Потребительские товары с вариантами протеазы

Потребительские товары с вариантами протеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к потребительским товарам, содержащим протеазы, а также способам получения и использования таких потребительских товаров.

Уровень техники

Производители моющих средств включают протеазы в свои товары, чтобы обеспечить хорошую очистку от пятен (например, крови). Однако, учитывая устойчивость и потребительские тенденции к более низким температурам стирки, оказывается все более трудным обеспечивать потребителю приемлемые преимущества, и остается необходимость в улучшении очистки и профиля свежести этих составов моющих средств для стирки. Изобретатели обнаружили, что дополнительно включив некоторые протеазы в потребительские товары, например, состав моющего средства для стирки, которые могут, с одной стороны, содержать оттеночный агент, растворимый в холодной воде осветлитель, катализатор отбеливания, липазу первого промывания, бактериальную чистящую целлюлазу, неионное поверхностно-активное вещество Guerbet и/или капсулу отдушки, улучшается одно или более из очистки, белизны, восприятия белизны и/или профиля свежести такого потребительского товара.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к потребительским товарам, содержащим протеазы, в особенности протеазы для холодной воды, и к способам получения и использования таких товаров. Такие составы обеспечивают улучшенную очистку и свежесть. Такие протеазы получают из родительского фермента, субтилизина, полученного из Bacillus lentus, путем замещения, инсерции и/или делеции одной или более из аминокислот родительских ферментов.

Краткое описание чертежей

ФИГ.1 обеспечивает выравнивание зрелых реперных протеаз, включая Bacillus amyloliquefaciens субтилизин BPN' (SEQ ID NO:2) и B. lentus субтилизин GG36 протеазы (SEQ ID NO:1). Каждое аминокислотное положение каждого варианта протеазы, описанного в данной заявке, в том числе каждый вариант протеазы для холодной воды, пронумеровано в соответствии с нумерацией соответствующего аминокислотного положения в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', показанной на Фигуре 1, как определено выравниванием варианта протеазы аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN'.

Фигура 2 демонстрирует pHPLT-GG36 плазмид экспрессии.

Фигура 3 демонстрирует pRA68 плазмид экспрессии.

Фигура 4 демонстрирует pRA96 плазмид экспрессии.

Подробное описание изобретения

Определения

Как используют в данной заявке, «потребительский товар» означает товар для ухода за тканями и для домашнего ухода.

Как используют в данной заявке, термин «товар для ухода за тканями и для домашнего ухода» относится к товарам для ухода за тканями и для домашнего ухода и/или в целом предназначен для использования или потребления в той форме, в которой продается, и который предназначен для обработки тканей, твердых поверхностей и любых других поверхностей, и очистки систем, для ухода и очистки неодушевленных поверхностей, а также товарам для кондиционирования тканей и другим товарам, предназначенным специально для ухода и хранения тканей, и товарам для воздушного ухода, включая, воздушный уход, включая системы освежителей воздуха и доставки ароматизаторов, уход за автомобилем, уход за домашними животными, уход за скотом, личную гигиену, уход за ювелирными изделиями, посудой, кондиционирование тканей (включая смягчение и/или освежение), моющие средства для стирки, добавки для стирки и промывания и/или по уходу, составы предварительной обработки перед очисткой, очищающие средства для очистки и/или обработки твердой поверхности, включая очистители для пола и унитазов, средства для очистки и/или обработки стекол, средства для очистки и/или обработки плитки, средства для очистки и/или обработки керамики, и другие чистящие средства для использования потребителем или учреждениями. В некоторых осуществлениях товары для ухода за тканями и для домашнего ухода приемлемы для использования на ранах и/или коже. «Товар для ухода за тканями и для домашнего ухода» включает товары для использования потребителем или учреждениями. Это определение не включает товары (a) предназначенные для использования для очистки контактных линз, или ультрафильтрационных мембран, или (b) при заживлении ран или для медицинского лечения кожных состояний. Такие товары ухода для за тканями и для домашнего ухода, в общем, предназначены для использования или потребления в той форме, в которой они продаются.

Как используют в данной заявке, термин «состав для очистки и/или обработки» представляет собой подмножество товаров для ухода за тканями и для домашнего ухода. Такие товары включают, но не ограничиваясь приведенным, товары для обработки тканей, твердых поверхностей и любых других поверхностей в области ухода за тканями и домашнего ухода, в том числе, воздушного ухода, включая освежители воздуха и системы доставки ароматизаторов, уход за автомобилем, мытье посуды, кондиционирование тканей (включая смягчение и/или освежение), моющие средства для стирки, добавки для стирки и промывания и/или ухода, средства для очистки и/или обработки твердых поверхностей, включая очистители для пола и унитазов, гранулированные или порошковые универсальные моющие средства или моющие средства «для работы с высокой нагрузкой», особенно чистящие моющие средства; жидкие, гелеобразные или пастообразные универсальные моющие средства, особенно так называемые типы жидкостей «для работы с высокой нагрузкой»; жидкие моющие средства для деликатной стирки; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды облегченного типа, особенно средства с высоким вспениванием, средства для мытья посуды в посудомоечных машинах, в том числе различные таблетки, гранулированные, жидкие и промывающие типы для использования в бытовых целях и учреждениях: шампуни для автомобилей или ковров, чистящие средства для ванных комнат, включая очистители для унитазов, а также чистящие вспомогательные вещества, такие как отбеливающие добавки и типы «пятновыводителей-карандашей» или типы для предварительной обработки, товары на подложке, такие как высушивающие листы.

Как используют в данной заявке, термин «состав для очистки и/или обработки ткани и/или твердой поверхности» представляет собой подмножество составов для очисти и обработки, которое включает, если не указано иное, гранулированные или порошковые универсальные или «для работы с высокой нагрузкой» моющие средства, особенно чистящие моющие средства; жидкие, гелеобразные или пастообразные универсальные моющие средства, особенно так называемые «для работы с высокой нагрузкой» типы жидкостей; жидкие моющие средства для деликатной стирки; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды облегченного типа, особенно с высоким вспениванием; средства для мытья посуды в посудомоечных машинах, в том числе различные таблетки, гранулированные, жидкие средства и средства для промывания для бытового использования и использования в учреждениях; жидкие средства для очистки и дезинфекции, шампуни для автомобилей или ковров, чистящие средства для ванных комнат, включая очистители для унитазов, товары для кондиционирования тканей, в том числе смягчения и/или освежения, которые могут быть в жидкой, твердой форме и/или форме листового высушивающего средства, а также вспомогательные вещества для очистки, такие как отбеливающие добавки и «пятновыводители-карандаши» или типы для предварительной обработки, товары на подложке, такие, как высушивающие листы. Все такие товары, которые могут быть применимы могут быть в разовой, концентрированной или даже высококонцентрированной форме, даже при условии, что такие товары в определенном аспекте могут быть неводными.

Как используют в данной заявке, термин «вариант протеазы для холодной воды» означает вариант родительской протеазы, где указанная родительская протеазная последовательность на, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99%, по меньшей мере, 99, 5% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, указанный вариант имеет одну или более следующих характеристик:

a) показатель эффективности по Тестовому методу 2, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2; от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5;

b) показатель эффективности по Тестовому методу 3, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере 2; от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1, до приблизительно 5;

c) показатель эффективности по Тестовому методу 4, по меньшей мере, 1,0, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере, 2, от 1,0 до приблизительно 10, от 1, 0 до приблизительно 8 или даже от 1, 0 до приблизительно 5;

d) показатель эффективности по Тестовому методу 6, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,2, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,4, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 1,6, по меньшей мере, 1,7, по меньшей мере, 1,8, по меньшей мере, 1,9, по меньшей мере 2; от 1,1 до приблизительно 10, от 1,1 до приблизительно 8 или даже от 1,1 до приблизительно 5, при этом каждое аминокислотное положение пронумеровано в соответствии с нумерацией соответствующего аминокислотного положения в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN'. Предпочтительные протеазы для холодной воды, приемлемые для применения в настоящем изобретении имеют характеристики в соответствии с Тестовым методом 6, как определено в d) выше.

Тестовый метод 2, Тестовый метод 3, Тестовый метод 4 и Тестовый метод 6 ясно описаны ниже в разделе под названием «ТЕСТОВЫЕ МЕТОДЫ».

Как используют в данной заявке, термин «вариант протеазы» означает вариант родительской протеазы, указанная родительская протеазная последовательность на, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99%, по меньшей мере, 99,5% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, при этом каждое аминокислотное положение пронумеровано в соответствии с нумерацией соответствующего аминокислотного положения в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN'.

Как используют в данной заявке, при использовании в формуле изобретения, единственное число подразумевает, что заявлено или описано как единственное, так и множественное число.

Как используют в данной заявке, термины «включать», «включает» и «включая» предназначены быть неограничивающими.

Как используют в данной заявке, термин «твердый» включает гранулированные, порошкообразные, карандашеобразные и таблеткообразные формы продукта.

Как используют в данной заявке, термин «жидкий» включает жидкие, гелеобразные, пастообразные и газообразные формы продукта.

Как используют в данной заявке, термин «положение» включает ткани, одежду и/или твердые поверхности.

Если не указано иное, все уровни компонентов или составов приведены по отношению к активной части этого компонента или состава, и без примесей, например, остаточных растворителей или побочных продуктов, которые могут присутствовать в коммерчески доступных источниках таких компонентов или составов.

Все процентные содержания и соотношения рассчитываются по массе, если не указано иное. Все процентные содержания и соотношения рассчитываются на основе общего состава, если не указано иное.

Следует понимать, что каждый максимальный количественный предел, указанный в данном описании, включает все нижние количественные пределы, как если бы нижние количественные пределы были специально раскрыты в данной заявке. Каждый минимальный количественный предел, указанный в данном описании, будет включать все высшие количественные пределы, как если бы такие высшие количественные пределы были специально раскрыты в данной заявке. Каждый количественный диапазон, указанный в данном описании, будет включать все более узкие количественные диапазоны, которые попадают в такие более широкие диапазоны, как если бы такие более узкие количественные диапазоны были специально раскрыты в данной заявке.

Потребительские товары

Как описано в данной заявке, потребительские товары, содержащие варианты протеазы, описанные в данной заявке, имеют конкретное применение в чистящей индустрии, например, моющих средствах для стирки и мытья посуды. Эти применения помещают ферменты в различные экологические стрессы. Варианты протеазы, использованные в настоящем изобретении, обеспечивают преимущества по сравнению со многими ферментами, используемыми в настоящее время, в связи, по меньшей мере, отчасти, с их устойчивостью в различных условиях.

Действительно, существует целый ряд условий мытья, включая различные моющие составы, объемы промывных вод, температуры промывных вод и продолжительность мытья, которым подвергаются протеазы, участвующие в мытье. Кроме того, моющие составы, используемые в различных географических зонах, имеют различные концентрации их соответствующих компонентов, присутствующих в промывной воде. Например, европейские моющие средства содержат типично приблизительно 4500-5000 м.д. компонентов моющих средств в промывной воде, в то время как японские моющие средства содержат типично приблизительно 667 м.д. компонентов моющих средств в промывной воде. В Северной Америке, особенно в США, моющие средства содержат типично приблизительно 975 м.д. компонентов моющих средств в промывной воде.

Система с низкой концентрацией моющих средств включает моющие средства, где менее, чем приблизительно 800 м.д. компонентов моющего средства присутствует в промывной воде. Японские моющие средства, типично, считаются системой с низкой концентрацией моющих средств, поскольку они содержат приблизительно 667 м.д. компонентов моющего средства в промывной воде.

Средняя концентрация моющих средств включает моющие средства, где от приблизительно 800 м.д. до приблизительно 2000 м.д. компонентов моющего средства присутствуют в промывной воде. Североамериканские моющие средства, как правило, считаются системами со средними концентрациями моющих средств, поскольку они содержат приблизительно 975 м.д. компонентов моющего средства в промывной воде. Бразилия, типично, содержит приблизительно 1500 м.д. компонентов моющего средства в промывной воде.

Система с высокой концентрацией моющих средств включает моющие средства, где больше, чем приблизительно 2000 м.д. компонентов моющего средства присутствуют в промывной воде. Европейские моющие средства, как правило, считаются системами с высокой концентрацией моющих систем, поскольку они содержат приблизительно 4500-5000 м.д. компонентов моющего средства в промывной воде.

Латиноамериканские моющие средства, как правило, представляют собой фосфатные моющие средства с высоким пенообразованием и ряд моющих средств, используемых в Латинской Америке, может подпадать как под средние, так под и высокие концентрации моющих средств, поскольку они находятся в диапазоне от 1500 м.д. до 6000 м.д. компонентов моющего средства в промывной воде. Как указано выше, Бразилия типично имеет приблизительно 1500 м.д. компонентов моющего средства в промывной воде. Тем не менее, другие географические положения фосфатных моющих средств с высоким ценообразованием, а не только другие страны Латинской Америки, могут иметь системы с высокой концентрацией моющих средств до приблизительно 6000 м.д. компонентов моющего средства, присутствующих в промывной воде.

В свете вышеизложенного, очевидно, что концентрации составов моющих средств в типовых промывных растворах во всем мире варьируются от менее, чем приблизительно 800 м.д. состава моющего средства («географические положения низкой концентрации моющего средства»), например, приблизительно 667 м.д. в Японии, от приблизительно 800 м.д. до приблизительно 2000 м.д. («географические положения средней концентрации моющего средства»), например, от приблизительно 975 м.д. в США и от приблизительно 1500 м.д. в Бразилии до более, чем приблизительно 2000 м.д. («географические положения высокой концентрации моющего средства»), например, от приблизительно 4500 м.д. до приблизительно 5000 м.д. в Европе и приблизительно 6000 м.д. в географических положениях фосфатных моющих средств с высоким пенообразованием.

Концентрации типовых промывных растворов определяют эмпирически. Например, в США, типичная стиральная машина удерживает объем приблизительно 64, 4 л промывного раствора. Соответственно, для того, чтобы получить концентрацию приблизительно 975 м.д. моющего средства в промывном растворе приблизительно 62,79 г состава моющего средства должно быть добавлено к 64, 4 л промывного раствора. Это количество является типичным количеством, которое измеряет в промывной воде потребитель с помощью измерительной чашки, обеспеченной моющим средством.

В качестве дополнительного Примера, различные географические положения используют различные температуры мытья. Температура промывной воды в Японии, типично, меньше, чем в Европе. Например, температура промывной воды в Северной Америке и Японии, типично, составляет от приблизительно 10 до приблизительно 30°C (например, приблизительно 20°C), в то время как температура промывной воды в Европе, типично, составляет от приблизительно 30 до приблизительно 60°C (например, приблизительно 40°C). Тем не менее, в интересах экономии энергии, многие потребители переходят на использование холодной промывной воды. Кроме того, еще в некоторых регионах, холодная вода типично используется для стирки, а также для мытья посуды. В некоторых осуществлениях «холодная промывная вода» в соответствии с настоящим изобретением использует мытье при температурах от приблизительно 10°C до приблизительно 40°C, или от приблизительно 20°C до приблизительно 30°C, или от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C, а также все другие комбинации в диапазоне от приблизительно 15°C до приблизительно 35°C, и все диапазоны в пределах от 10°C до 40°C.

В качестве дополнительного Примера, различные географические положения обычно имеют разные жесткости воды. Жесткость воды обычно описываются в терминах гран на галлон смешанных Ca²⁺/Mg²⁺. Жесткость является мерой количества кальция (Ca²⁺) и магния (Mg²⁺) в воде. Большая часть воды в Соединенных Штатах является жесткой, но степень жесткости меняется. Умеренно жесткая (60-120 м.д.) и жесткая (121-181 м.д.) вода имеет от 60 до 181 миллионных долей (миллионные доли, конвертированные в гран на галлон США, являются м.д. #, разделенными на 17,1, что равно гран на галлон) твердых минералов.

Вода	Гран на галлон	Миллионные доли
Мягкая	Менее, чем 1,0	Менее, чем 17
Слегка жесткая	1,0-3,5	17-60
Умеренно жестка	3,5-7,0	60-120
Жесткая	7,0-10,5	120-180
Очень жесткая	Более, чем 10,5	Более, чем 180

Европейская жесткость воды, типично, больше, чем приблизительно 10,5 (например, от приблизительно 10,5 до приблизительно 20,0) гран на галлон смешанных Ca²⁺/Mg²⁺ (например, приблизительно 15 гран на галлон смешанных Ca²⁺/Mg²⁺). Североамериканская жесткость воды, типично, больше, чем японская жесткость воды, но меньше, чем европейская жесткость воды. Например, североамериканская жесткость воды может составлять от приблизительно 3 до приблизительно 10 гран, от приблизительно 3 до приблизительно 8 гран или приблизительно 6 гран. Японская жесткость воды, типично, ниже, чем североамериканская жесткость воды, как правило, меньше, чем приблизительно 4, например, приблизительно 3 гран за галлон смешанных Ca²⁺/Mg²⁺.

Соответственно, в некоторых осуществлениях настоящее изобретение обеспечивает потребительские товары, которые показывают удивительную характеристику мытья в, по меньшей мере, одном наборе условий мытья (например, температура воды, жесткость воды и/или концентрация моющего средства).

В частности, настоящее изобретение включает способ мытья.

В некоторых осуществлениях потребительские товары в соответствии с настоящим изобретением сопоставимы по характеристике мытья с другими потребительскими товарами, содержащими другие протеазы субтилизина. В некоторых осуществлениях потребительские товары в соответствии с настоящим изобретением проявляют повышенную характеристику мытья по сравнению с потребительскими товарами, содержащими протеазы субтилизина, которые в настоящее время коммерчески доступны. Таким образом, в некоторых осуществлениях в соответствии с настоящим изобретением, потребительские товары, содержащие варианты протеазы, предоставленные в данной заявке, проявляют повышенную очистку, что обусловлено, по меньшей мере, частично, повышением окислительной стабильности, повышенной термической стабильностью, повышенными возможностями очистки в различных условиях, и/или повышенной хелаторной стабильностью задействованных ферментов.

Потребительские товары

Во всех своих формах, составы, раскрытые в данной заявке, являются потребительскими товарами.

В одном аспекте, раскрывается состав, содержащий вспомогательный материал и вариант протеазы для холодной воды, при этом указанный состав представляет собой потребительский товар.

Тестовый метод 2, Тестовый метод 3, Тестовый метод 4 и Тестовый метод 6 обсуждены ниже в разделе под названием «ТЕСТОВЫЕ МЕТОДЫ».

В одном аспекте указанного состава, указанный вариант протеазы содержит одну или более, или даже две, или более, или предпочтительно три или более из следующих мутаций X1R, X2S, X2M, X2A, X2R, X2W, X3R, X4R, X4S, X4C, X8A, X9A, X9F, X9W, X10S, X10A, X10H, X10M, X12F, X12R, X14K, X14F, X14Q, X15R, X15F, X16S, X17R, X17M, X17F, X18R, X18K, X20F, X20K, X20R, X22A, X22R, X22Y, X22V, X22Q, X22L, X22W, X23A, X23S, X23F, X24R, X24F, X24W, X24Q, X24H, X24L, X25V, X25F, X25R, X26F, X27L, X27F, X27R, X27V, X28A, X28N, X28E, X29T, X30E, X31F, X33S, X33G, X33D, X34P, X35M, X36T, X36F, X36R, X38L, X38F, X38R, X40N, X40L, X40T, X40W, X40H, X40R, X42I, X43A, X43F, X43I, X43S, X43R, X43M, X43W, X43D, Х45Т, X46R, X48R, X50C, X51W, X51F, X51H, X52F, X52E, X52N, X55Y, X57R, Х59А, X59F, X59R, X60P, X60Q, X60A, X62E, X62Q, X63V, X63M, Х63Т, X63I, X63A, X63S, X63H, X63Q, X63D, X63E, X63P, X64F, Х64Т, Х68А, X68C, X69N, X69T, X69P, X69W, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, Х75Е, X75R, X76D, X78R, X78N, X78I, X79W, X79Q, X81R, X82F, X82T, X82V, X82R, X82M, X85M, X86W, X86L, X86I, X89P, X89T, X89G, X89H, X89L, X89V, X89W, X89F, X89I, X91N, X91F, X92F, X94N, X99F, X99T, Х99Р, X99G, X99M, X100S, X100N, X100Q, X100I, X101A, X101N, X101G, X101T, X101D, X101E, X101P, X101F, X102A, X102T, X102N, X102H, X102E, X103G, X103N, X103D, X103A, X104L, X104I, X104E, X104D, X105T, X105E, X105Q, X106G, X106T, X106E, X106D, X106A, X106V, X106F, X107M, X107F, X108I, X108G, X109M, X111V, X111I, X112V, X112L, X112Q, X114G, X115K, X115R, X116K, X116A, X116L, X117F, X118R, X118I, X119C, X120A, X120F, X120R, X121F, X121E, X123G, X123E, X124S, X128D, X128F, X128L, X128N, X128H, X128M, X128I, X128Q, X129E, X132A, X132E, X138G, X144R, X147L, X148I, X158E, X159D, X159E, X159C, X160D, X166D, X166E, X167W, X175V, X177C, X181A, X182R, X183I, X183D, X183M, X183F, X183R, X185E, X185V, X185I, X186H, X186K, X188E, X188D, X188R, X192H, X192W, X194E, X194V, X194F, X197F, X198L, X198F, X203E, X203C, X208S, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X209L, X210R, X210V, X210L, X211Q, X211R, X212I, X212M, X212F, X213A, X214F, X215N, X215D, X215E, X215H, X215F, X216F, X216A, X217E, X217N, X217D, X218D, X218P, X218E, X224A, X224G, X227I, X230E, X231I, X231C, X232V, X233C, X234F, X235F, X236F, X236N, X236H, X238R, X238K, X238L, X239K, X239G, X239R, X239H, X239T, X239N, X239S, X239F, X240R, X241R, X242L, X242R, X243F, X243R, X244R, X245R, X246S, X248D, X248V, X248I, X248R, X249R, X249T, X250I, X251R, X251S, X252I, X252F, X252R, X252K, X252H, X253I, X253R, X253F, X254C, X256N, X258R, X260V, X260I, X262D, X262H, X263F, X265F, X267V, X267N, X267M, X269I, X269R, X270C, X271I, X271V, X271H, X271M, X271L, X271P, X271A, X271F, X271T, X272F, X272F, X272R, X273F, X273I и X274G.

В предпочтительном аспекте указанного состава, указанный вариант протеазы содержит одну или более, предпочтительно две или предпочтительно три, или более из следующих мутаций X1R, X2S, X4R, X4S, X9A, X10S, X14K, X16S, X17R, X18R, X20R, X22A, X22R, X24R, X24W, X25R, X25V, X26F, X42I, X43R, X43A, X46R, X52F, X52E, X52N, X57R, X59A, X62E, X62Q, X68A, X68C, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, X75R, X76D, X78R, X82R, X86W, X89P, X89T, X89G, X89H, X89I, X89V, X89W, X91N, X94N, X100S, X101A, X101N, X101G, X101D, X103G, X103N, X104L, X104I, X106V, X106G, X108I, X111V, X112V, X115K, X115R, X117F, X1181, X121F, X128D, X128F, X128L, X128N, X129E, X144R, X148I, X158E, X159E, X160D, X166D, X185E, X185I, X186H, X188E, X188D, X197F, X203E, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X210R, X212I, X212F, X214F, X215N, X215D, X215E, X217E, X217N, X224A, X230E, X231I, X236F, X238R, X238K, X239K, X239G, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, X248I, X248V, X249R, X250I, X252R, X253R, X262D, X263F, X265F, X267V, X267N, X269I, X269R, X271F, X271I, X271H, X271P, X271T, X271V, X271L и X272F, и необязательно одну или более из следующих мутаций: X103A, X159D, X236H, X245R, X248D и X252K.

В одном аспекте указанного состава, указанный вариант протеазы содержит один или более из следующего набора мутаций X022R-X024R, X009A-X271L, X018R-X241R, X018R-X115R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X020R-X024R, X018R-X249R, X009A-X020R, X020R-X241R, X009A-X078R, X020R-X115R, X018R-X024R, X024R-X242R, X022R-X115R, X018R-X043R, X020R-X043R, X018R-X242R, X242R-X269R, X018R-X244R, X024R-X269R, X020R-X271L, X024R-X271L, X004R-X009A, X020R-X269R, X001R-X024R, X244R-X271L, X009A-X018R, X241R-X271L, X004R-X024R, X009A-X249R, X009A-X022R, X062E-Х129Е, X062E-X159E, X016S-X148I, X158E-X249R, X016S-X062E, X111V-X188D, X022A-X062E, X062E-X148I, X022A-X129E, X062E-X271F, X062E-Х158Е, X016S-X159E, X062E-X186H, X128N-X159E, X062E-X188D, X062E-X128N, X148I-X159E, X103G-X158E, X111V-X159E, X158E-X271F, X016S-X188D, X022A-X111V, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X128N-X186H, X159E-X209E, X062E-X101A, X111V-X209E, X148I-X188D, X101A-X209E, X022A-X188D, X016S-X022A, X128N-X129E, X016S-X209E, X016S-X128N, X022A-X089P, X128N-X209E, X089P-X158E, X062E-X103G, X186H-X271F, X016S-X129E, X089P-Х159Е, X111V-X249R, X101A-X129E, X148I-X209E, X022A-X159E, X129E-X249R, X129E-X209E, X104L-X129E, X128N-X188D, X111V-X158E, X022A-Х158Е, X062E-X209E, X062E-X249R, X101A-X186H, X089P-X129E, X129E-X271F, X22A-X111V-X159E, X101A-X103G-X104L-X209E, X101A-X103G-X104L-X159E, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, X22A-X103G-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, Х22А-Х209Е-X271F, Х22А-Х101А-Х209Е, X101A-X209E-X271F, X22A-X111V-X128N, X22A-X101A-X159E, X101A-X103G-X104L, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L, X101G-X103A-X104I, X101A-X103G-X104L-X128N, X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-, X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X253R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X22A-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X1041-X159D-X232V-X245R-X248D-X238R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D и X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X271F.

В одном аспекте указанного состава, указанный вариант протеазы содержит всего три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или даже 25 мутаций, предпочтительно три или четыре, наиболее предпочтительно три мутации, выбранные из: X1R, X2S, X2M, X2A, X2R, X2W, X3R, X4R, X4S, X4C, X8A, X9A, X9F, X9W, X10S, X10A, X10H, X10M, X12F, X12R, X14K, X14F, X14Q, X15R, X15F, X16S, X17R, X17M, X17F, X18R, X18K, X20F, X20K, X20R, X22A, X22R, X22Y, X22V, X22Q, X22L, X22W, X23A, X23S, X23F, X24R, X24F, X24W, X24Q, X24H, X24L, X25V, X25F, X25R, X26F, X27L, X27F, X27R, X27V, X28A, X28N, X28E, X29T, ХЗОЕ, X31F, X33S, X33G, X33D, X34P, X35M, X36T, X36F, X36R, X38L, X38F, X38R, X40N, X40L, X40T, X40W, X40H, X40R, X42I, X43A, X43F, X43I, X43S, X43R, X43M, X43W, X43D, X45T, X46R, X48R, X50C, X51W, X51F, X51H, X52F, X52E, X52N, X55Y, X57R, X59A, X59F, X59R, X60P, X60Q, X60A, X62E, X62Q, X63V, X63M, X63T, X63I, X63A, X63S, X63H, X63Q, X63D, X63E, X63P, X64F, X64T, X68A, X68C, X69N, X69T, X69P, X69W, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, X75E, X75R, X76D, X78R, X78N, X78I, X79W, X79Q, X81R, X82F, X82T, X82V, X82R, X82M, X85M, X86W, X86L, X86I, X89P, X89T, X89G, X89H, X89L, X89V, X89W, X89F, X89I, X91N, X91F, X92F, X94N, X99F, X99T, X99P, X99G, Х99М, X100S, X100N, X100Q, X100I, X101A, X101N, X101G, X101T, X101D, X101E, X101P, X101F, X102A, X102T, X102N, X102H, X102E, X103G, X103N, X103D, X103A, X104L, X104I, X104E, X104D, X105T, X105E, X105Q, X106G, X106T, X106E, X106D, X106A, X106V, X106F, X107M, X107F, X108I, X108G, X109M, X111V, X111I, X112V, X112L, X112Q, X114G, X115K, X115R, X116K, X116A, X116L, X117F, X118R, XI18I, X119C, X120A, X120F, X120R, X121F, X121E, X123G, X123E, X124S, X128D, X128F, X128L, X128N, X128H, X128M, X128I, X128Q, X129E, X132A, X132E, X138G, X144R, X147L, X148I, X158E, X159D, X159E, X159C, X160D, X166D, X166E, X167W, X175V, Х177С, Х181А, X182R, X183I, X183D, X183M, X183F, X183R, X185E, X185V, X185I, X186H, X186K, X188E, X188D, X188R, X192H, X192W, X194E, X194V, X194F, X197F, X198L, X198F, X203E, X203C, X208S, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X209L, X210R, X210V, X210L, X211Q, X211R, X212I, X212M, X212F, X213A, X214F, X215N, X215D, X215E, X215H, X215F, X216F, X216A, X217E, X217N, X217D, X218D, X218P, X218E, X224A, X224G, X227I, X230E, X231I, Х231С, X232V, X233C, X234F, X235F, X236F, X236N, X236H, X238R, X238K, X238L, X239K, X239G, X239R, X239H, X239T, X239N, X239S, X239F, X240R, X241R, X242L, X242R, X243F, X243R, X244R, X245R, X246S, X248D, X248V, X248I, X248R, X249R, X249T, X250I, X251R, X251S, X252I, X252F, X252R, X252K, X252H, X253I, X253R, X253F, X254C, X256N, X258R, X260V, X260I, X262D, X262H, X263F, X265F, X267V, X267N, X267M, X269I, X269R, X270C, X271I, X271V, X271H, X271M, X271L, X271P, Х271А, X271F, Х271Т, X272F, X272F, X272R, X273F, X273I и X274G.

В предпочтительном аспекте указанного состава, указанный вариант протеазы содержит всего три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или даже 25 мутаций, предпочтительно три или четыре, наиболее предпочтительно три мутации, выбранные из: X1R, X2S, V4R, V4S, X9A, X10S, X14K, X16S, H17R, X18R, X20R, X22A, X22R, X24R, X24W, X25R, X25V, X26F, X42I, X43R, X43A, G46R, X52F, X52E, X52N, T57R, Q59A, X62E, X62Q, X68A, X68C, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, X75R, X76D, X78R, L82R, P86W, X89P, X89T, X89G, X89H, X89I, X89V, X89W, X91N, X94N, X100S, X101A, X101N, X101G, X101D, X103G, X103N, X104L, X104I, X106V, X106G, X108I, X111V, X112V, X115K, X115R, X117F, X118I, X121F, X128D, X128F, X128L, X128N, X129E, X144R, X148I, X158E, X159E, X160D, X166D, X185E, X185I, X186H, X188E, X188D,D197F, X203E, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X210R, X212I, X212F, X214F, X215N, X215D, X215E, X217E, X217N, X224A, X230E, X231I, X236F, X238R, X238K, X239K, X239G, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, X248I, X248V, X249R, X250I, X252R, X253R, X262D, X263F, X265F, X267V, X267N, X269I, X269R, X271F, X271I, X271H, X271P, X271T, X271V, X271L и X272F; и необязательно одну или более из следующих мутаций: X103A, X159D, X236H, X245R, X248D и X252K.

В одном аспекте указанного состава, указанный вариант протеазы содержит:

а) две или более из следующих мутаций: X1R, X2S, V4R, V4S, X9A, X10S, X14K, X16S, X22A, X22R, X24R, X25V, X26F, X42I, X52F, X52E, X52N, X62E, X62Q, X68A, Х68С, X71G, X72C, X74C, X75A, X75F, X78R, X89P, X89T, X89G, X89H, X89W, X91N, X94N, X100S, X101A, X101N, X101G, X101D, X103G, X103N, X104L, X104I, X108I, X111V, X112V, X115K, X117F, X121F, X128D, X128F, X128L, X128N, X129E, X148I, X158E, X159E, X160D, X166D, X185E, X186H, X188E, X188D, X203E, X209S, X209N, X209F, X209T, X209E, X209H, X209G, X210R, X212I, X212F, X214F, X215N, X215D, X215E, X217E, X217N, X224A, X230E, X231I, X236F, X238R, X238K, X239K, X239G, X239R, X248V, X249R, X250I, X262D, X263F, X265F, X267V, X267N, X269I, X269R, X271F, X271I, X271H и X272F; и/или

b) один или более из следующих наборов мутаций: Х062Е-Х129Е, X062E-X159E, X016S-X148I, X158E-X249R, X016S-X062E, X111V-X188D, X022A-X062E, X062E-X148I, X022A-X129E, X062E-X271F, Х062Е-X158E, X016S-X159E, X062E-X186H, X128N-X159E, X062E-X188D, X062E-X128N, X148I-X159E, X103G-X158E, X111V-X159E, X158E-X271F, X016S-X188D, X022A-X111V, X128N-X158E, X016S-X158E, X104L-X158E, X128N-X186H, X159E-X209E, X062E-X101A, X111V-X209E, X148I-X188D, Х101А-X209E, X022A-X188D, X016S-X022A, X128N-X129E, X016S-X209E, X016S-X128N, X022A-X089P, X128N-X209E, X089P-X158E, X062E-X103G, X186H-X271F, X016S-X129E, X089P-X159E, X111V-X249R, Х101А-X129E, X148I-X209E, X022A-X159E, X129E-X249R, X129E-X209E, X104L-X129E, X128N-X188D, X111V-X158E, X022A-X158E, X062E-X209E, X062E-X249R, Х101А-X186H, X089P-X129E, X129E-X271F, X22A-X111V-X159E, X101A-X103G-X104L-X209E, X101A-X103G-X104L-X159E, X101A-X103G-X104L-X188D, X101G-X103A-X104I-X159D, X22A-X103G-X159E, X22A-X128N-X271F-X209E, X22A-X209E-X271F, Х22А-Х101А-Х209Е, X101A-X209E-X271F, X22A-X111V-X128N, Х22А-Х101А-X159E, X101A-X103G-X104L, X22A-X101A-X103G-X104L, X101A-X103G-X104L, X101G-X103A-X104I, X101A-X103G-X104L-X128N, X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X236H-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X245R-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X248D-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D, Х62Е-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X62E-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, Х22А-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X253R, X101G-X103A-X104I-X15 8Е-X232V-X245R-X248D-X249R, Х22А-X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X1041-X159E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X1041-X159D-X232V-X245R-X248D-X238R, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X76D и X101G-X103A-X104I-X159E-X232V-X245R-X248D-X271F; указанный вариант имеет общий суммарный заряд 0, -1, -2, -3, -4 или -5, предпочтительно 0, -1, -2 или -3, относительно В. lentus субтилизин GG36 протеазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. Эти варианты протеазы могут быть особо предпочтительными в водном промывном растворе с низкой ионной силой или низкими концентрациями моющих средств.

В одном аспекте указанного состава, указанный вариант протеазы содержит:

a) две или более из следующих мутаций X4R, X17R, X18R, X20R, X22R, X24R, X24W, X25R, X43R, X43A, X46R, X52F, X52N, X57R, X59A, X62Q, X71G, X75R, X76D, X78R, X82R, X86W, X89P, X89W, X89T, X89I, X89H, X89V, X104L, X106V, X106G, X115R, X118I, X121F, X144R, X185I, X197F, X209N, X209S, X217E, X231I, X239R, X239S, X241R, X242R, X242L, X243R, X244R, X248I, X249R, X252R, X253R, X271T, X271V, X271L, X271H, X271F, X271P, X1R, X9A, X212F и X269R; и/или

b) один или более, из следующих наборов мутаций X022R-X024R, X009A-X271L, X018R-X241R, X018R-X115R, X043R-X249R, X020R-X249R, X004R-X249R, X020R-X024R, X018R-X249R, X009A-X020R, X020R-X241R, X009A-X078R, X020R-X115R, X018R-X024R, X024R-X242R, X022R-X115R, X018R-X043R, X020R-X043R, X018R-X242R, X242R-X269R, X018R-X244R, X024R-X269R, X020R-X271L, X024R-X271L, X004R-X009A, X020R-X269R, X001R-X024R, X244R-X271L, X009A-X018R, X241R-X271L, X004R-X024R, X009A-X249R, X009A-X022R, X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X104I-X158E-X232V-X245R-X248D-X271F, X101G-X103A-X1041-X158E-X232V-X245R-X248D-X249R, X101G-X103A-X1041-X159D-X232V-X245R-X248D-X24R, X101G-X103A-X104L-X159D-X232V-X236H-X245R-X252K, X101G-X103A-X104L-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K; указанный вариант протеазы имеет общий суммарный заряд 0, +1, +2, +3, +4 или +5, предпочтительно имеет положительный общий суммарный заряд, наиболее предпочтительно +1, +2 или +3, относительно B. lentus субтилизин GG36 протеазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. Эти варианты протеазы могут быть особо предпочтительными в водном промывном растворе с высокой ионной силой или высокими концентрациями моющих средств.

В одном аспекте, указанная родительская протеаза может быть выбрана из группы, состоящей из ферментов, коммерчески доступных под торговыми марками Savinase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase Ultra®, Savinase Ultra®, Ovozyme® от Novozymes A/S (Denmark), тех, которые продают под торговыми марками Maxacal®, Properase®, Purafect®, FN3®, FN4®, Excellase® и Purafect ОХР® от Genencor International и тех, которые доступны от Henkel/Kemira, а именно BLAP(последовательность показана на Фигуре 29 патента США 5, 352, 604 со следующими мутациями S99D+S101R+S103A+V104I+G159S, в данной заявке имеет название BLAP) и BLAPX(BLAPcS3T+V4I+V205I).

В одном аспекте указанного состава указанный состав содержит вариант протеазы (например, вариант субтилизина), родитель которого имеет протеолитическую активность, указанный вариант протеазы содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1 на не более, чем 50, не более, чем 40, не более, чем 35, не более, чем 30, не более, чем 25, не более, чем 20, не более, чем 19, не более, чем 18, не более, чем 17, не более, чем 16, не более, чем 15, не более, чем 14, не более, чем 13, не более, чем 12, не более, чем 11, не более, чем 10, не более, чем 9, или не более, чем 8 аминокислотных остатков, при этом аминокислотные положения пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN', показанной в SEQ ID NO:2, как определено выравниванием аминокислотной последовательности варианта протеазы с Bacillus amyloliquefaciens субтилизин BPN' аминокислотной последовательностью, при этом вариант субтилизина содержит один из следующих наборов замещений:

(a) X101G-X103A-X104I-X159D-X232V-X236H-X245R-X248D-X252K; или

(b) X87N; или

(c) X87N-S101G-V104N; или

(d) X76D, X103A-X104L; или

(e) Y167A-R170S-A194P; или

(f) X87N-G118V-X129Q-X130A.

В одном аспекте указанного состава, указанный вспомогательный материал может содержать ингредиент, выбранный из группы, состоящей из: инкапсулята, содержащего отдушку, оттеночный агент, поверхностно-активные вещества, структурообразователи, хелатирующие агенты, агенты, ингибирующие перенос красителя, диспергаторы, дополнительные ферменты, стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливания, перекись водорода, источники перекиси водорода, предварительно сформированные перкислоты, полимерные диспергирующие агенты, агенты, удаляющие загрязнения и глину/ агенты против повторных отложений, осветлители, подавители ценообразования, красители, отдушки, эластификаторы структуры, смягчители ткани, носители, гидротропные агенты, технологические добавки, растворители, пигменты и их смеси.

В одном аспекте указанного состава, указанный состав может содержать вспомогательный материал, выбранный из группы, состоящей из:

a) инкапсулятов отдушки;

b) оттеночных агентов для тканей;

c) растворимых в холодной воде осветлителей;

d) катализатора отбеливания, который может включать металлический катализатор, такой, как катализатор переходных металлов, или более предпочтительно, материал, выбранный из группы, состоящей из иминий катионов, иминий полиинов; иминий цвиттерионов; модифицированных аминов; модифицированных аминоксидов; N-сульфонилиминов; N-фосфонилиминов; N-ацилиминов; тиадиазолдиоксидов; перфториминов; циклических сахарных кетонов и их смеси;

e) липаз первого промывания;

f) бактериальных чистящих целлюлаз;

g) неионных поверхносто-активных веществ Guerbet; и h) их смесей.

В одном аспекте указанного состава, указанный вариант протеазы содержит одну или более, или даже две или более из следующих мутаций A001R, Q002S, Q002M, Q002A, Q002R, Q002W, S003R, V004R, V004S, V004C, I008A, S009A, S009F, S009W, R010S, R010A ,R010H, R010M, Q012F, Q012R, P014K, P014F, P014Q, A015R, A015F, A016S, H017R, Н017М, H017F, N018R, N018K, G020F, G020K, G020R, T022A, T022R, T022Y, T022V, T022Q, T022L, T022W, G023A, G023S, G023F, S024R, S024F, S024W, S024Q, S024H, S024L, G025V, G025F, G025R, V026F, K027L, K027F, K027R, K027V, V028A, V028N, V028E, A029T, V030E, L031F, T033S, T033G, T033D, G034P, I035M, S036T, S036F, S036R, T038L, T038F, T038R, P040N, P040L, P040T, P040W, P040H, P040R, L042I, N043A, N043F, N043I, N043S, N043R, N043M, N043W, N043D, R045T, G046R, A048R, F050C, V051W, V051F, V051H, P052F, P052E, P052N, P055Y, T057R, Q059A, Q059F, Q059R, D060P, D060Q, D060A, N062E, N062Q, G063V, G063M, G063T, G063I, G063A, G063S, G063H, G063Q, G063D, G063E, G063P, H064F, H064T, V068A, V068C, A069N, A069T, A069P, A069W, T071G, I072C, A074C, L075A, L075F, L075E, L075R, N076D, S078R, S078N, S078I, I079W, I079Q, V081R, L082F, L082T, L082V, L082R, L082M, A085M, P086W, P086L, P086I, E089P, E089T, E089G, E089H, E089L, E089V, E089W, E089F, E089I, Y091N, Y091F, A092F, K094N, S099F, S099T, S099P, S099G, S099M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, I107M, I107F, A108I, A108G, Q109M, L111V, L111I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, N116K, N116A, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, H120A, H120