Средства, стимулирующие регенерацию тканей

Средства, стимулирующие регенерацию тканей

Реферат

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, клеточным технологиям и регенеративной медицине.

Известны различные средства, стимулирующие регенерацию тканей [1-3].

Наиболее близкими по техническому результату являются средства, стимулирующие регенерацию тканей, механизмом действия которых является воздействие на различные рецепторы к факторам роста [1, 3].

Недостатком данных средств является их недостаточная эффективность [3].

Адекватных аналогов предлагаемые средства, стимулирующие регенерацию тканей, по технической сущности не имеют.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала эффективных средств, стимулирующих регенерацию тканей.

Поставленная задача достигается применением в качестве средств, стимулирующих регенерацию тканей, фармакологических веществ, оказывающих прямое действие на PI3K-, PKB-, PKC-, NF-κВ-, MAPK-, JAK/STAT, цАМФ-, PKA/CREB-опосредованный сигналинг в прогениторных клетках.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве средств, стимулирующих регенерацию тканей, фармакологических веществ, оказывающих прямое действие на PI3K-, PKB-, PKC-, NF-κВ-, MAPK-, JAK/STAT, цАМФ-, PKA/CREB-опосредованный сигналинг в прогениторных клетках.

Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников открыли возможность развития фармакологической стратегии клеточной терапии [1]. При этом наиболее физиологичным подходом к решению задач регенеративной медицины в рамках данной стратегии является стимуляция функций собственных стволовых клеток (СК) организма лекарственными средствами - аналогами регуляторов физиологических функций [2, 3]. Наиболее часто для этих целей используют генноинженерные ростовые факторы (аналоги цитокинов), воздействующие в каждом конкретном случае на специфические рецепторы тех или иных типов прогениторных клеток [1, 4]. Однако плейотропность и полифункциональность цитокинов в ряде случаев не позволяют рассматривать их (особенно аналоги раннедействующих факторов роста) в качестве оптимальных средств для решения задач регенеративной медицины. Кроме того, белковая природа этих веществ предопределяет их достаточно высокую токсичность, обусловленную иммуногенностью, а также неспособность использования внутрь [3, 4], хотя пероральный прием препаратов является наиболее комплаентным в регенеративной медицине, когда предполагается длительное, многократно повторяющимися курсами, применение лекарственных средств. Кроме того, существуют и другие «недостатки» цитокинов, определяемые их фармакокинетическими характеристиками (в частности, их неспособность проникать через гематоэнцефалицеский барьер, что делает невозможным их эффективное использование для воздействия на СК нервной ткани при заболеваниях ЦНС).

Указанное обстоятельство делает необходимым разработку новых патогенетически обоснованных способов и подходов к активации функций прогениторных клеток с целью использования их ростового потенциала для стимуляции регенерации тканей в условиях патологических состояний. При этом известно, что стимулирующее влияние факторов роста после их взаимодействия с рецепторами передается посредством передачи сигнала с помощью внутриклеточных вторичных мессенджеров сигнальной трансдукции [5-7]. Причем, существуют вещества, способные проникать через мембрану клеток и оказывать прямое влияние на отдельные звенья сигнального каскада, участвующего в реализации определенных функций клеток, в том числе пролиферации и дифференцировки [5-7].

Однако возможность стимуляции ростового потенциала прогениторных клеток с целью терапии различных заболеваний путем ускорения регенерации органов и тканей организма фармакологическими веществами, оказывающими прямое воздействие на внутриклеточные пути передачи сигнала в прогениторных клетках, стимулирующие их функции, не изучена. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения фармакологических веществ, оказывающих прямое воздействие на внутриклеточные пути передачи сигнала в прогениторных клетках, с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции регенерации тканей организма, для специалиста является неочевидным.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты проведены на экспериментальных животных, полученных из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), утвержденными Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики» и «Методическими рекомендациями по изучению специфической активности средств для регенеративной медицины» (Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др.) // Руководства по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2013. - С.776-787 (944 с.) [2]. В качестве потенциальных «мишеней» воздействия фармакологических путей исследованы все основные пути внутриклеточной сигнальной трансдукции (PI3K-, PKB-, PKC-, NF-κВ-, цАМФ-, PKA/CREB-, MAPK-, JAK/STAT-сигнальные пути) [5-8]. В качестве фармакологических веществ, оказывающих прямое воздействие на внутриклеточную сигнальную трансдукцию, использовали широкий спектр как активаторов, так и ингибиторов отдельных сигнальных молекул [5-8]. Данное обстоятельство позволяет делать обобщенные выводы о принципиальной возможности и эффективности использования всех аналогичных по механизму действия веществ для достижения технического результата.

Пример 1

Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PKA (протеинкиназу А)

В настоящее время известна важная роль PKA/CREB (cAMP response element-binding protein)-сигналинга в определении функционального состояния различных клеток, заключающаяся в его ингибирующем влиянии на их пролиферативную активность [6].

Исследование проводилось на 46 беспородных мышах. Регенераторную (терапевтическую) активность фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на РКА прогениторных клеток, и механизмы его действия изучали на модели плоскостной кожной раны [9]. На депилированном участке спины у мышей под легким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10×10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали.

В качестве фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PKA-опосредованный сигналинг, использовали специфический ингибитор PKA N-2-(p-bromocinnamyl-amino)-ethyl-5-isoquinolihe sulfon-amide dihydrochloride (H-89) (Sigma, США) [9]. Вещество H-89 использовали в виде раствора наружно в объеме 30 мкл (микролитров) в концентрации 10 мкМ (микромоль), начиная с первого дня после моделирования раны, ежедневно в течение всего периода заживления. Режим применения вещества в предварительных экспериментах был определен как наиболее эффективный.

Критериями стимулирующего регенерацию действия служили средний диаметр раны и результаты гистологического исследования биоптатов кожи мышей, полученных на 3, 5 и 15-е сутки из края раневого дефекта. Биопсийные образцы раневого дефекта кожи окрашивали гематоксилин-эозином. Оценивали: рельеф регенерата кожи, степень и характер инфильтрации, наличие и выраженность отека, количество новообразованных сосудов, волосяных фолликулов и потовых желез. Изучали такие патоморфологические процессы, как акантоз, гиперкератоз, дискератоз. На 3-и и 5-е сут методом клонирования определяли содержание мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в раневой поверхности [2]. Кроме того, определяли прямое влияние Н-89 (в концентрации 10 мкМ) на рост КОЕ-Ф, их пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки (ИД-_КОЕ-Ф) [2]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.

В ходе эксперимента заживление ран у контрольных животных отмечалось к 18 сут опыта. Использование ингибитора PKA способствовало значительному ускорению процессов регенерации. Заживление дефекта в данном случае наблюдалось к 13-м сут опыта. При этом имело место наиболее выраженное снижение размера ран (табл.1).

Таблица 1
Динамика среднего диаметра ран, в см (X±m)
Сроки исследования/сутки	Контроль	ингибитор PKA
1	1,1±0,01	1,1±0,02
3	0,98±0,02	0,88±0,01*
5	0,9±0,02	0,82±0,02*
7	0,76±0,03	0,7±0,02
9	0,57±0,01	0,51±0,01*
12	0,28±0,03	0,20±0,02*
13	0,20±0,02	0,0±0,0
14	0,1±0,03	0,0±0,0
16	0,06±0,03	0,0±0,0
* - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05

При гистологическом исследовании на 3-й день после воздействия в обеих группах на поверхности раны обнаруживался лейкоцитарно-некротический слой, содержащий фибрин, под которым находился тонкий слой грануляционной ткани с большим количеством клеточных элементов: в основном нейтрофилов и макрофагов. Воспалительный процесс распространялся на нижележащий слой поперечно-полосатых мышц. Межмышечные прослойки были отечны и инфильтрированы лейкоцитами. По краям раны отек и гиперемия дермы, разрастание эпидермиса, который содержал 8-10 слоев однородных, недифференцированных крупных клеток округлой формы и толстый роговой слой. На 5-е сут новообразованный эпителий по краям раны представлял собой пласт клеток неодинаковой толщины без вертикальной анизоморфности. Передний край эпителия был истончен и в виде клина наползал на рану, а в грануляционной ткани отмечалось большое количество капилляров, имеющих вертикальный ход. При этом наружное применение Н-89 существенно снижало лейкоцитарную инфильтрацию краев раны, дермы и нижележащих тканей на 3-и сут опыта. Кроме того, использование ингибитора PKA увеличивало на 5-е сут эксперимента количество фибробластов в слое грануляций, которые при этом образовывали значительные по размеру тяжи клеток.

Анализ морфологических процессов, протекающих в области раневого дефекта кожи мышей на 15-е сут, показал, что в контрольной группе имело место формирование неполноценного регенерата. В подавляющем большинстве случаев поверхностный эпителий наблюдался не на всем протяжении, встречались небольшие участки отслойки эпидермиса от дермы с наличием субэпидермальных щелей, отмечалось резкое утолщение эпителиального пласта с нечеткой дифференцировкой слоев и увеличение количества базального, зернистого и рогового слоев. Внутриэпителиально обнаруживались нейтрофильные лейкоциты с формированием микроабсцессов, наблюдались слабовыраженные явления акантоза, гипер- и дискератоза. Подлежащая ткань была представлена созревающими грануляциями с умеренной гистиоцитарно-лейкоцитарной инфильтрацией, явлением отека и очагами кровоизлияний в верхних слоях дермы. Во всех образцах в прилежащей к зоне дефекта ткани отмечалось малое количество волосяных фолликулов и потовых желез. Регенерат кожи у животных контрольной группы характеризовался умеренным воспалением, что привело к усиленной пролиферации эпителия, для которой характерны атипические разрастания и изменения эпителия в виде акантоза, гипер- и дискератоза. Изучение гистоструктуры раневого дефекта в группе животных, получавших терапию ингибитором PKA, показало формирование более полноценного регенерата - в большей степени эпителизированного соединительнотканного рубца.

Изучение механизмов регенеративного действия Н-89 выявило его выраженное влияние на резидентные клетки-предшественники. Применение специфического ингибитора PKA сопровождалось существенным увеличением числа КОЕ-Ф в раневой поверхности (табл.2). В то же время было выявлено и выраженное прямое влияние Н-89 на прогениторные клетки. Внесение ингибитора PKA в культуру миелокариоцитов сопровождалось значительным увеличением выхода в метилцеллюлозной среде числа КОЕ-Ф, их пролиферативной активности и интенсивности дифференцировки (табл.3).

В целом, полученные результаты свидетельствуют о наличии выраженной регенеративной активности у фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PKA-опосредованный сигналинг в прогениторных клетках, специфического ингибитора PKA. При этом в основе его терапевтического действия лежит активация функций резидентных мезенхимальных предшественников (содержащих в своем составе помимо стромальных прекурсоров мультипотентные (истинные) СК, способные дифференцироваться в эпителиоциты [6]), связанная с прямым влиянием ингибитора сигнальной молекулы PKA на предшественники. Выявленная специфика механизмов действия Н-89 указывает на принципиальную возможность и перспективность разработки на основе специфических ингибиторов PKA средства для регенеративной медицины [2, 6].

Таблица 2
Содержание мезенхимальных клеток-предшественников в раневой поверхности, на 2,5×105 нуклеаров, (X±m)
Сроки исследования/сутки	Контроль	ингибитор PKA
3-и	0,55±0,15	1,9±0,02*
5-е	1,07±0,3	3,3±0,2*
* - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05

Таблица 3
Число КОЕ-Ф и КОЕ-Ф в S-фазе в культуре клеток костного мозга при добавлении ингибитора PKA, (X±m)
Группы	КОЕ-Ф, на 2,5×105 миелокариоцитов	КОЕ-Ф в S-фазе, в %	ИДКОЕ-Ф, в усл. ед.
контроль	9,6±0,7	26,3±4,5	1,36±0,14
ингибитор PKA	14,94±1,65*	89,7±5,63*	3,57±0,21*
* - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05

Пример 2

Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на аденилатциклазу

В настоящее время известно ингибирующее влияние цАМФ-зависимых сигнальных путей на пролиферативную активность клеточных элементов [6].

Исследование проводилось на 42 беспородных мышах. Регенераторную (терапевтическую) активность изучали на модели плоскостной кожной раны. На депилированном участке спины у мышей под легким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10×10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали [9].

В качестве фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на цАМФ-опосредованный сигналинг, использовали блокатор (ингибитор) аденилатциклазы (2′,5′-дидеоксиаденозин, 2′,5′-dideoxyadenosine) (Calbiochem, США) [6]. Вещество использовали наружно (в объеме 30 мкл раствора) в концентрации 30 мкМ, начиная с первого дня после моделирования раны, ежедневно в течение всего периода заживления. Режим применения вещества в предварительных экспериментах был определен как наиболее эффективный.

Критериями стимулирующего регенерацию действия служили средний диаметр раны и результаты гистологического исследования биоптатов кожи мышей, полученных на 3, 5 и 15-е сутки из края раневого дефекта. Биопсийные образцы раневого дефекта кожи окрашивали гематоксилин-эозином. На 3-и и 5-е сут методом клонирования определяли содержание мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в раневой поверхности [2]. Кроме того, определяли прямое влияние 2′,5′-dideoxyadenosine (в концентрации 30 мкМ) на рост КОЕ-Ф и их пролиферативную активность [2]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.

Использование ингибитора аденилатциклазы способствовало значительному ускорению процессов регенерации. Заживление дефекта в данном случае наблюдалось к 14 сут опыта (табл.4).

В ходе гистологического исследования имело место снижение лейкоцитарной инфильтрации краев раны, дермы и нижележащих тканей и увеличение количества фибробластов в слое грануляций под влиянием ингибитора аденилатциклазы.

Таблица 4
Динамика среднего диаметра ран, в см (X±m)
Сроки исследования/сутки	Контроль	Ингибитор аденилатциклазы
1	1,1±0,01	1,1±0,02
3	0,98±0,02	0,87±0,01*
5	0,9±0,02	0,81±0,01*
7	0,76±0,03	0,69±0,02*
9	0,57±0,01	0,52±0,03
12	0,28±0,03	0,22±0,02
13	0,20±0,02	0,09±0,01*
14	0,1±0,03	0,0±0,0
16	0,06±0,03	0,0±0,0
* - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05

При этом изучение механизмов регенеративного действия ингибитора аденилатциклазы выявило существенное увеличение числа КОЕ-Ф в раневой поверхности (табл.5), обусловленное его прямым влиянием на прогениторные клетки. Кроме того, внесение 2′,5′-dideoxyadenosine в культуру интактных миелокариоцитов сопровождалось значительным увеличением КОЕ-Ф в культуральной среде и количества КОЕ-Ф в S-фазе клеточного цикла (табл.6).

Таблица 5
Содержание мезенхимальных клеток-предшественников в раневой поверхности, на 2,5×105 нуклеаров, (X±m)
Сроки исследования/сутки	Контроль	Ингибитор аденилатциклазы
3	0,55±0,15	2,3±0,15*
5	1,07±0,3	3,03±0,2*
* - отмечена достоверность относительно контроля при 8<0,05

Таблица 6
Число КОЕ-Ф и КОЕ-Ф в S-фазе в культуре клеток костного мозга при добавлении ингибитора аденилатциклазы, (X±m)
Группы	КОЕ-Ф, на 2,5×105 миелокариоцитов	КОЕ-Ф в S-фазе, в %
Контроль	9,6±0,7	26,3±4,5
Ингибитор аденилатциклазы	12,56±0,59*	64,87±3,22*
* - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05

Таким образом, модуляция внутриклеточной передачи сигнала с помощью специфического ингибитора аденилатциклазы сопровождалось значительным ускорением регенерации поверхностных тканей в результате повышения пролиферативной активности резидентных прогениторных клеток кожи.

Пример 3

Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PKC (протеинкиназу С)

Известно стимулирующее влияние активации PKC на функциональную активность (процессы пролиферации и дифференцировки) клеточных элементов [5].

Исследование проводилось на 48 беспородных крысах. Регенераторную (терапевтическую) активность фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PKC-опосредованный сигналинг (активатора PKC), изучали на модели дегенеративного заболевания [2] - цирроза печени.

Цирроз вызывали совместным внутрижелудочным введением 50% раствора CCl₄ (гепатотропный яд) на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз)). При этом вместо воды животные в течение всего периода эксперимента получали 10% раствор этилового спирта. Опытным животным, начиная со следующего дня после последнего введения тетрахлоруглерода, через день в течение 10 сут внутрибрюшинно вводили активатор PKC - форболовый эфир (Phorbol12-myristate 13-acetate, Sigma, США) [11], в дозе 10 мкг/кг. Режим и доза введения вещества в предварительных экспериментах были определены как наиболее эффективные. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме (0,5 мл) вводили дистиллированную воду.

Оценивали гибель крыс, проводили биохимические исследования содержания в сыворотке крови аспартат- и аланин-аминотрансфераз (АсАТ, АлАТ) на 40-е сутки, а также морфологическое исследование печени на 40-е сутки опыта. Активность ферментов сыворотки крови определяли общепринятыми методами, используя полуавтоматический биохимический анализатор фирмы Cormay и стандартные наборы к нему. Кровь для исследования получали из бедренной артерии через катетер. На гистологических препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли количество клеток инфильтрата с помощью окулярной сетки Автандилова, содержащей 25 тест-точек [9]. В 20 полях зрения подсчитывали количество клеток, попадающих на тест-точки сетки. Относительную площадь инфильтрации высчитывали как отношение точек сетки, приходящихся на клетки инфильтрата, ко всем точкам сетки в 20 полях зрения. Площадь соединительной ткани определяли с помощью средств компьютерной обработки графических данных. Для этого на стандартной площади среза печени (последовательные микрофотографии 10 полей зрения, выполненные микровидеокамерой "Digital micro", с программой передачи изображения на компьютер фирмы «Элекард», Томск) измеряли площадь структур, окрашенных пикрофуксином, и вычисляли процентное отношение к выбранной стандартной площади. Кроме того, с помощью культуральных методов изучали влияние активатора PKC на состояние пула регионарных стволовых клеток (СК) в печени - КОЕ-Печ [2]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Биохимические исследования сыворотки крови выявили повышение активности АлАТ, и АсАТ и ЩФ на 40-е сутки опыта после начала введения CCl₄ в контрольной группе (табл.7). В то время как использование активатора PKC сопровождалось существенным снижением ферментативной активности сыворотки крови.

При исследовании гистологических препаратов печени в контрольной группе крыс отмечалось выраженное нарушение долькового строения органа. Имела место деформация терминальных печеночных венул, артериол и желчных протоков. Поля грануляционной ткани, замещали погибшие гепатоциты, в которых происходило новообразование сосудов и печеночных протоков, были видны фиброзные тяжи и микроузлы (псевдодоли). Последние представляли собой группы гепатоцитов, окруженных участками фиброза. В сохранившихся гепатоцитах наблюдалась выраженная крупнокапельная жировая дистрофия. Введение активатора PKC приводило к значительному регрессу морфологических признаков цирроза. При этом наблюдалось восстановление долькового строения печени, хотя признаки мелкокапельной жировой дистрофии и портальной инфильтрации сохранялись до конца периода наблюдения.

Подсчет содержания клеток инфильтрата и площади соединительной ткани показал падение данных показателей в группе крыс, получавших форболовый эфир (табл.8).

Таким образом, активатор PKC обладал выраженным противоцирротическим действием.

Таблица 7
Биохимические показатели крыс-самцов с циррозом (1) и при введении активатора PKC на фоне моделирования поражения печени (2) на 40 сутки эксперимента, X±m
Группы	АлАТ (мккат/л)	АсАТ (мккат/л)	ЩФ (Е/л)
фон	0,21±0,01	0,22±0,03	229,0±23,4
1	0,7±0,03*	0,74±0,03*	514,3±23,6*
2	0,49±0,02*#	0,55±0,05*#	438,47±8,6*#
* - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05.
# - отмечена достоверность различия показателя от его контрольного значения при p≤0,05.

Таблица 8
Морфологические показатели печени крыс-самцов с циррозом (1) и при введении активатора PKC на фоне моделирования поражения печени (2), X±m
Группы	Относительная площадь инфильтрата (%)	Относительная площадь соед. Ткани (%)
фон	1,26±0,3	3,51±0,28
1	25,9±4,57*	16,85±2,3*
2	18,6±1,23*#	10,25±0,7*#
* - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05.
# - отмечена достоверность различия показателя от его контрольного значения при p≤0,05.

В ходе изучения механизмов терапевтического (регенеративного) действия активатора PKC было выявлено значительное возрастание числа печеночных СК в органе-мишени (табл.9).

При этом в экспериментах in vitro было показано прямое стимулирующее влияние активатора PKC на прогениторные клетки. Внесение 50 нг/мл модификатора сигнальной трансдукции в культуру клеток печени сопровождалось значительным увеличением количества КОЕ-Печ в культуральной среде (табл.10).

Таблица 9
Содержание КОЕ-Печ в печени крыс с циррозом (1) и при введении активатора PKC на фоне моделирования поражения печени (2), X±m
Сроки исследования/сутки	Группы	КОЕ-Печ в печени, на 105 нуклеаров
фон	9,63±0,35
21-е	1	4,36±0,55*
2	7,23±2,1
23-е	1	6,59±1,2*
2	14,63±0,89*#
28-е	1	13,7±0,8*
2	10,23±0,47
* - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05.
# - отмечена достоверность различия показателя от его контрольного значения при p≤0,05.

Таблица 10
Влияние активатора PKC на рост КОЕ-Печ (2), X±m
Группы	КОЕ-Печ в печени, на 105 нуклеаров
контроль	14,23±2,36
активатор PKC	23,55±4,7*
* - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05.

Таким образом, стимуляция PKC-зависимого сигналинга в региональных СК с помощью активатора PKC сопровождалось значительным ускорением регенерации ткани печени, пораженной патологическим процессом, характеризующимся неспособностью компенсации нарушений путем реализации собственного регенераторного потенциала.

Пример 4

Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K)-опосредованный сигналинг, играющий важную роль в стимуляции функций прогениторных клеток [7]

Исследование проводилось на 34 беспородных крысах и 10 мышах линии CBA. Регенераторную (терапевтическую) активность фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PI3K-опосредованный сигналинг (активатор (стимулятор) PI3K), изучали на модели ишемического инсульта, вызываемого полуторной перевязкой сонных артерий у крыс [9].

В качестве фармакологического вещества, оказывающего прямое стимулирующее воздействие на PI3K-опосредованный сигналинг в прогениторных клетках, использовали низкомолекулярный алкалоид зонгорин. Вещество вводили крысам в дозе 2 мл перорально в виде 0,0005%-раствора 1 раз в сутки в течение 10 дней после моделирования патологического состояния. Режим и доза введения вещества в предварительных экспериментах были определены как наиболее эффективные. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.

Прямое стимулирующее воздействие зонгорина на PI3K в прогениторных клетках было показано в предварительных экспетиментах путем установления факта отмены ингибитором PI3K (LY294002) («Calbiochem», США) [7] стимулирующего действия зонгорина на рост КОЕ-Н (нейральных стволовых клеток) - нейросфер (клеточных образований, получаемых из нейральных клеток-предшественников) [1, 2] в культуре клеток пара-вентрикулярной области головного мозга мышей линии CBA in vitro. Рабочая концентрация ингибитора PI3K составляла 50 мкМ (микромоль). Клетки паравентрикулярной области головного мозга культивировали в жидкой культуральной среде [2], содержащей 10 нг/мл зонгорина. Внесение в культуру клеток головного мозга ингибитора PI3K отменяло стимулирующее влияние зонгорина на рост КОЕ-Н (табл.11).

Таблица 11
Рост КОЕ-Н из клеток паравентрикулярной области головного мозга при добавлении в среду зонгорина (1) и зонгорина совместно с ингибитором PI3K (2), X±m
Группы	КОЕ-Н, на 105 нуклеаров
фон	2,36±0,25
1	5,68±0,19*
2	2,34±0,41
* - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05.

Критериями терапевтической (регенераторной) активности активатора PI3K являлись результаты гистологического исследования головного мозга (на 10-е сут после моделирования ишемического инсульта), а также коррекция изменений функционального характера, вызванных перевязкой сонных артерий, которые регистрировались на основании изменения ориентировочно-исследовательского поведения животных в открытом поле и сохранности УРПИ [1, 9]. Ориентировочно-исследовательское поведение оценивали на 7, 14-е сут. Рефлекс пассивного избегания вырабатывался на 5 сут после моделирования патологического состояния, а его воспроизводимость оценивалась на 21-е сут эксперимента. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.

Проведенные исследования показали, что полуторная перевязка сонных артерий приводила к нарушению ориентировочно-исследовательского поведения животных в открытом поле (табл.12) и падению уровня воспроизведения УРПИ (табл.13).

При гистологическом исследовании мозга животных с ишемией наблюдалось неравномерное кровенаполнение полушарий головного мозга. Часть сосудов коры была в спавшемся состоянии, встречались сосуды со слабым кровенаполнением и, много сосудов с пустыми просветами. Имел место выраженный периваскулярный и перицеллюлярный отек. В области гиппокампа наблюдалось значительное количество нейронов с гиперхромными ядрами, вакуольной дистрофией, нейроны, окруженные фагоцитами, нейроны с пикнотичным ядром и сморщенной цитоплазмой, нейроны в состоянии фагоцитоза.

Введение активатора PI3K оказывало выраженное церебропротекторное действие. Наблюдалось повышение уровня воспроизводимости рефлекса, выраженная коррекция нарушений ориентировочно-исследовательского поведения и предотвращение гибели животных (табл.12, 13). При этом морфологическая картина головного мозга характеризовалась относительно равномерным кровенаполнением сосудов правого и левого полушария, отменой развития периваскулярного и перицеллюлярного отека и снижением количества нейронов с вакуольной дистрофией и нейронов в состоянии фагоцитоза по сравнению с контрольными животными.

Таблица 12
Влияние активатора PI3K на показатели ориентировочно-исследовательского поведения крыс в открытом поле после моделирования ишемического инсульта ( X ¯ ± m )
Сроки исследования/сутки	Группы наблюдения, доза	Суммарная двигательная активность	Горизонтальная активность	Вертикальная активность	Норковый рефлекс
7-е	интакт	26,8±4,53	16,2±3,8	4,2±1,4	7,3±1,5
контроль	15,1±1,78*	13,5±1,9*	1,0±0,6*	0,0±0,0*
активатор PI3K	27,8±3,19#	18,2±3,68#	2,4±0,3*	6,3±1,2#
14-е	интакт	13,69±2,5	9,3±1,6	2,34±0,36	3,6±0,25
контроль	21,4±2,61*	16,9±2,4*	1,3±0,9*	2,6±0,17*
активатор PI3K	19,53±4,2	11,3±2,5	3,2±0,3	4,7±2,5
* - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05.
# - отмечена достоверность различия показателя от его контрольного значения при p≤0,05.

Таблица 13
Влияние активатора PI3K на сохранность условного рефлекса пассивного избегания беспородных крыс поле после моделирования ишемического инсульта ( X ¯ ± m )
Группы наблюдения, доза	Доля животных с сохранившимся рефлексом при проверке через (в %)
21 сутки
интакт	92
контроль	12
активатор PI3K	65

Полученные результаты свидетельствуют о выраженной церебропротекторной активности активатора PI3K, связанной с его регенеративной активностью, определяемой стимулирующим влиянием данного вещества на нейральные стволовые клетки в результате реализации PI3K-опосредованного сигналинга.

Пример 5

Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на митоген-активируемые киназы (МАРК) и протеинкиназу В (PKB) [7, 8], играющие важную роль в сигнальной трансдукции при стимуляции функций клеток

Исследование проводилось на 58 мышах линии CBA. Регенераторную (терапевтическую) активность фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на МАРК и PKB, изучали на модели постгипоксической энцефалопатии.

В качестве фармакологического вещества, оказывающего прямое активирующее воздействие на МАРК- и PKB-опосредованный сигналинг в прогениторных клетках (активатора МАРК и PKB), использовали низкомолекулярный алкалоид гипаконитин. Вещество вводили мышам в дозе 0,2 мл перорально в виде 0,0005% - раствора 1 раз в сутки в течение 7 дней после моделирования патологического состояния. Режим и доза введения вещества в предварительных экспериментах были определены как наиболее эффективные. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.

Постгипоксическую энцефалопатию моделировали с помощью гермокамеры [1]. Функциональные нарушения со стороны центральной нервной системы, вызванные гипоксическим воздействием, оценивались по изменению ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле и сохранности УРПИ [1, 9]. Ориентировочно-исследовательское поведение оценивали на 7, 14, 21-е сут. Рефлекс пассивного избегания вырабатывался на 5 сут после моделирования патологического состояния, а его воспроизводимость оценивалась на 21-е сут эксперимента. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.

Прямое активирующее влияние гипаконитина на МАРК и PKB в прогениторных клетках было показано в предварительных экспериментах путем установления факта отмены ингибитором МАРК р38 и PKB (SB203580) (Calbiochem, США) [7] стимулирующего действия гипаконитина на рост КОЕ-Ф (мезенхимальных стволовых клеток) [2] в культуре клеток костного мозга мышей линии CBA in vitro. Рабочая концентрация ингибитора МАРК и PKB составляла 10 мкМ (микромоль). Клетки костного мозга культивировали в полувязкой культуральной среде [2], содержащей 10 нг/мл гипаконитина. Внесение в культуру клеток костного мозга ингибитора МАРК и PKB отменяло стимулирующее влияние гипаконитина на рост КОЕ-Ф и повышение их пролиферативной активности (табл.14).

Таблица 14
Рост КОЕ-Ф в культуре клеток костного мозга мышей и их пролиферативная активность при добавлении в среду гипаконитина (1) и гипаконитина совместно с ингибитором МАРК и PKB (2), X±m
Группы	КОЕ-Ф, на 2,5*105 миелокариоцитов	КОЕ-Ф в S-фазе, в %
фон	10,2±2,17	33,26±2,24
1	18,36±1,04*	68,4±3,6*
2	11,0±0,68	35,7±2,55
* - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05.

Проведенные исследования показали (табл.15), что перенесенная гипоксия вызывала нарушение ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле. В группе гипоксического контроля отмечалось увеличение латентного времени захода в темную камеру при выработке рефлекса, что свидетельствует о нарушении ориентировочного рефлекса. Применение активатора МАРК и РКВ приводило к нормализации ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле (табл.15).

Кроме того, проявления постгипоксической энцефалопатии у животных гипоксического контроля регистрировались по нарушению мнестических функций. Имело место падение уровня воспроизводимости УРПИ и значительная гибель животных. Применение гипаконитина оказало защи