IgM, IgG и их подклассы). "Антитело" также охватывает гибридные антитела, биспецифические антитела, гетероантитела, химерные антитела, гуманизированные антитела и их функциональные фрагменты, которые сохраняют связывание антигена. "Биспецифические антитела" могут походить на единичные антитела (или фрагменты антител), но имеют два различных антиген-связывающих сайта (вариабельных участка). Гетероантитела относятся к двум или более антителам или связывающим антитела фрагментам (например. Fab), связанным вместе, каждое антитело или фрагмент имеют различную специфичность. Антитела могут быть конъюгированы с другими компонентами, и/или могут связываться с подложкой (например, твердой подложкой), такой как полистироловая пластинка или шарик, тестовая полоска и тому подобное.
Вариабельный участок легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина составлен из "каркасного" участка (FR), прерываемого тремя гипервариабельными участками, также называемыми "участками, определяющими комплементарность" или "CDR".
Протяженность каркасного участка и CDR может быть определена на основе баз данных, известных специалистам. См., например, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 4th ed. U.S. Dept. Health и Human Services, Public Health Services, Bethesda, MD (1987), Lefranc et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system®. Nucl. Acids Res., 2005, 33:D593-D597 (www.imgt.org/textes/IMGTScientificChart/), и/или V Base на vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Последовательности каркасных участков различных легких или тяжелых цепей сравнительно консервативны в пределах видов. Каркасный участок антитела, в котором комбинируются каркасные участки компонентов легкой и тяжелой цепей, служит для определения позиции и выравнивания CDR. CDR первоначально служат для связывания эпитопа антигена. Все CDR и каркасные участки, предоставляемые настоящим изобретением, определяются в соответствии с Kabat et al., supra, если не указано иное.
"Анти-EphA2 антитело" или "анти-CD44 антитело" означает антитело, которое специфически связывается с EphA2 или CD44, предпочтительно с высокой аффинностью. Специфическое антитело к EphA2 или CD44 не демонстрирует сопоставимого связывания с другими антигенами, несвязанными с EphA2 или CD44, по сравнению со связыванием EphA2 или CD44.
Термин "высокая аффинность" при использовании в отношении антитела означает антитело, которое специфически связы