Способы и системы для определения того, является ли геном аномальным

Способы и системы для определения того, является ли геном аномальным

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биомедицины. В частности, оно относится к способу и системе для определения того, существует ли аномалия генома, а конкретнее, настоящее изобретение относится к способу определения геномной последовательности ядросодержащих эритроцитов плода, способу определения того, существует ли аномалия генома, и системе для определения того, существует ли аномалия генома.

Предпосылки создания изобретения

Пренатальная диагностика, также известная как дородовая диагностика, относится к диагностированию с высокой точностью того, страдает ли плод до рождения некоторыми генетическими заболеваниями или врожденными пороками развития, с помощью объединения результатов генетического детектирования и томографического исследования. Используемые в настоящее время способы пренатальной диагностики в основном делят на инвазивную диагностику и неинвазивную диагностику в соответствии с различиями в способах отбора образца. Инвазивная диагностика в основном включает амниоцентез (исследование амниотической жидкости), пункцию хориона, отбор образца пуповинной крови, фетоскопию, биопсию эмбриона и т.д., и в настоящее время амниоцентез и пункция хориона являются относительно часто применяемыми. В случае инвазивной диагностики, так как клетки или ткани плода могут быть отобраны непосредственно, может быть получен точный и верный результат после генетического детектирования, но из-за инвазивного способа отбора образца будет причиняться потенциальный вред беременной женщине и плоду, а в серьезном случае даже вызываются выкидыш или внутриутробная инфекция и т.д. В соответствии со статистикой амниоцентез и пункция хориона могут приводить к коэффициенту выкидыша, составляющему приблизительно 1% и 1-2% соответственно.

В настоящее время способы пренатальной диагностики все еще подлежат усовершенствованию.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение направлено на решение по крайней мере одной из технических проблем, существующих в данной области техники. По этой причине настоящее изобретение представляет способ и систему, способную эффективно определить, существует ли аномалия генома.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение представляет способ определения того, существует ли аномалия генома. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ определения того, существует ли аномалия генома, включает стадии: выделения ядросодержащих эритроцитов плода из образца от беременной женщины, секвенирования по крайней мере части генома указанных ядросодержащих эритроцитов, чтобы получить результат секвенирования, и, на основе указанного результата секвенирования, определения того, существует ли аномалия генома в указанных ядросодержащих эритроцитах. Авторы настоящего изобретения установили, что можно эффективно определить, существует ли аномалия генома в ядросодержащих эритроцитах плода, выделенных из образца от беременной женщины, используя способ в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. Способ может быть предназначен для немедицинской цели.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение представляет систему для определения того, существует ли аномалия генома. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения система включает устройство для отделения ядросодержащих эритроцитов, при этом указанное устройство для отделения ядросодержащих эритроцитов используется для выделения ядросодержащих эритроцитов плода из образца от беременной женщины, устройство для секвенирования, при этом указанное устройство для секвенирования используется для секвенирования по крайней мере части генома указанных ядросодержащих эритроцитов, чтобы получить результат секвенирования, и устройство для анализа результата секвенирования, при этом указанное устройство для анализа результата секвенирования соединено с устройством для секвенирования для получения указанного результата секвенирования от указанного устройства для секвенирования, и на основе указанного результата секвенирования выносится решение, существует ли аномалия генома в указанных ядросодержащих эритроцитах. Способ определения того, существует ли аномалия генома, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения можно эффективно осуществить, используя систему для определения анеуплоидии по хромосоме(ам) в ядросодержащих эритроцитах, и, таким образом, можно эффективно определить, существует ли аномалия генома в ядросодержащих эритроцитах.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение представляет способ определения геномной последовательности ядросодержащих эритроцитов плода. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения он включает стадии: выделения ядросодержащих эритроцитов плода из образца от беременной женщины и секвенирования по крайней мере части генома указанных ядросодержащих эритроцитов, чтобы получить результат секвенирования. Информацию о последовательности генома ядросодержащих эритроцитов можно эффективно получить, используя этот способ, так что можно получить информацию о последовательности генома плода.

Дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения будут отчасти указаны в следующем описании и отчасти станут очевидными благодаря следующему описанию, или будут понятны благодаря осуществлению на практике настоящего изобретения.

Описание чертежей

Вышеупомянутые и/или дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными и понятными благодаря описанию вариантов осуществления в сочетании со следующими чертежами, где:

на фиг. 1 представлена блок-схема последовательности операций в способе определения того, существует ли аномалия генома в ядросодержащих клетках, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

На фиг. 2 представлена блок-схема последовательности операций в способе определения того, существует ли аномалия генома в ядросодержащих клетках, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения;

На фиг. 3 представлена блок-схема системы, используемой для определения того, существует ли аномалия генома в ядросодержащих клетках, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

На фиг. 4 представлена блок-схема устройства для отделения ядросодержащих эритроцитов в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

На фиг. 5 представлена блок-схема системы, используемой для определения того, существует ли аномалия генома в ядросодержащих клетках, в соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения;

На фиг. 6 представлена блок-схема устройства для приготовления библиотеки для секвенирования полного генома в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 7 представлен результат детектирования сконструированной библиотеки ДНК в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения с помощью анализатора Agilent® Bioanalyzer 2100. Вкратце, амплифицированный продукт полного генома позитивных клеток (ядросодержащих эритроцитов), полученных с помощью отделения, разрезали с помощью ультразвуковой волны, основанная полоса после разрезания составляла приблизительно 350 п.о., размеры фрагментов после лигирования с адаптером были увеличены на приблизительно 120 п.о., и фрагмент размером 430-450 п.о. выделяли вырезанием из геля. На фиг. 7 можно видеть, что диапазон фрагментов четырех библиотек удовлетворяет требованиям, и качество библиотеки удовлетворяет требованиям секвенирования, где GP9 представляет собой исследуемый образец, а YH6 представляет собой контрольный образец (образец от нормального человека).

На фиг. 8 представлен результат анализа данных секвенирования в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, где в (А) представлено распределение значения для содержания GC в каждом окне и числа уникально совмещаемых данных секвенирования для исследуемого образца; в (В) представлена сглаженная сплайновая кривая связи между содержанием GC и числом уникально совмещаемых данных секвенирования, в (С) представлено распределение весового коэффициента, соответствующего поправке данных для каждого окна в исследуемом образце, где окно с каждым содержанием GC соответствует одному значению UR в качестве соответствующего поправке весового коэффициента; и в (D) представлена коробчатая диаграмма, демонстрирующая данные секвенирования каждой хромосомы.

Конкретные варианты осуществления

Варианты осуществления настоящего изобретения детализированы ниже, и примеры указанных вариантов осуществления представлены на чертежах, на которых одинаковые или сходные пометы представляют собой одинаковые или сходные элементы или элементы с одинаковыми или схожими функциями от первого до последнего. Следующие варианты осуществления, описанные с учетом чертежей, являются примерными и используются лишь для объяснения настоящего изобретения, но их нельзя понимать как ограничение настоящего изобретения.

Необходимо отметить, что термины «первый» и «второй» используются лишь с целью описания, и их нельзя понимать как указание на относительную важность или неявное указание на число указанных технических признаков, или как предположение этого. Таким образом, признаки, определенные с помощью «первый» и «второй», могут явно или неявно включать один или более признаков. Кроме того, в описании настоящего изобретения, кроме особо оговоренных случаев, значением термина «множество» является два или более.

1. Способ определения того, существует ли аномалия генома

Аспект настоящего изобретения представляет способ определения того, существует ли аномалия генома. С учетом фиг. 1, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, способ включает стадии:

S10: выделение ядросодержащих эритроцитов плода из образца от беременной женщины.

В настоящем изобретении выбор выделения ядросодержащих эритроцитов плода из образца от беременной женщины сделан на основе следующего открытия, сделанного авторами настоящего изобретения: в настоящее время исследования генетических аномалий у плода в основном основаны на выделении свободной ДНК плода из беременной женщины. Однако, поскольку помимо свободной ДНК плодного происхождения в периферической крови беременной женщины также существует большое количество ДНК материнского происхождения, и половина геномной ДНК плода происходит от матери, точная дифференциация происхождения ДНК является относительно трудной в настоящее время. Вместе с тем свободная ДНК плода в периферической крови матери существует в неполном геноме, и по этой причине большое увеличение вероятности ложноотрицательного результата обусловлено утратой матрицы в процессе детектирования конкретного сайта гена. По этой причине детектирование генетических аномалий у плода, используя свободную ДНК плода, имеет свои собственные недостатки, и вдобавок авторы настоящего изобретения дополнительно установили, что помимо свободных нуклеиновых кислот плода интактные клетки плода также существуют в периферической крови матери. Свободные клетки плода в периферической крови беременной женщины в основном включают трофобластные клетки, лейкоциты и ядросодержащие эритроциты плода. Авторы настоящего изобретения установили, что среди них трофобластные клетки являются легкоприводящими к ошибочному диагнозу вследствие существования двух форм, многоядерной формы и одноядерной формы. Лейкоциты будут существовать в крови матери постоянно после рождения плода и будут мешать детектированию при следующей беременности. Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что ядросодержащие эритроциты плода имеют относительно короткий жизненный цикл, будут исчезать в пределах 90 дней после рождения плода и не будут мешать детектировании при другой беременности, и вместе с тем антигены на поверхности ядросодержащих эритроцитов являются относительно стабильными, и они являются легко распознаваемыми и выделяемыми. Таким образом, аномалию генома плода можно эффективно определить, используя ядросодержащие эритроциты плода. Авторы настоящего изобретения установили, что эффект способа использования ядросодержащих эритроцитов плода в периферической крови беременной женщины для проведения неинвазивной пренатальной диагностики в сочетании с высокопроизводительным секвенированием намного превосходит используемую в настоящее время неинвазивную пренатальную диагностику с использованием плазмы беременной женщины.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения образец от беременной женщины в качестве источника ядросодержащих эритроцитов не очень ограничивается. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, указанным образцом от беременной женщины является предпочтительно периферическая кровь беременной женщины. Таким образом, эти образцы можно без труда получить от беременной женщины, и на основе предпосылки, что на развитие плода не оказывается влияние, ядросодержащие эритроциты плода можно получить из периферической крови беременной женщины для выполнения секвенирования полного генома, тем самым выполняя неивазивное пренатальное исследование. Кроме того, стадия беременности беременной женщины в качестве источника ядросодержащих эритроцитов плода не очень ограничивается. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения для выделения ядросодержащих эритроцитов плода можно выбрать образец от беременной женщины со сроком беременности меньше 20 недель, например, образец от беременной женщины со сроком беременности 12-20 недель может быть выбран в качестве объекта исследования. Таким образом, ядросодержащие эритроциты плода можно эффективнее выделить для выполнения исследования. Кроме того, авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что, используя способ настоящего изобретения, даже в том случае, если получен только 1 ядросодержащий эритроцит плода, исследование может быть выполнено эффективно.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ выделения ядросодержащих эритроцитов из биологического образца, например, периферической крови, не очень ограничивается. В соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения выделение указанных ядросодержащих эритроцитов из периферической крови дополнительно включает следующие стадии.

Прежде всего, выполняют центрифугирование в градиенте плотности указанной периферической крови, используя реагент для создания градиента плотности, чтобы получить моноциты. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения тип реагента для создания градиента плотности не очень ограничивается, и в соответствии с конкретными примерами полисахароза, например, Фиколл, можно выбрать для создания градиента плотности. Предпочтительно указанное центрифугирование в градиенте плотности можно выполнять при 8000×g в течение 30 минут.

После получения моноцитов обогащение ядросодержащими эритроцитами осуществляют, исходя из полученных моноцитов, с использованием магнитных частиц, несущих антитело, причем антитело, содержащееся на магнитных частицах, специфически распознает антиген на поверхности ядросодержащих эритроцитов, затем ядросодержащие клетки будут связываться с магнитными частицами благодаря антителу, и впоследствии ядросодержащие эритроциты можно получить с помощью магнитной сортировки.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения после получения указанных моноцитов и до осуществления обогащения указанными ядросодержащими эритроцитами с использованием магнитных частиц, несущих антитело против CD71, процесс дополнительно включает отмывку указанных моноцитов, используя буфер PBS, содержащий 1% BSA, чтобы удалить остаточный реагент для создания градиента плотности, предпочтительно указанный буфер PBS содержит первичный кислый фосфат калия и двузамещенный фосфорнокислый калий, но не содержит ионы кальция и ионы магния, и, таким образом, эффективность обогащения ядросодержащими эритроцитами может быть значительно увеличена. В соответствии с конкретными примерами настоящего изобретения отмывка указанных моноцитов, используя буфер PBS, содержащий 1% BSA дополнительно включает: смешивание указанных моноцитов и указанного буфера PBS, содержащего 1% BSA, чтобы получить суспензию, содержащую моноциты, и центрифугирование указанной суспензии, содержащей моноциты, предпочтительно ее центрифугирование при 200×g в течение 5 минут, и отбрасывание супернатанта, чтобы получить отмытые ядросодержащие эритроциты. Предпочтительно указанным антителом является антитело, специфически распознающее CD71. Авторы настоящего изобретения установили, что с помощью способа отделения ядросодержащих эритроцитов в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения ядросодержащие эритроциты можно эффективно выделить из периферической крови, и, в частности, ядросодержащие эритроциты плода можно выделить. Таким образом, настоящее изобретение представляет способ выделения ядросодержащих эритроцитов плода из периферической крови, который является простым и легко выполняемым. Конечно, квалифицированным в данной области техники будет понятно, в способ отделения ядросодержащих эритроцитов могут быть также включены другие стадии. Например, в соответствии с конкретными примерами настоящего изобретения способ отделения ядросодержащих эритроцитов включает: взятие соответствующего количества крови беременной женщины, выполнение антикоагуляции с использованием антикоагулянта, разведение образца крови пропорционально 0,1М фосфатным буферным раствором (PBS), не содержащим ионы кальция и ионы магния, медленное наслаивание разведенного образца на реагент для центрифугирования в градиенте плотности и выполнение центрифугирования в градиенте плотности при комнатной температуре. После центрифугирования можно увидеть слой моноцитов, слой клеток осторожно отсасывают пипеткой, переносят в новую центрифужную пробирку, ресуспендируют с использованием 3 объемов буфера PBS, содержащего 1% BSA, и снова центрифугируют при комнатной температуре, супернатант отбрасывают, полученный клеточный осадок далее дважды отмывают с использованием того же способа для удаления остаточной жидкости градиента плотности и, наконец, клеточный осадок ресуспендируют в PBS, содержащем 0,1% BSA, и равномерно пипетируют. Затем магнитные частицы, несущие антитело, добавляют в соотношении 20 микролитров/10⁶ клеток и центрифугируют после выдерживания при 4°С, супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в PBS, содержащем 0,1% BSA, и собирают систему для сортировки магнитных частиц. Сортировочную колонку увлажняют с помощью 500 микролитров буфера PBS, содержащего 0,1% BSA, и после спуска жидкости клетки, подвергаемые сортировке, загружают в колонку, и выходящую жидкость собирают и помечают как негативные клетки. Трубку увлажняют с использованием PBS, содержащего 0,1% BSA, и после спуска жидкости это же снова повторяют дважды, в сортировочную колонку добавляют PBS/EDTA/BSA, и после спуска жидкости это же снова повторяют один раз. Наконец, PBS, содержащий 0,1% BSA, добавляют в сортировочную колонку, магнитное поле убирают, жидкость сливают в новую центрифужную пробирку, и получают ядросодержащие эритроциты.

S20: после выделения ядросодержащих эритроцитов плода из образца от беременной женщины можно секвенировать по крайней мере часть генома ядросодержащих эритроцитов, и таким образом можно получить результат секвенирования, соответствующий объектам секвенирования.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения после выделения ядросодержащих эритроцитов плода можно секвенировать по крайней мере часть генома ядросодержащих эритроцитов. Квалифицированные в данной области техники специалисты могут выбрать объекты секвенирования из генома ядросодержащих эритроцитов в соответствии с представляющими интерес генами и таким образом получить результат секвенирования, соответствующий этим объектам секвенирования. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения квалифицированные в данной области техники специалисты могут выбрать любой известный способ для выбора объектов секвенирования, например, могут выбрать только отдельные хромосомы в нем. Конечно, квалифицированные в данной области техники специалисты будут понимать, что можно также сразу секвенировать полный геном ядросодержащих эритроцитов, и после получения результата секвенирования данные секвенирования конкретного сайта отбирают из результата секвенирования для выполнения исследования (см. подробности ниже). Из-за удобства, нижеследующее иллюстрирует это с секвенированием полного генома ядросодержащих эритроцитов в качестве примера.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения после получения ядросодержащих эритроцитов способ секвенирования полного генома ядросодержащих эритроцитов не очень ограничивается. В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения секвенирование полного генома ядросодержащих эритроцитов дополнительно включает: прежде всего, амплификацию полного генома ядросодержащих эритроцитов для получения амплифицированного полного генома, впоследствии конструирование библиотеки для секвенирования полного генома, используя амплифицированный полный геном, и, наконец, секвенирование библиотеки для секвенирования полного генома, чтобы получить результат секвенирования, состоящий из множества данных секвенирования. Таким образом, можно эффективно получить информацию о полном геноме ядросодержащих эритроцитов, и таким образом можно дополнительно увеличить эффективность определения того, существует ли аномалия генома в ядросодержащих эритроцитах. Квалифицированные в данной области техники специалисты могут выбрать различные способы конструирования библиотеки для секвенирования полного генома в соответствии с конкретным протоколом для используемого метода секвенирования генома, и ради подробностей конструирования библиотеки для секвенирования полного генома смотрите директивные правила, предлагаемые производителем секвенатора, например, Illumina Corporation, например, смотрите Multiplexing Sample Preparation Guide (Part#1005361; Feb 2010) или Paired-End SamplePrep Guide (Part#10050631; Feb 2010), предлагаемое Illumina Corporation, которое включено сюда посредством ссылки.

Необязательно, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, оно может дополнительно включать стадию лизиса указанных ядросодержащих эритроцитов для высвобождения полного генома указанных ядросодержащих эритроцитов. В соответствии с некоторыми примерами настоящего изобретения способ, который может использоваться для лизиса ядросодержащих эритроцитов и высвобождения полного генома, не очень ограничивается при условии, что способ может лизировать, предпочтительно полностью лизировать, ядросодержащие эритроциты. В соответствии с некоторыми примерами настоящего изобретения щелочной буфер для лизиса может использоваться для лизиса указанных ядросодержащих эритроцитов и высвобождения полного генома указанных ядросодержащих эритроцитов. Авторы настоящего изобретения установили таким образом, что ядросодержащие эритроциты можно эффективно лизировать и высвободить полный геном, и при секвенировании высвобожденного полного генома можно увеличить уровень точности, и таким образом дополнительно увеличивается эффективность определения анеуплоидии по хромосоме(ам) в ядросодержащих эритроцитах. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ амплификации полного генома ядросодержащих эритроцитов не очень ограничивается, и можно выбрать способ на основе ПЦР (PCR), можно выбрать, например, PEP-PCR, DOP-PCR и OmniPlex WGA, и можно также выбрать способ не на основе ПЦР, например, MDA (амплификацию с множественным вытеснением цепи). В соответствии с конкретными примерами настоящего изобретения предпочтительно выбирают способ на основе ПЦР, например, способ OmniPlex WGA. Выбираемые коммерциализированные наборы включают, но без ограничения, GenomePlex от Sigma Aldrich, PicoPlex от Rubicon Genomics, REPLI-g от Qiagen, illustra GenomiPhi от GE Healthcare и т.д. Следовательно, в соответствии с конкретными примерами настоящего изобретения, перед конструированием библиотеки для секвенирования можно выбрать OmniPlex WGA для амплификации полного генома ядросодержащих эритроцитов. Таким образом, полный геном можно эффективно амплифицировать, и таким образом дополнительно увеличивается эффективность определения анеуплоидии по хромосоме(ам) в ядросодержащих эритроцитах.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения конструирование библиотеки для секвенирования полного генома (также называемой здесь иногда «библиотекой нуклеиновых кислот» или «библиотекой для секвенирования), используя указанный амплифицированный полный геном дополнительно включает.

Прежде всего, амплифицированный полный геном подвергают фрагментации, чтобы получить фрагменты ДНК, и в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ фрагментации полученной ДНК не очень ограничивается, и в соответствии с некоторыми конкретными примерами фрагментацию можно выполнить с помощью по крайней мере одного способа, выбираемого из тонкого измельчения, ультразвукового способа разрезки, HydroShear и процедуры ферментативного расщепления, предпочтительно амплифицированный полный геном подвергают фрагментации, используя ультразвуковое устройство для разрезки Covaris. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения размер фрагментов ДНК, получаемых после процедуры фрагментации, составляет 200-400 п.о., предпочтительно 350 п.о. Авторы настоящего изобретения установили, что получаемые фрагменты ДНК этого размера можно эффективно использовать для конструирования библиотеки нуклеиновых кислот и последующих обработок.

После получения фрагментов ДНК можно выполнить репарацию концов полученных фрагментов ДНК, чтобы получить фрагменты ДНК с репарированными концами. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения можно выполнить репарацию концов фрагментов ДНК, используя фрагмент Кленова, ДНК-полимеразу Т4 и полинуклеотидкиназу Т4, причем фрагмент Кленова обладает 5′→3′ полимеразной активностью и 3′→5′ экзонуклеазной активностью, но не обладает 5′→3′ экзонуклеазной активностью, и таким образом можно эффективно выполнить репарацию концов фрагментов ДНК.

После выполнения репарации ДНК фрагментов ДНК основания А можно добавить к 3′-концам фрагментов ДНК с репарированными концами, чтобы получить фрагменты ДНК с «липким» концом А. В соответствии с некоторыми конкретными примерами настоящего изобретения основания А можно добавить к 3′-концам фрагментов ДНК с репарированными концами, используя фрагмент Кленова (3′→5′ exo^-), т.е. фрагмент Кленова, который не обладает 3′→5′ экзонуклеазной активностью, и таким образом можно эффективно получить фрагменты ДНК с «липким» концом А.

После добавления к концу оснований А фрагменты ДНК с «липким» концом А можно лигировать с адаптером, чтобы получить продукт лигирования. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения фрагменты ДНК с «липким» концом А можно лигировать с адаптером, используя ДНК-лигазу Т4, и таким образом можно эффективно получить продукт лигирования. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения метку можно дополнительно включить в адаптер, и таким образом можно одновременно сконструировать подходящим образом библиотеки для секвенирования полного генома из множества образцов ядросодержащих эритроцитов, и библиотеки для секвенирования из множества образцов объединяют и секвенируют одновременно. Таким образом, можно в полной мере использовать платформу для высокопроизводительного секвенирования, и сберечь время, и эффективно снизить затраты на секвенирование.

После получения продукта лигирования выполняют амплификацию с использованием ПЦР указанного продукта лигирования, чтобы получить второй продукт амплификации, и указанный второй продукт амплификации очищают и выделяют, чтобы получить выделенный продукт, и указанный выделенный продукт образует указанную библиотеку для секвенирования полного генома.

После конструирования библиотеки для секвенирования полного генома, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, указанную библиотеку для секвенирования полного генома можно секвенировать. Конечно, квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что стадию секвенирования в настоящем изобретении можно выполнить с помощью любого метода секвенирования, который включает, но без ограничения, метод обрыва цепи с использованием дидезоксинуклеотидов, предпочтительно способов высокопроизводительного секвенирования, и таким образом можно использовать характеристики высокопроизводительного и глубокого секвенирования этих устройств для секвенирования, и дополнительно увеличивается эффективность определения анеуплоидии по хромосоме(ам) в ядросодержащих эритроцитах. Указанные способы высокопроизводительного секвенирования включают, но без ограничения, метод секвенирования второго поколения или метод секвенирования одной молекулы.

Указанные платформы для секвенирования второго поколения (Metzker ML., Sequencing technologies-the next generation. Nat Rev Genet. 2010 Jan; 11(1): 31-46) включают, но без ограничения, Illumina-Solexa (GA™, HiSeq2000™ и т.д.), ABI-Solid и платформу для секвенирования (пиросеквенирования) Roche-454; а платформы (методы) для секвенирования одной молекулы включают, но без ограничения, метод секвенирования действительно одной молекулы (True Single Molecule DNA sequencing) от Helicos Corporation, секвенирование в режиме реального времени одной молекулы (SMRT™) от Pacific Biosciences Corporation и метод секвенирования с использованием мембраны с нанопорами от Oxford Nanopore Technologies Corporation и т.д. (Rusk, Nicole (2009-04-1). Cheap Third-Generation Sequencing. Nature Methods 6(4); 244-245).

Учитывая непрерывную разработку технологии секвенирования, квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что секвенирование полного генома можно также выполнить, используя другие методы секвенирования и устройства для него. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения размеры данных секвенирования, получаемых при секвенировании полного генома, не очень ограничивается. В соответствии с конкретным примером настоящего изобретения средний размер указанного множества данных секвенирования составляет приблизительно 50 п.о. Авторы настоящего изобретения установили, что, когда средний размер данных секвенирования составляет приблизительно 50 п.о., анализ данных секвенирования может быть значительно облегчен, эффективность анализа увеличивается, и вместе с тем могут быть значительно снижены затраты на анализ. Кроме того, увеличивается эффективность определения анеуплоидии по хромосоме(ам) в ядросодержащих эритроцитах, и снижаются затраты на определение анеуплоидии по хромосоме(ам) в ядросодержащих эритроцитах. Термин «средний размер», используемый здесь, относится к среднему значению численных значений размеров всех данных секвенирования.

S30: после получения результата секвенирования определяют, на основе полученного результата секвенирования, существует ли аномалия генома в ядросодержащих эритроцитах.

Используемый здесь термин «аномалия генома» следует понимать широко, и он может относиться к любому изменению в геномной последовательности, например, анеуплоидии по хромосоме(ам), структурной вариации, мутации в одном нуклеотиде и другим генетическим вариациям (http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_variation), и она может также быть изменением сайта модификации генома, например, уровня метилирования. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения исследуемая аномалия генома представляет собой по крайней мере одну аномалию, выбираемую из анеуплоидии по хромосоме(ам) и мутации в заранее определенной области. В вариантах осуществления настоящего изобретения мутация в заранее определенной области относится к структурной вариации (http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_variation) или мутации в одном нуклеотиде (SNP, http://en.wikipedia.org/wiki/Single-nucleotide_polymorphism).

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения определение мутации в заранее определенной области в геноме может дополнительно включать.

Прежде всего, на основе результата секвенирования определяют нуклеотидную последовательность заранее определенной области в указанных ядросодержащих эритроцитах. Квалифицированные в данной области техники специалисты могут выбрать любой известный способ для определения нуклеотидной последовательности заранее определенной области. Например, может быть выбран известным способ сбора данных секвенирования конкретной области в результате секвенирования, получая таким образом нуклеотидную последовательность заранее определенной последовательности.

После получения нуклеотидной последовательности заранее определенной последовательности нуклеотидную последовательность заранее определенной области в указанных ядросодержащих эритроцитах совмещают с контрольной нуклеотидной последовательностью, предпочтительно указанной контрольной нуклеотидной последовательностью является геномная последовательность нормального человека. Впоследствии, на основе результата совмещения можно определить, существует ли аномалия в заранее определенной области в ядросодержащих эритроцитах. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения мутация в заранее определенной области, которую можно детектировать с помощью этого способа, включает по крайней мере одну мутацию, выбираемую из инсерционной мутации, делеционной мутации, мутации с заменой, мутацией с инверсией, вариации числа копий, мутации с транслокацией и однонуклеотидного полиморфизма.

С учетом фиг. 2, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, способ определения анеуплоидии по хромосоме(ам) включает стадии:

S100: прежде всего, секвенируют полный геном ядросодержащих эритроцитов, чтобы получить первый результат секвенирования. Секвенирование полного генома было детализировано выше и не повторяется.

S200: известную последовательность первой хромосомы делят на окна.

Для анализа данных секвенирования ядросодержащих эритроцитов, прежде всего, известную последовательность первой хромосомы делят на окна, и эти окна независимо имеют заранее задаваемый размер, соответственно. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения размеры этих окон могут быть одинаковыми, могут также быть различными и не очень ограничиваются. В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения заранее задаваемые размеры окон в указанном множестве являются одинаковыми. Предпочтительно все заранее задаваемые размеры окон в указанном множестве составляют 60 т.п.о. Таким образом, можно увеличить эффективность определения анеуплоидии по хромосоме(ам) в ядросодержащих эритроцитах. Кроме того, квалифицированные в данной области техники специалисты могут выбрать область последовательности первой хромосомы, охватываемую этими окнами, при необходимости.

S300: определяют число данных секвенирования, относящихся к каждому окну.

После получения данных секвенирования полученные данные секвенирования совмещают с известной последовательностью первой хромосомы, и таким образом полученные данные секвенирования можно разделить на окна с заранее задаваемыми размерами, соответственно. Квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что любой известный способ или средство можно выбрать для выполнения совм