Средства для лечения заболевания

Средства для лечения заболевания

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к средствам для лечения заболевания и, в частности, для лечения посредством активации регуляторных T-клеток CD4+CD25+ с участием рецептора поверхностного рецептора T-клеток CD4. Изобретение относится к способам скрининга для идентификации таких средств, к средствам, способным активировать регуляторные T-клетки CD4+CD25+, и к их применению для лечения заболевания, в частности аутоиммунных заболеваний, а также в способах, осуществляемых in vitro.

Уровень техники

T-клетки относятся к лимфоцитам и ответственны за ряд ключевых функций в иммунной системе. У млекопитающих T-клетки (тимоциты) дифференцируются в тимусе из гематопоэтических клеток-предшественников, образованных в костном мозге. Частью процесса дифференцировки является экспрессия поверхностных рецепторов, главным образом гликопротеидов CD4 и CD8. T-клетки, экспрессирующие CD4, так называемые T-клетки CD4+, связывают комплексы MHC II (Reinerz and Schlossman, Cell 19, 821-827 (1980); Reinerz et al., PNAS USA 77, 1588-1592 (1980)), тогда как T-клетки CD8+ связывают комплексы MHC класса I (Fitch, Microbiol. Rev. 50, 50-69 (1986)). T-клетки высвобождаются в кровь и лимфу.

Позитивные CD4-клетки могут дифференцироваться в субпопуляции T-хелперов (Th1 и Th2), а также в регуляторные T-клетки. Регуляторные T-клетки можно дополнительно разделить на подклассы, при этом наиболее охарактеризованы происходящие из тимуса (nTreg) и индуцированные T-клетки (iTreg).

Хотя существуют другие субпопуляции Treg, такие как, например, Tr1 или Th3, настоящее изобретение относится к CD4-позитивным образуемым в тимусе Treg (nTreg) и индуцированным Treg, при этом оба типа экспрессируют фактор транскрипции Foxp3. В качестве основного отличия Foxp3 стабильно и непрерывно экспрессируется в nTreg, поддерживая необратимый фенотип Treg, тогда как в индуцированных Treg наблюдается индуцируемая или временная экспрессия Foxp3, которая является обратимой.

Treg секретируют иммуномодулирующие цитокины, такие как IL-10, TGF-бета или IL-35, и проявляют супрессорную активность по отношению к эффекторным T-клеткам посредством нескольких механизмов, например, посредством супрессии продукции провоспалительных цитокинов, прямого межклеточного контакта и модулирования состояния активации или функции антигенпрезентирующих клеток (АПК) (Shevach et al. Immunity (2009) 30; 636-645). Основным характерным признаком CD4-позитивных CD25 Treg-клеток является их анергический фенотип, означающий, что они не пролиферируют при стимуляции TCR, что может быть восстановлено при добавлении экзогенного IL-2.

Главная роль Treg состоит в поддержании гомеостаза в отношении иммунных реакций и аутотолерантности. Дисфункция Treg коррелирует с аутоиммунными заболеваниями.

Обычно регуляторные T-клетки могут быть выделены благодаря гликопротеинам поверхностных рецепторов CD4, CD25 и охарактеризованы по внутриклеточному окрашиванию FOXP3. Дополнительным поверхностным белком является CD127 (IL-7 R), который подвергается понижающей регуляции в клетках Treg и может быть использован для дальнейшей очистки Treg. Кроме того, экспрессия CD39 (эндонуклеотидазы) (Borselino et al., Blood (2007) 110, 1225-1232) или GARP (преобладающие повторы гликопротеина A (GARP или LRRC32) (Wang et al., PNAS (2009) 106, 32, 13439-13444).

CD4 человека кодируется хромосомой 12 и относится к надсемейству иммуноглобулинов (Ig). Его природная функция в качестве поверхностного рецептора T-клеток связана с активацией T-клеток при связывании MHC-комплексов класса II. Кроме того, CD4 может связывать белок gp120 ВИЧ-1, белок P4HB/CDI и капсидные белки вируса герпеса человека HHV-7. Также сообщалось о взаимодействии с белками gp120 и Vpu ВИЧ-1. CD4 содержит 458 аминокислот. Пептидная последовательность показана на фигуре 1.

База данных UniProt, вход P01730, выдает доменную структуру CD4, которая показана ниже в таблице 1 и на фигуре 6. Первые 25 аминокислот являются сигнальным пептидом, который отщепляется в биологически активной форме. Положения 26-396 составляют внеклеточный домен, за которым следует трансмембранная область, положения 397-418. Asn₂₉₆ и Asn₃₂₅ являются известными сайтами гликозилирования (Konig et al., J. Biol. Chem. 263, 9502-9507 (1988); Carr et al., J. Biol. Chem. 264, 21286-21295 (1989)).

Последняя часть, положения 419-458 относится к цитоплазматическому домену. В этой части находится сайт связывания тирозиновой протеинкиназы LCK (p56^lck) (Rudd et al, PNAS USA 85, 5190-5194 (1988); Veillette et al., Cell 55, 301 (1988)), которая является частью пути передачи сигнала, активируемого лигандами, связывающимися с CD4.

Таблица 1Таблица, в которой показана доменная структура CD4 (согласно UniProt P01730)
Характерный признак	Положения	Длина	Описание
Сигнальный пептид	1-25	25
Цепь	26-458	433	Поверхностный гликопротеин T-клеток CD4
Топологический домен	26-396	371	Внеклеточный
Трансмембранная область	397-418	22	Предполагаемый
Топологический домен	419-458	40	Цитоплазматический (предполагаемый)
Домен	26-125	100	Ig-подобный V-типа
Домен	126-203	78	Ig-подобный C2-типа 1
Домен	204-317	78	Ig-подобный C2-типа 2
Домен	318-374	78	Ig-подобный C2-типа 3
Область	427-455	29	Чувствительный к Vpu ВИЧ-1 домен
Сайт гликозилирования	296	1	NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
Сайт гликозилирования	325	1	NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
Дисульфидная связь	41 ↔ 109
Дисульфидная связь	155 ↔ 184
Дисульфидная связь	328 ↔ 370
Сайт липидизации	419	1	S-пальмитоилцистеин
Сайт липидизации	422	1	S-пальмитоилцистеин

Внеклеточная часть содержит 4 подобных иммуноглобулину домена. Первый домен, N-концевой домен, содержащий положения 26-125, является Ig-подобным доменом V-типа. На основе гомологии с антителами он имеет три гомологичных области, определяющие комплементарность антигену, CDR1, CDR2 и CDR3 (Ashkenazi et al., PNAS USA 87, 7150-7154 (1990)) (см. фигуру 6). Участки CDR1 и CDR2 вовлечены в связывание молекул MHC класса II (Moebius et al., PNAS USA 89, 12008-120012 (1992)), белка оболочки ВИЧ-1 gp120 (Moebius et al., J. Exp. Med. 176, 507-517 (1992)) и анти-CD4-антител (Lanza et al., PNAS USA 90, 11683-11687 (1993)). Phe₆₈ в CDR2 играет ключевую роль в распознавании и связывании молекул MHC класса II и белка оболочки ВИЧ-1 gp120 (Sharma et al., Biochemistry 44, 16192-16202 (2005)). Все известные лиганды CD4 связываются с N-концевым Ig-подобным доменом V-типа.

Механизм того, как работают регуляторные T-клетки, полностью не выяснен. Treg CD4⁺CD25⁺ ингибируют поликлональную и антигенспецифичную активацию T-клеток. Супрессия может быть опосредована, например, зависимым от клеточных контактов механизмом, который регулирует активацию Treg CD4⁺CD25⁺ через TCR, но Treg не проявляют пролиферативного ответа при активации TCR или стимуляции митогенными антителами (анергические) (Shevach, Nature Rev. Immunol. 2: 389 (2002). После стимуляции они становятся компетентными в отношении супрессии независимым от антигена образом ответа T-клеток CD4+ и T-клеток CD8+, а также ингибирования активации B-клеток и клональной экспансии.

Способность регуляторных T-клеток CD4+CD25+ оказывать регулирующее влияние на активность иммунной системы натолкнула на мысль о признании их в качестве потенциальной мишени для лечения заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, при которых требуется контролировать иммунную систему.

Аутоиммунитет означает неспособность организма распознавать собственные составляющие части (вплоть до субмолекулярных уровней) как «свое», что приводит к иммунной реакции против его собственных клеток и тканей. Любое заболевание, которое возникает в результате такой аномальной иммунной реакции, называют аутоиммунным заболеванием. Аутоиммунные заболевания включают рассеянный склероз (РС), ревматоидный артрит (РА), псориаз, псориатический артрит, язвенный колит, болезнь Крона, сахарный диабет типа I (T1D), тяжелую псевдопаралитическую миастению (MG), аутоиммунный полигландулярный синдром типа II (APS-II), тиреоидит Хашимото (HT), системную красную волчанку (СКВ), синдром Шегрена и аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALS).

Аутоиммунное заболевание возникает, когда T-клетки распознают и реагируют на «собственные» молекулы, то есть молекулы, продуцируемые клетками хозяина. Активация «аутореактивных» T-клеток в результате презентации аутоантигенов, процессированными антигенпрезентирующими клетками (АПК), приводит к их клональной экспансии и миграции к специфичным тканям, где они индуцируют воспаление и разрушение ткани.

Супрессия такой функции эффекторных T-клеток с использованием иммуносупрессивных лекарственных средств является основной терапевтической методикой, которую успешно применяли для лечения аутоиммунных заболеваний. Однако такие лекарственные средства индуцируют общую иммунную супрессию вследствие их плохой избирательности, приводя к ингибированию не только опасных функций иммунной системы, но также и полезных функций. Как следствие могут возникать некоторые риски, подобные инфекции, злокачественной опухоли и токсичности лекарственных средств.

В общем, установлено, что T-клетки CD4⁺ играют основную роль в инициации и поддержании аутоиммунитета. Соответственно, было предложено применение мАт против поверхностных молекул Т-клеток CD4⁺ и, в частности, анти-CD4-мАт, в качестве иммуносупрессивных средств. Хотя многочисленные клинические исследования подтвердили потенциальный интерес к такому подходу, они также подняли несколько проблем, которые необходимо учитывать, чтобы получать анти-CD4-мАт, более подходящие для применения в обычной клинической практике.

Предложено несколько разных механизмов действия CD4-мАт, включая: (1) антагонизм взаимодействий CD4-MHC II, приводящий к ингибированию активации T-клеток, (2) модулирование рецептора CD4, которое определяют по уменьшению экспрессии CD4 на поверхности клеток, (3) частичная передача сигнала через рецептор CD4 в отсутствие перекрестного связывания T-клеточных рецепторов, что может супрессировать последующую активацию T-клеток и запускает апоптозную гибель T-клеток CD4, (4) Fc-опосредованная зависимая от комплемента цитотоксичность (CDC) или опосредованная антителами клеточная цитотоксичность (ADCC), приводящая к истощению T-клеток CD4, и (5) стимуляцию регуляторных T-клеток.

Несколько анти-CD4-антител, мишенью которых являются T-клетки проходят клинические испытания (Schulze-Koops et al., J Rheumatol. 25(11): 2065-76 (1998); Mason et al., J Rheumatol. 29(2): 220-9 (2002); Choy et al., Rheumatology 39(10): 1139-46 (2000); Herzyk et al., Infect Immun. 69(2): 1032-43 (2001); Kon et al., Eur Respir J. 18(1): 45-52 (2001); Mourad et al., Transplantation 65(5): 632-41 (1998); Skov et al., Arch Dermatol. 139(11): 1433-9 (2003); Jabado et al., J Immunol. 158(1): 94-103 (1997)), главным образом, с целью истощения популяции клеток CD4 с использованием только некоторых CD4-антител, которым приписывают другие механизмы, подобных TRX-1, TNX-355, IDEC-151, OKTcdr4A.

Способ применения средств, направленных на активацию регуляторных T-клеток, для терапии аутоиммунных заболеваний признан чрезвычайно сложным. Активация Treg через TCR с использованием агонистического анти-CD3-антитела OKT-3 (Abramowicz et al., N. Engl. J Med. 1992 Sep 3; 327(10): 736) или через костимулирующую молекулу CD28 с использованием суперагонистического анти-CD28-антитела TGN 1412 приводит к полному истощению популяции регуляторных T-клеток, а также других обычных T-клеток и к системной индукции и высвобождению избыточных количеств провоспалительных цитокинов, включая IFN-γ, TNF-α, IL-1 и IL-2, приводя к клинически выраженному синдрому высвобождения цитокинов (CRS) у человека (Suntharalingam et al., N. Engl. J Med. 2006 Sep 7; 355(10): 1018-28).

Однако недавно в WO2004/083247 были описаны гуманизированные анти-CD4-антитела, которые способы активировать регуляторные T-клетки CD4+CD25+. Антитела, описанные в WO2004/083247, представляют собой гуманизированные варианты антитела mB-F5 мыши, IgG1 мыши против CD4 человека, описанного Racadot et al. (Clin. Exp. Rheum., 10, 365-374 (1992)). Эпитоп mB-F5 сообщен в публикации Racadot et al., как охватывающий Ig-подобные домены C2 типа 1 и типа 2 CD4 человека от аминокислоты 162 до аминокислоты 232, который показан на фигуре 6.

Последующие клинические испытания, описанные в WO2009/112502, WO2009/121690, WO2009/124815 и WO2010/034590, с использованием таких антител, названных BT061 (гуманизированные моноклональные IgG1) привели к успешному лечению пациентов, страдающих от псориаза и ревматоидного артрита, и стали доказательством того, что такими антителами можно лечить аутоиммунные заболевания безопасно и с высокой эффективностью.

Достигнутые многообещающие клинические результаты повысили интерес к получению дополнительных терапевтических средств, обладающих сходными свойствами. Поэтому целью настоящего изобретения являются способы скрининга для идентификации таких средств и получение дополнительных терапевтических средств.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу скрининга молекулы, способной связываться с CD4, включающему:

(a) получение одной или нескольких молекул-кандидатов;

(b) определение того способны ли одна или несколько молекул-кандидатов связываться с одной или несколькими из следующих областей CD4 человека: аминокислотами 148-154, аминокислотами 164-168 и аминокислотами 185-192; и

(c) отбор молекулы, определенной на стадии (b) как способной связываться с CD4.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что гуманизированное антитело BT061 связывается с доменом CD4, который ранее не был выявлен в качестве сайта связывания лиганда. Такое открытие особенно неожиданно с учетом того, что было известно в данной области в качестве эпитопа для антитела mB-F5 мыши, из которого получено BT061. Авторы настоящего изобретения также установили остатки BT061, которые вовлечены в связывание молекулы CD4, и неожиданно обнаружили, что не все CDR BT061 вовлечены в связывание CD4.

Идентификация области связывания и подробностей механизма связывания позволила разработать дополнительные способы скрининга и антитела и фрагменты антител, способные активировать регуляторные T-клетки CD4+CD25+.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу скрининга антитела или фрагмента антитела, способного связываться с CD4, включающему:

(a) получение антитела или фрагмента антитела, содержащего CDR1 и CDR2 легкой цепи BT061 и CDR1 и CDR3 тяжелой цепи BT061, необязательно, с аминокислотными заменами в последовательностях CDR, при условии, что:

(i) CDR1 легкой цепи содержит: Ser32, Gly33 и Tyr 34;

(ii) CDR2 легкой цепи содержит: Leu54 и Ile57;

(iii) CDR1 тяжелой цепи содержит Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 или Tyr31; и

(iv) CDR3 тяжелой цепи содержит Tyr103, Phe103 или His103; Arg104; Tyr105; Asp106 и Tip110, Phe110, His110 или Tyr110;

(b) определение того, способно ли антитело или фрагмент антитела связываться с CD4, и

(c) отбор антитела или фрагмента антитела, определяемого на стадии (b) как способного к связыванию с CD4,

при этом антитело или фрагмент антитела не содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи BT061 и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи BT061.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу или фрагменту антитела, способному активировать регуляторные T-клетки CD4+CD25+, включая антитело или фрагмент антитела, способный активировать регуляторные T-клетки CD4+CD25+, содержащий CDR1 и CDR2 легкой цепи BT061 и CDR1 и CDR3 тяжелой цепи BT061 необязательно с аминокислотными заменами в последовательностях CDR, при условии, что:

(i) CDR1 легкой цепи содержит: Ser32, Gly33 и Tyr34;

(ii) CDR2 легкой цепи содержит: Leu54 и Ile57;

(iii) CDR1 тяжелой цепи содержит Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 или Tyr31; и

(iv) CDR3 тяжелой цепи содержит Tyr103, Phe103 или His103; Arg104, Tyr105, Asp106; и Trp110, Phe110, His110 или Tyr110,

и при этом антитело или фрагмент антитела не содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи BT061 и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи BT061.

Изобретение будет только проиллюстрировано посредством примера со ссылкой на следующие чертежи.

На фигуре 1 показана пептидная последовательность (SEQ ID NO:1) и дисульфидные мостики CD4 человека (UniProt ID P01730).

На фигуре 2A показана пептидная последовательность (SEQ ID NO:2) легкой цепи гуманизированного антитела BT-061. Остатки CDR показаны в прямоугольниках (CDR1: SEQ ID NO:4, CDR2: SEQ ID NO:5 и CDR3: SEQ ID NO:6). Остатки, окруженные пунктирными рамками не представлены кристаллической структурой.

На фигуре 2B показана пептидная последовательность (SEQ ID NO:3) тяжелой цепи гуманизированного антитела BT-061. Остатки CDR показаны в прямоугольниках (CDR 1: SEQ ID NO:7, CDR2: SEQ ID NO:8 и CDR3: SEQ ID NO:9). Остатки, окруженные пунктирными рамками не представлены кристаллической структурой.

На фигуре 3 представлено изображение асимметрической единицы кристаллической структуры CD4-BT061.

На фигуре 4 представлено изображение кристаллической структуры CD4-BT061, совмещенной с кристаллической структурой комплекса CD4 с молекулой MHC класса II (PDB, код 1JL4).

На фигуре 5 представлено изображение кристаллической структуры CD4-BT061, совмещенной с кристаллической структурой комплекса CD4 с белком ВИЧ-1 gp120 (PDB, код 2NY1). Последний, кроме того, связан с антителом 17b.

На фигуре 6 показана пептидная последовательность (SEQ ID NO:1) и доменная структура CD4 человека (Uniprot ID P01730).

На фигуре 7 представлено изображение сайта связывания BT061 на поверхности CD4. Все показанные аминокислоты являются частью Ig-подобного домена С2-типа 1, за которым следует N-концевой Ig-подобный домен V-типа.

На фигуре 8 представлена аминокислотная последовательность легкой цепи BT061 (SEQ ID NO:2). Аминокислоты, вовлеченные в связывание с CD4, указаны круглыми рамками.

На фигуре 9 представлена аминокислотная последовательность тяжелой цепи BT061 (SEQ ID NO:3). Аминокислоты, вовлеченные в связывание с CD4, указаны круглыми рамками.

На фигуре 10 представлено изображение сайта связывания BT061 на поверхности CD4. Аминокислоты, образующие карман связывания для Tyr₁₀₅ тяжелой цепи BT061, обведены кругом.

На фигуре 11 представлено изображение сайта связывания BT061 на поверхности CD4. Аминокислоты, образующие карман связывания для Arg₁₀₄-Asp₁₀₆ тяжелой цепи BT061, обведены кругом.

На фигуре 12 представлено изображение сайта связывания BT061 на поверхности CD4. Аминокислоты, образующие карман связывания для Tyr₃₄ легкой цепи BT061, обведены кругом.

Подробное описание изобретения

Способы скрининга

Настоящее изобретение относится к способам скрининга одной или нескольких молекул, способных связываться с CD4, и предпочтительно, с CD4 человека. Как указано выше, информация, приведенная в настоящей публикации, описывает взаимодействие между CD4 и антителом BT061, которое способно активировать регуляторные T-клетки CD4+CD25+. В частности, BT-061 связывается как с T-хелперными, так и регуляторными T-клетками и избирательно активирует регуляторные T-клетки без активации T-хелперных клеток. Знание структур BT061 и того, как они взаимодействуют с внеклеточной областью CD4 дает возможность конструировать и получать средства со свойствами, сходными со свойствами BT061 в отношении связывания CD4 и избирательной активации регуляторных T-клеток.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга молекулы, способно связываться с CD4, включающему: (a) получение одной или нескольких молекул-кандидатов; и (b) определение того, способна ли одна или несколько молекул-кандидатов связываться с одной или несколькими из следующих областей или аминокислот CD4 человека: аминокислотами 148-154, аминокислотами 164-168 и аминокислотами 185, 187, 189, 190 и 192; (c) отбор молекулы, определенной на стадии (b) как способной связываться с CD4. Более конкретно, области CD4 человека представляют собой аминокислоты 148-154, аминокислоты 164-168 и аминокислоты 185-192.

В одном из вариантов осуществления стадии (a)-(c) могут быть осуществлены с использованием компьютерной системы, и взаимодействие между CD4 и одной или несколькими молекулами-кандидатами может быть смоделировано на основе информации, полученной при этом в отношении взаимодействия между BT061 и CD4 человека, т.е. скрининг осуществляют посредством выполняемого с помощью компьютера конструирования молекул. В частности, трехмерную структурную модель CD4, и в частности, его внеклеточной области, создают в компьютерной системе, используя взаимодействие аминокислотной последовательности по меньшей мере для части CD4, и компьютерную программу, известную специалисту в данной области, например, Discovery Studio (Accelrys®) или Benchware 3D Explorer (Tripos). Указанные программы, кроме того, позволяют осуществлять ввод или создание de novo последовательности и/или структурной информации об одной или нескольких молекулах-кандидатах. Затем можно исследовать способность молекулы-кандидата связываться с областями, важными для связывания BT061 (которые обсуждаются ниже).

В частности, способ скрининга молекулы, способной связываться с CD4, может включать стадии (a) и (b): (i) введение в компьютерную систему или программу аминокислотой последовательности CD4, содержащей по меньшей мере аминокислоты 148-154, 164-168 и кислоты 185, 187, 189, 190 и 192; (ii) создание трехмерной модели полипептида или пептида, кодируемого аминокислотной последовательностью; (iii) создание или введение трехмерной структуры одной или нескольких молекул-кандидатов; и (iv) имитация взаимодействия между аминокислотными последовательностями CD4 и молекулы-кандидата, чтобы определить, способна ли молекула-кандидат связываться с CD4 посредством аминокислот 148-154, 164-168 и аминокислот 185, 187, 189, 190 и 192.

Отбор молекул-кандидатов может быть дополнительно ограничен с учетом признаков взаимодействия CD4-BT061, описанных ниже в примере 1. В частности, молекулы-кандидаты могут быть ограничены молекулами, которые связываются с областями CD4 без солевых мостиков, и/или молекулами, которые содержат один или несколько компонентов, которые размещаются в одном или нескольких карманах для связывания на поверхности CD4, включая:

(i) аминокислотные остатки S152, V153, Q154, Q164, G165, T185, V186, L187 и K192 CD4 (которые показаны на фигуре 10);

(ii) аминокислотные остатки S150, S152, G165 и G166 CD4 (которые показаны на фигуре 11); и/или

(iii) аминокислотные остатки S150, P151, S152 и K167 (которые показаны на фигуре 12).

Способ согласно такому осуществляемому с помощью компьютера варианту может дополнительно включать стадию (d), на которой получают молекулу, отобранную на стадии (c). Например, когда отобранная молекула представляет собой пептид, аминокислотную последовательность пептида получают на основе данных компьютера и производят пептид in vitro. Затем активность отобранной молекулы можно оценить in vitro благодаря контакту отобранной молекулы с пептидом или полипептидом, содержащим соответствующие области/аминокислоты CD4, или благодаря контакту отобранной молекулы с клеткой, экспрессирующей CD4. Такие стадии in vitro дополнительно описаны ниже в связи с вариантом осуществления первого аспекта, в случае которого стадии (a)-(c) осуществляют in vitro.

В частности, в качестве альтернативы осуществляемому с помощью компьютера варианту, описанному выше, стадии (a)-(c) способа скрининга могут быть осуществлены in vitro, и стадия (b) может включать осуществление контакта одной или нескольких молекул-кандидатов с соответствующими областями/аминокислотами CD4 и определение того способна ли молекула-кандидат связываться с одной или несколькими такими областями. Пример такого варианта осуществления включает способ скрининга одной или нескольких молекул, способных связываться с CD4, включающий: (a) осуществление контакта одной или нескольких молекул с пептидом, содержащим одну или несколько из следующих областей CD4 человека: аминокислоты 148-154, аминокислоты 164-168 и аминокислоты 185-192; и (b) выявление того связывается ли одна или несколько молекул с одной или несколькими областями пептида,

при этом молекула не содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи BT061 и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи BT061.

Способ согласно настоящему изобретению, предпочтительно, включает скрининг библиотеки молекул. В частности, библиотека может представлять собой библиотеку в фаговом дисплее, полученную согласно способам, известным в данной области. Библиотека может представлять собой библиотеку пептидов, отражающую системное сочетание разных аминокислот/пептидов в большом количестве. Обычно библиотеку пептидов синтезируют на твердой фазе, главным образом на смоле, которая может быть изготовлена в виде плоской поверхности или шариков (твердофазный синтез пептидов). Такую библиотеку можно использовать для белок-белковых взаимодействий, обнаружения лекарственных средств, очистки белков и изменения последовательности распознавания антител, чтобы создавать варианты антител с разными аффиностями.

Кроме того, библиотеки кроме фагового дисплея включают дрожжевой дисплей, бактериальный дисплей, мРНК-дисплей, рибосомный и полисомный дисплей. Рибосомный дисплей основан на процессе, результатом которого являются транслированные белки, которые связаны с их мРНК-предшественником, который был использован, в виде комплекса для связывания с иммобилизованным лигандом на стадии отбора. мРНК-дисплей в результате дает транслированные пептиды или белки, которые связаны с их мРНК-предшественником посредством связи с пуромицином.

В случае методики презентирования в виде бактериального дисплея библиотека полипептидов, представляемых на поверхности бактерий, может быть подвергнута скринингу с использованием проточной цитометрии или многократных процедур селекции (биопэннинг).

В способе дрожжевого дисплея (Abbott) представляющий интерес белок презентирован в виде слияния с белком Aga2p на поверхности дрожжей. В природе белок Aga2p используется дрожжами для опосредования межклеточных контактов во время спаривания дрожжевых клеток. Как таковой, дисплей белка через Aga2p отодвигает белок от клеточной поверхности, минимизируя возможные взаимодействия с другими молекулами на клеточной стенке дрожжей. Применение магнитного разделения и проточной цитометрии в сочетании с библиотекой в виде дрожжевого дисплея является высокоэффективным способом выделения высокоаффинных белковых лигандов для почти любого рецептора посредством направленной эволюции.

Полисомный дисплей содержит очень большую библиотеку пептидов, представленных на бактериальных полисомах (Mattheakis et al., 1994). Методику пептидов MULTIPIN® также можно применять для создания библиотек (Tribbick et al., J Immunl. Methods (2002) 267: 27-35).

На стадии контактирования in vitro отобранная молекула или молекула-кандидат может быть подвергнута контакту с пептидом или полипептидом, содержащим одну или несколько из следующих областей или аминокислот («соответствующих областей/аминокислот CD4») CD4 человека: аминокислоты 148-154, аминокислоты 164-168 и аминокислоты 185, 187, 189, 190 и 192, при этом аминокислоты пронумерованы как показано на фигуре 6. Предпочтительно, области CD4 человека представляют собой: аминокислоты 148-154, аминокислоты 164-168 и аминокислоты 185-192. Более предпочтительно, пептид или полипептид содержит все указанные области. Еще более предпочтительно, пептид или полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислот CD4 человека: Lys26, Arg156, Arg159, Lys161 и Lys192. Более предпочтительно, пептид или полипептид содержит Ig-подобный домен C2-типа 1 CD4 человека (т.е. аминокислоты 126-205) и необязательно также Ig-подобный домен V-типа. В частности, D1 CD4 используется для стабилизации эпитопа. Соответственно, когда пептид или полипептид необходимо использовать в анализе конкурентного связывания, предпочтительно, использование D1. Однако следует отметить, что одна или две аминокислоты из указанных областей могут быть удалены. Предпочтительно, чтобы пептид имел длину менее 50 аминокислот и, более предпочтительно, имел длину менее 20 аминокислот.

Пептиды могут представлять собой природные пептиды, например пептиды, полученные при ферментативном расщеплении CD4 или непосредственно при экспрессии клеткой-хозяином, или они могут представлять собой синтетические пептиды. Пептиды также могут быть модифицированы, например, пегилированием, фосфорилированием, амидированием, ацетилированием, мечением биотином или флуоресцирующими красителями, такими как ФИТЦ, или мечением изотопами. Дополнительные модификации можно получить с использованием методик, подобных «нанесению множественных антигенных пептидов». С использованием такой методики можно получить высокий титр антител против пептида и синтетические пептидные вакцины. В такой системе используют α- и ε-аминогруппы лизина для образования остова, с которым могут быть связаны множественные пептидные цепи. В зависимости от количества лизиновых ярусов можно синтезировать разное количество пептидных ветвей. Это исключает необходимость в конъюгировании антигена с белком-носителем (Briand et al., J. Immunol. Methods (1992). 156; 2: pp 255-265).

Как показано выше, способы согласно настоящему изобретению, предпочтительно, осуществляют с использованием пептидных последовательностей из CD4 человека. Однако в равной мере они могут быть осуществлены с использованием гомологичных областей белков CD4 других млекопитающих или с использованием других молекул, содержащих Ig-подобный домен C2-типа 1.

Стадию осуществления контакта одной или нескольких молекул, отобранной молекулы или молекулы-кандидата с пептидом и стадию выявлении того, связывается ли одна или несколько молекул с одной или несколькими областями пептида можно осуществить согласно способам, известным в данной области. В частности, в одном варианте осуществления изобретения пептид представляет собой линейный пептид, который нанесен пятнами или фиксирован на мембране. Во время стадии контактирования молекулы, которые способны связываться с пептидной последовательностью CD4, оказываются захваченными.

В альтернативном варианте создают пептиды, которые могут имитировать конформацию эпитопа CD4 человека дикого типа. Это можно осуществить способами конструирования молекул на основе структуры, известными в данной области.

Ниже указаны способы дисплея, которые можно использовать для скрининга:

Для скрининга линейных эпитопов можно использовать методику картирования эпитопов. Аминокислотные последовательности, представляющие части эпитопа мишени (например, 10-15 аминокислот), которые перекрывается одной аминокислотой, наносят пятнами на мембрану (например, целлюлозную). Затем можно осуществлять скрининг в отношении белков или пептидов, распознающих нанесенные в виде пятен аминокислотные последовательности. Можно провести несколько раундов селекции в разных условиях жесткости, чтобы отобрать вещества, связывающиеся с высокой аффинностью.

Для скрининга в отношении прерывистых эпитопов разработаны такие методики, как фаговый дисплей. Современные стандартные библиотеки линейных или циклических пептидов содержат многообразие независимых клонов, примерно 10⁹, при этом подразумевается, что библиотеки, имеющие до семи рандомизированных положений, теоретически могут гарантировать исчерпывающий охват возможного репертуара последовательностей. Системы трансляции in vitro дают библиотеки пептидов с более высоким разнообразием, так как связывание пептида с его мРНК достигается в бесклеточной системе, включающей небольшие частицы комплексов РНК/пептид/рибосома или только мРНК/пептид. Следующие библиотеки включают основанный на полисомах или рибосомах дисплей (Mattheakis et al., PNAS 1994; 91 (19): 9022-6) или методику PROfusion (Roberts and Szostak, PNAS (1997) 94(23): 12297-302). Последняя методика включает ковалентное слияние между мРНК и пептидом или белком, который она кодирует, которое может быть образовано при трансляции in vitro синтетической мРНК, которая несет пуромицин, антибиотик, являющийся акцептором пептидила, на своем 3'-конце.

Также возможен дисплей на основе миниклеток (патент США № 7125679), который содержит препарат пептидов для скрининга, которые экспрессированы на наружной поверхности, содержащей библиотеку олигонуклеотидов. Подобным образом также можно использовать библиотеку случайных пептидов Flitrix (Invitrogen Corp.), в которой используют белок жгутиков бактерий FliC и тиоредоксин.

Кроме того, также как указанные выше способы дисплея, можно использовать масс-спектрометрию или извлечение эпитопов с твердой фазы (SPHERE) (Genzyme) (Lawendowski et al., J. Immunol., (2002) 169: 2414-2421).

В одном из вариантов осуществления выявление связывания включает использованием рентгеновской кристаллографии или ЯМР. В частности, могут быть отобраны молекулы, которые связываются с пептидом без образования солевого мостика, с использованием рентгеновской кристаллографии, которая известна в данной области.

Альтернативно или дополнительно способ согласно первому аспекту может включать осуществление контакта отобранной молекулы или молекулы-кандидата с клеткой, экспрессирующей CD4, и, в частности, регуляторной T-клеткой CD4+CD25+. Это можно осуществлять, в частности, для определения способности отобранной молекулы или молекулы-кандидата модулировать активность и, в частности, активировать регуляторные T-клетки CD4+CD25+ (предпочтительно, избирательно активировать клетки Treg без активации T-хелперных клеток), или для определения способности отобранной молекулы или молекулы-кандидата уменьшать или осуществлять понижающее модулирование экспрессии рецептора CD4, в частности, на специфичных популяциях лимфоцитов в культуре in vitro PBMC (мононуклеарных клеток периферической крови). В таких вариантах осуществления, предпочтительно, отобранная молекула или молекула-кандидат представлена антителами или фрагментами антител, и в частности антителами IgG1-типа, как обсуждается ниже.

Для анализа модулирования Treg, в общем, могут быть выделены с использованием коммерчески доступных наборов для выделения (выделение на магнитных шариках), сортировки в отношении CD25, CD27, CD62L и/или CD127 и дополнительного внутриклеточного окрашивания в отношении FoxP3. Treg являются негативными по CD127, позитивными по CD25 и Foxp3. CD39, связанная с клеточной поверхностью эктонуклеотидаза, также может быть использована для очистки Treg с сильными супрессорными функциями (Mandapathil et al., J Immunol. Methods (2009). 346 (1-2), 55-63). В коммерчески доступных наборах может быть использована негативная селекция CD4+ с последующим позитивным выделением позитивных по CD25 клеток с получением в результате популяции позитивных по CD4 и CD25 клеток. Полученные клетки могут быть дополнительно обработаны. CD25 и фактор транскрипции Foxp3 являются маркерами экспрессии, связанными с супрессорной функцией Treg. Хотя внутриклеточное окрашивание Foxp3 подтверждает регуляторный фенотип, вследствие внутриклеточного окрашивания клетки не жизнеспособны для дальнейшего терапевтического применения. Foxp3 обычно используют в качестве внутриклеточного маркера активированных Treg/функционально активных Treg.

Кроме того, вследствие того факта, что BT061 и молекула, отбираемая при скрининге, связывается с эпитопом, который отличается от эпитопа, связываемого другими коммерчески доступными антителами, можно очистить Treg с использованием коммерчески доступных наборов для выделения (выделение на магнитных шариках), и дополнительно другого CD4-антитела (например, SK-3 OKT4), которое не конкурирует за сайт связывания BT061 на CD4, и затем проанализировать активацию Treg с использованием молекулы-кандидата или отобранной молекулы.

Способность молекулы-кандидата активировать Treg можно анализировать исследуя супрессорную активность Treg после контакта с молекулой-кандидатом посредством совместного культивирования Treg с CD4-позитивными CD25-негативными эффекторными T-клетками. Активированные Treg способны ингибировать пролиферацию эффекторных Т-клеток CD4+CD25-, которые могут быть мечены CFSE (оценка экспансии клеток посредством анализа разведения CFSE). Альтернативно, пролиферацию эффекторных клеток можно определить по включению [³H]-тимидина.

Более конкретно, способность к супрессии можно оценить, например, используя реакцию смешанных лимфоцитов (MLR). Клеточное деление эффекторных T-клеток может быть ингибировано супрессорным действием Treg. Для этого “наивные” аутологичные T-клетки-респондеры CD4+CD25- стимулируют облученными аллогенными стимулирующими PBMC. Treg или обычные T-клетки титруют в культуре, и пролиферацию можно оценить по включению тимидина.

Активацию Treg также можно оценить путем определения продукции циклического АМФ (как описано в WO 2008/092905).

Цитокины, на которые влияют активированные Treg в совместной культуре, также могут быть измерены для определения активности таких клеток по отношению к эффекторным клеткам. Например, Treg проявляют свою супрессорную активность также через поглощение IL-2, что приводит к ингибиро