Борьба с жесткокрылыми насекомыми-вредителями

Борьба с жесткокрылыми насекомыми-вредителями

Реферат

ОБЛАСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение относится, в общем, к борьбе с вредителями, которые вызывают повреждение сельскохозяйственных культур при процессах питания, а конкретнее к борьбе с жесткокрылыми вредителями посредством композиции, включающей синергичные уровни активного в отношении жесткокрылых белкового токсина и активного в отношении чешуекрылых белкового токсина. Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции и способам использования такой композиции, включающей белковые токсины.

ПРЕДПОСЫЛКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Жесткокрылые насекомые считаются некоторыми из наиболее важных вредителей сельскохозяйственных культур. Например, виды кукурузного корневого червя являются наиболее разрушительными вредителями кукурузы, вызывая убытки, оцениваемые более чем в 1 миллиард долларов ежегодно. Важные виды вредителя - кукурузного корневого червя включают: Diabrotica virgifera virgifera, западный кукурузный корневой червь; D. longicornis barberi, северный кукурузный корневой червь, D. undecimpunctata howardi, южный кукурузный корневой червь, и D. virgifera zeae, мексиканский кукурузный корневой червь. Колорадский жук (СРВ; Leptinotarsa decemlineatd) является другим примером жесткокрылого насекомого, которое представляет собой серьезного вредителя картофеля, томата и баклажана по всему миру.

[0003] С жесткокрылых вредителей, главным образом, контролируют посредством интенсивных применений химических пестицидов, которые действуют через ингибирование роста насекомых, предотвращение питания насекомых или размножения или вызывают гибель. Можно, таким образом, достигнуть соответствующего контроля насекомых, но эти химические вещества могут иногда также влиять на других полезных насекомых. Другой проблемой, возникающей в результате широкого применения химических пестицидов, является появление резистентных видов насекомых. Ее частично уменьшили посредством различных агротехнических приемов в отношении резистентности, но существует увеличивающаяся потребность в альтернативных средствах контроля вредителей.

[0004] Cry-белки Bacillus thuringiensis (Bt) (также называемые δ-эндотоксины) представляют собой белки, которые формируют кристаллический матрикс в Bacillus, которые, как известно, обладают инсектицидной активностью при поглощении определенными насекомыми. Более 180 голотипов Cry-белков в 58 семействах были идентифицированы и названы. Различные Cry-белки были классифицированы на основе их спектра активности и гомологии последовательности. До 1990 главные классы определяли по их спектру активности (Hofte and Whitely, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242-255), но совсем недавно была разработана новая номенклатура, которая систематически классифицирует Cry-белки на основе гомологии аминокислотной последовательности, скорее чем на особенностях целевых насекомых (Crickmore et al. 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62: 807-813).

[0005] Гены, кодирующие Cry-белки, были выделены, а их экспрессия в сельскохозяйственных культурах, как было показано, обеспечивала другой инструмент для контроля важных с экономической точки зрения насекомых-вредителей. Такие трансгенные растения, экспрессирующие Cry-белки, были коммерциализированы, давая возможность фермерам уменьшать или увеличивать применения химических средств контроля насекомых. Активные в отношении жесткокрылых Cry-белки, пригодные для трансгенных растений, включают, например, Cry3A, Cry3B и комплекс Cry34/Cry35. Примеры активных в отношении чешуекрылых Cry-белков, которые были экспрессированы в трансгенных растениях, включают, например, Cry1A (например, Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac), Cry1B, Cry1F и Cry2, в числе прочих.

[0006] Другое семейство инсектицидных белков, продуцируемых видами Bacillus в течение вегетативной стадии роста (вегетативные инсектицидные белки (Vip)), были также идентифицированы. В патентах США №№5877012, 6107279 и 6137033, которые включены в данном документе посредством ссылки, описывается новый класс инсектицидных белков под названием Vip3. В других раскрытиях, включая WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546 и WO 99/57282, были также идентифицированы гомологи белков класса Vip3. Последовательности, кодирующие Vip3, кодируют приблизительно 88 кДа белки, которые обладают инсектицидной активностью в отношении широкого спектра чешуекрылых вредителей, включая, но без ограничений, совку-ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon), совку травяную (FAW, Spodoptera frugiperdd), листовертку-почкоеда табака (TBW, Heliothis virescens), точильщика сахарного тростника, (SCB, Diatraea saccharalis), точильщика кукурузного стебля малого (LCB, Elasmopalpus lignosellus) и совку хлопковую (CEW, Helicoverpa zea), а при экспрессии в трансгенных растениях, например, кукурузе (Zea mays), предоставляют защиту для растения от повреждения, вызываемого при поедании насекомым.

[0007] Существует постоянная потребность в композициях и способах применения таких композиций с инсектицидной активностью, например, для применения при защите сельскохозяйственных культур или контроле болезни, опосредованной насекомыми. Необходимо, чтобы новые композиции преодолели проблему устойчивости к существующим инсектицидам или предотвратили развитие устойчивости к существующим подходам с использованием трансгенных растений. В идеале такие композиции обладают высокой токсичностью и являются эффективными при оральном поглощении целевым вредителем. Таким образом, любое изобретение, которое обеспечило композиции, в которых любые из этих свойств усилены, будет представлять шаг вперед в настоящем уровне техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Настоящее изобретение обеспечивает улучшенные композиции и способы контроля жесткокрылых насекомых-вредителей, которые включает нанесение на место, где жесткокрылое насекомое может поглотитьсинергетически эффективное количество по меньшей мере одного активного в отношении жесткокрылых токсина и по меньшей мере одного активного в отношении чешуекрылых токсина. Дополнительно обеспечивается способ усиленной защиты трансгенной сельскохозяйственной культуры от повреждения, вызванного нападением и заражением жесткокрылыми насекомыми.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0009] Для ясности, определенные выражения, применяемые в настоящем описании, определяют и представляют следующим образом.

[0010] «Активность» означает, что белковые токсины и комбинации таких токсинов действуют как орально активные средства контроля насекомых, оказывают токсическое действие или способны нарушать или сдерживать питание насекомых, которые могут или не могут вызывать гибель насекомого. Если композицию настоящего изобретения доставляют насекомому, результатом является типично гибель насекомого, или насекомое не питается источником, который делает доступной композицию насекомому. Такой композицией может быть трансгенное растение, экспрессирующее комбинации токсинов настоящего изобретения. Одним примером является трансгенная кукуруза, экспрессирующая модифицированный Cry3A-белок и Cry1Ab-белок, который вызывает синергичную активность в отношении питания кукурузного корневого червя на трансгенной кукурузе.

[0011] «Контроль» или «контролирование» насекомых означает подавлять посредством токсического действия способность насекомых-вредителей выживать, расти, питаться и/или размножаться или ограничить связанное с насекомыми повреждение или потерю сельскохозяйственных культур. «Контроль» насекомых может означать или может не означать уничтожение насекомых, хотя это предпочтительно означает уничтожение насекомых.

[0012] Как используется в данном документе, выражение «кукуруза» означает Zea mays или маис и включает все сорта растений, которые можно скрещивать с кукурузой, включая виды дикого маиса.

[0013] «Доставлять» или «доставка» композиции или токсина означает, что композиция или токсин контактирует с насекомым, приводя к токсическому действию и борьбе с насекомым. Данную композицию или токсин можно доставлять многими признанными способами, например, орально путем поглощения насекомым при посредстве экспрессии в трансгенном растении, составленной белковой композиции(ий), распыляемой белковой композиции(ий), матрицы с приманкой или любой другой признанной в настоящем уровне техники системы доставки токсина.

[0014] «Эффективное количество для контроля насекомых» означает ту концентрацию токсина или токсинов, которая подавляет посредством токсического действия способность насекомых выживать, расти, питаться и/или размножаться или ограничивает связанное с насекомыми повреждение или потерю сельскохозяйственных культур. «Эффективное количество для контроля насекомых» может означать или может не означать уничтожение насекомых, хотя оно предпочтительно означает уничтожение насекомых.

[0015] «Кассета экспрессии», как используется в данном документе, означает нуклеиновокислотную последовательность, способную к направленной экспрессии отдельной последовательности нуклеиновой кислоты в соответствующей клетке хозяина, включающую промотор, функционально связанный с представляющей интерес последовательностью нуклеиновой кислоты, которая функционально связана с сигналами терминации. Она также типично, включает последовательности, необходимые для надлежащей трансляции последовательности нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии, включающая представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты, может быть химерной, означая, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению к по меньшей мере одному из ее других компонентов. Кассета экспрессии может также быть таковой, что встречается в природе, но была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Типично, однако, кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, т.е. отдельная последовательность нуклеиновой кислоты кассеты экспрессии не встречается в природе в клетке хозяина, и ее следовало вводить в клетку хозяина или предшественник клетки хозяина путем явления трансформации. Экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты в кассете экспрессии может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию, только когда клетка хозяина подвергается воздействию определенного отдельного внешнего стимула. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор может также быть специфичным к отдельной ткани, или органу или стадии развития.

[0016] «Событие MIR604», или «MIR604 событие», или «MIR604» означает трансгенное событие кукурузы, раскрытое в патенте США №7361813 (включен в данный документ посредством ссылки), которое имеет включенный в ее геном трансген cry3A055, раскрытый в патенте США №7230167, и трансген pmi, раскрытый в патенте США №5767378. Таким образом, MIR604, включает первый трансген, кодирующий инсектицидный белок Cry3A055 (модифицированный Cry3A или mCry3A), пригодный для контроля насекомых-вредителей кукурузных корневых червей (Diabrotica spp.), и второй трансген, кодирующий фермент фосфоманнозоизомеразу (PMI), пригодный в качестве выбираемого маркера, который дает возможность кукурузе использовать маннозу в качестве источника углерода.

[0017] «Событие MIR162», или «MIR162 событие», или «MIR162 событие» означает трансгенное событие кукурузы, раскрытое в международной публикации WO 07/142840, в геном которого включен трансген vip3Aa20 и трансген pmi. Таким образом, MIR162 включает первый трансген, кодирующий инсектицидный белок Vip3Aa20, пригодный для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, и второй трансген, кодирующий фермент фосфоманнозоизомеразу (PMI), пригодный в качестве выбираемого маркера, который дает возможность кукурузе использовать маннозу в качестве источника углерода.

[0018] «Событие Bt11», или «Bt11 событие», или «Bt11 событие» означает трансгенное событие кукурузы, раскрытое в патенте США №6114608 (включен в данной документ посредством ссылки), в геном которого включен трансген cry1Ab и трансген pat. Таким образом, Bt11 включает первый трансген, кодирующий инсектицидный белок Cry1Ab, пригодный для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, и второй трансген, кодирующий фермент PAT, пригодный в качестве выбираемого маркера, который предоставляет кукурузе устойчивость к гербицидам.

[0019] «Ген» представляет собой определенную область, которая локализована внутри генома и которая кроме вышеупомянутой кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты включает другие, в первую очередь регуляторные последовательности нуклеиновой кислоты, ответственные за контроль экспрессии, иными словами транскрипции и трансляции, кодирующего участка. Ген может также, включать другие 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности и последовательности терминации. Дополнительными элементами, которые могут присутствовать, являются, например, интроны.

[0020] «Ген, представляющий интерес» относится к любому гену, который при перенесении в растение, предоставляет растению необходимую особенность, такую как устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, устойчивость к гербицидам, улучшенную пищевую ценность, улучшенную продуктивность в промышленном процессе или измененную репродуктивную способность. «Ген, представляющий интерес» может также являться таковым, который переносят в растения для продукции коммерчески ценных ферментов или метаболитов в растении.

[0021] Как используется в данном документе, выражение «растениевод» означает человека или субъекта, который занимается сельским хозяйством, выращивая живые организмы, такие как сельскохозяйственные культуры, для пищевых или сырьевых материалов.

[0022] «Гетерологичная» последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, по природе не связанную с клеткой хозяина, в которую ее вводят, включая не встречающиеся в природе множественные копии встречающейся в природе последовательности нуклеиновой кислоты.

[0023] «Гомологичная» последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, по природе связанную с клеткой хозяина, в которую ее вводят.

[0024] «Инсектицидная» определяется как токсичная биологическая активность, способствующая контролю насекомых, предпочтительно путем их уничтожения.

[0025] «Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты или выделенный белок представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты или белок, который благодаря человеку находится отдельно от его естественного окружения и, таким образом, не является природным продуктом. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты или белок могут находиться в очищенной форме или могут находиться в неестественном окружении, таком как, например, рекомбинантная клетка хозяина. Например, нативный Cry-белок в Bacillus thuringiensis не выделен, но тот же самый Cry-белок в трансгенном растении является выделенным.

[0026] «Модифицированный Cry3A (mCry3A)» означает ген или белок, пригодный для контроля насекомых-вредителей кукурузных корневых червей (Diabrotica spp.), раскрытый в патенте США №7030295, опубликованном 18 апреля 2006, который в данный документе включен посредством ссылки.

[0027] «Молекула нуклеиновой кислоты» или «последовательность нуклеиновой кислоты» представляет собой линейный сегмент одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, которую можно выделить из любого источника. В контексте настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой предпочтительно сегмент ДНК.

[0028] «Растение» представляет собой любое растение на любой стадии развития, в частности семенное растение.

[0029] «Растительная клетка» представляет собой структурную и физиологическую единицу растения, включающую протопласт и клеточную стенку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной одиночной клетки или культивируемой клетки или в качестве части более высокоорганизованной единицы такой как, например, ткань растения, орган растения или целое растение.

[0030] «Культура растительных клеток» означает культуры растительных единиц, таких как, например, протопласты, клетки в культуре клеток, клетки в тканях растения, пыльце, пыльцевых трубках, семязачатках, зародышевых мешках, зиготах и зародышах на различных стадиях развития.

[0031] «Растительный материал» относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, отросткам, клеточным или тканевым культурам или любым другим частям или продуктам растения.

[0032] «Орган растения» представляет собой отдельные и видимо структурированные и дифференцированные части растения, такие как корень, стебель, лист, цветочная почка или зародыш.

[0033] «Ткань растения», как используется в данном документе, означает группу растительных клеток, организованных в структурную и функциональную единицу. Любая ткань растения inplanta или в культуре включена. Данное выражение включает, но без ограничений, целые растения, органы растений, семена растений, тканевую культуру и любые группы растительных клеток, организованных в структурные и/или функциональные единицы. Применение данного выражения в сочетании с или в отсутствие любого специфичного типа ткани растения, как перечислено выше или в в отношениином случае охвачено данным определением, не предназначено для исключения любого другого типа ткани растения.

[0034] «Трансформация» представляет собой процесс введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку хозяина или организм. В частности, «трансформация» означает стабильную интеграцию молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма.

[0035] «Трансформированный/трансгенный/рекомбинантный» относится к организму хозяина, такому как бактерия или растение, в который ввели гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может стабильно интегрироваться в геном хозяина, или молекула нуклеиновой кислоты может также присутствовать в качестве внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может быть самореплицирующейся. Подразумевается, что трансформированные клетки, ткани или растения охватывают не только конечный продукт процесса трансформации, но также их трансгенное потомство. «Нетрансформированный», «нетрансгенный» или «нерекомбинантный» хозяин относится к организму дикого типа, например, бактерии или растению, которые не содержат гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.

[0036] Класс белков «Vip3», включает, например, Vip3Aa, Vip3Ab, Vip3Ac, Vip3Ad, Vip3Ae, VipAf, Vip3Ag, Vip3Ba и Vip3Bb, и их гомологи. «Гомолог» означает, что обозначенный белок или полипептид имеет определенное отношение к другим членам белков класса Vip3. «Vip3Aa20» (номер доступа в GeneBank DQ539888) представляет собой Vip3 гомолог присущий только событию MIR162. Он был создан посредством спонтанных мутаций, введенных в оптимизированный для кукурузы ген vip3Aa19 (номер доступа в GeneBank DQ539887) в течение процесса трансформации растения.

[0037] Номенклатура, применяемая в данном документе для оснований ДНК и аминокислот, является такой, как изложено в 37 C.F.R. § 1.822.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0038] Настоящее изобретение относится к композициям и способам синергичного контроля жесткокрылых насекомых-вредителей, которое, включает нанесение на место, где жесткокрылое насекомое может питаться, синергетически эффективной композиции, содержащей по меньшей мере один активный в отношении жесткокрылых токсин и по меньшей мере один активный в отношении чешуекрылых токсин. В настоящем уровне техники хорошо известно, что если два независимых белка не являются токсичными по отдельности, они не будут токсичными при комбинировании. Также хорошо известно, что, комбинируя белок без активности в отношении целевого вредителя с белком, активным в отношении этого целевого вредителя, неактивный белок не увеличит активность уже активного белка.

[0039] Согласно настоящему изобретению в данной работе было неожиданно обнаружено, что применение комбинации по меньшей мере одного активного в отношении жесткокрылых белкового токсина и по меньшей мере одного активного в отношении чешуекрылых белкового токсина демонстрирует значительное синергичное действие (то есть конечный контроль жесткокрылых насекомых значительно больше чем тот, которую можно было предвидеть из контроля жесткокрылых насекомых активным в отношении жесткокрылых токсином, применяемым отдельно). Данное синергичное действие обеспечивает коммерчески применимый уровень контроля жесткокрылых насекомых и помогает уменьшить развитие устойчивости насекомых к отдельному токсину.

[0040] В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способ контроля жесткокрылого насекомого-вредителя, причем способ включает доставку жесткокрылому вредителю или в его окружающую среду композиции, содержащей по меньшей мере один активный в отношении жесткокрылых белок и по меньшей мере один активный в отношении чешуекрылых белок, где данная композиция контролирует жесткокрылого вредителя в большей степени, чем можно было бы ожидать за счет любого отдельного активного в отношении жесткокрылых белка, включенного в эту композицию отдельно.

[0041] В одном аспекте данного варианта осуществления активный в отношении жесткокрылых белок представляет собой модифицированный Cry3A, а активный в отношении чешуекрылых белок представляет собой белок Cry1 или белок Vip3. В еще одном варианте осуществления Cry1-белок представляет собой Cry1Ab.

Примеры Cry1Ab-белка имеют следующие номера доступа в GenBank: Cry1Ab1 (ААА22330), Cry1Ab2 (ААА22613), Cry1Ab3 (AAA22561), Cry1Ab4 (BAA00071), Cry1Ab5 (CAA28405), Cry1Ab6 (AAA22420), Cry1Ab7 (CAA31620), Cry1AbS (AAA22551), Cry1Ab9 (CAA38701), Cry1Ab10 (A29125), Cry1Ab11 (112419), Cry1Ab12 (AAC64003), Cry1Ab13 (AAN76494), Cry1Ab14 (AAG16877), Cry1Ab15 (AA013302), Cry1Ab16 (AAK55546), Cry1Ab17 (AAT46415), Cry1Ab18 (AAQ88259), Cry1Ab19 (AAW31761), Cry1Ab20 (ABB72460), Cry1Ab21 (ABS18384), Cry1Ab22 (ABW87320), Cry1Ab23 (HQ439777), Cry1Ab24 (HQ439778), Cry1Ab25 (HQ685122) и Cry1Ab26 (HQ847729). Еще в одном варианте осуществления Cry1Ab-белок является тем белком, который включен в событие Bt11 и раскрыт в патенте США №6114608. Специалист признает, что другие активные в отношении жесткокрылых Cry-белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry3B, Cry8 и Cry34/Cry35. Специалист также признает, что другие активные в отношении чешуекрылых белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry1E, Cry1F, Cry1G, Cry1H, Cry1J, Cry2A и Cry9. Белок Vip3 можно выбрать из группы, состоящей из Vip3A, Vip3B и Vip3C. В одном варианте осуществления Vip3A-белок представляет собой Vip3Aa20. Однако специалист признает, что другие белки Vip3 являются пригодными в настоящем изобретении.

[0042] В еще одном аспекте данного варианта осуществления жесткокрылый вредитель представляет собой колорадского жука или кукурузного корневого червя. В другом варианте осуществления кукурузный корневой червь представляет собой западного кукурузного корневого червя, северного кукурузного корневого червя, южного кукурузного корневого червя или мексиканского кукурузного корневого червя.

[0043] В другом варианте осуществления охваченного способа данная композиция представляет собой трансгенное растение, экспрессирующее активный в отношении жесткокрылых белок и активный в отношении чешуекрылых белок. В одном аспекте данное трансгенное растение выбирают из группы, состоящей из сои, хлопка, рапса, канолы, овощей, подсолнечника, табака, томата, сахарного тростника, риса, пшеницы, кукурузы, ржи, ячменя, дерна и фуражной сельскохозяйственной культуры. В другом аспекте трансгенное растение представляет собой трансгенную кукурузу. В еще одном аспекте трансгенная кукуруза представляет собой селекционный гибрид, включающий трансгенные события кукурузы MIR604 и Bt11. В другом аспекте трансгенная кукуруза представляет собой селекционный гибрид, включающий трансгенные события кукурузы MIR604, Bt11 и MIR162.

[0044] В другом варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способ контроля вредителя-кукурузного корневого червя, причем способ включает доставку вредителю-кукурузному корневому червю или в его окружающую среду композиции, содержащей модифицированный белок Cry3A (mCry3A) и белок Cry1Ab, где данная композиция контролирует вредителя-кукурузного корневого червя в большей степени, чем можно было бы ожидать за счет белка mCry3A отдельно.

[0045] В другом варианте осуществления данная композиция представляет собой трансгенную кукурузу. В еще одном варианте осуществления трансгенная кукуруза, включает событие MIR604 и событие Bt11.

[0046] В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает композицию для контроля жесткокрылых, содержащую по меньшей мере один активный в отношении жесткокрылых белок и по меньшей мере один активный в отношении чешуекрылых белок, где данная композиция контролирует жесткокрылых вредителей в большей степени, чем можно было бы ожидать за счет любого отдельного активного в отношении жесткокрылых белка, включенного в данную композицию отдельно.

[0047] В одном аспекте данного варианта осуществления активный в отношении жесткокрылых белок представляет собой модифицированный Cry3A, и активный в отношении чешуекрылых белок представляет собой белок Cry1 или белок Vip3. В другом варианте осуществления Cry1-белок представляет собой Cry1Ab. Примеры белка Cry1Ab имеют следующие номера доступа в GenBank: Cry1Ab1 (AAA22330), Cry1Ab2 (AAA22613), Cry1Ab3 (AAA22561), Cry1Ab4 (BAA00071), Cry1Ab5 (CAA28405), Cry1Ab6 (AAA22420), Cry1Ab7 (CAA31620), Cry1Ab8 (AAA22551), Cry1Ab9 (CAA38701), Cry1Ab10 (A29125), Cry1Ab11 (112419), Cry1Ab12 (AAC64003), Cry1Ab13 (AAN76494), Cry1Ab14 (AAG16877), Cry1Ab15 (AA013302), Cry1Ab16 (AAK55546), Cry1Ab17 (AAT46415), Cry1Ab18 (AAQ88259), Cry1Ab19 (AAW31761), Cry1Ab20 (ABB72460), Cry1Ab21 (ABS18384), Cry1Ab22 (ABW87320), Cry1Ab23 (HQ439777), Cry1Ab24 (HQ439778), Cry1Ab25 (HQ685122) и Cry1Ab26 (HQ847729). Еще в одном варианте осуществления белок Cry1Ab является тем белком, который включен в событие Bt11 и раскрыт в патенте США №6114608. Специалист признает, что другие активные в отношении жесткокрылых Cry-белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry3B, Cry8 и Cry34/Cry35. Специалист также признает, что другие активные в отношении чешуекрылых белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry1E, Cry1F, Cry1G, Cry1H, Cry1J, Cry2A и Cry9. Белок Vip3 можно выбрать из группы, состоящей из Vip3A, Vip3B и Vip3C. В одном варианте осуществления Vip3A белок представляет собой Vip3Aa20. Однако специалист в данной области техники признает, что другие белки Vip3 являются пригодными в настоящем изобретении.

[0048] В еще одном аспекте данного варианта осуществления жесткокрылый вредитель представляет собой колорадского жука или кукурузного корневого червя. В другом варианте осуществления кукурузный корневой червь представляет собой западного кукурузного корневого червя, северного кукурузного корневого червя, южного кукурузного корневого червя или мексиканского кукурузного корневого червя.

[0049] Еще в одном варианте осуществления данная композиция представляет собой трансгенное растение, экспрессирующее активный в отношении жесткокрылых белок и активный в отношении чешуекрылых белок. В одном аспекте трансгенное растение выбирают из группы, состоящей из сои, хлопка, рапса, канолы, овощей, подсолнечника, табака, томата, сахарного тростника, риса, пшеницы, кукурузы, ржи, ячменя, дерна и фуражной сельскохозяйственной культуры. В другом аспекте трансгенное растение представляет собой трансгенную кукурузу. В другом аспекте трансгенное растение представляет собой трансгенную кукурузу. В другом аспекте трансгенная кукуруза представляет собой селекционный гибрид, включающий трансгенные события кукурузы MIR604 и Bt11. В другом аспекте трансгенная кукуруза представляет собой селекционный гибрид, включающий трансгенные события кукурузы MIR604, Bt11 и MIR162.

[0050] В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способ обеспечения растениевода средствами контроля популяции жесткокрылых насекомых-вредителей, включающий поставку или продажу растениеводу трансгенных семян, включающих нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один активный в отношении жесткокрылых белок и по меньшей мере один активный в отношении чешуекрылых белок, где трансгенные растения, выращенные из указанных семян, контролируют жесткокрылых вредителей в большей степени, чем можно было бы ожидать за счет любого отдельного активного в отношении жесткокрылых белка, включенного в него отдельно.

[0051] В другом варианте осуществления активный в отношении жесткокрылых белок представляет собой модифицированный Cry3A, а активный в отношении чешуекрылых белок представляет собой белок Cry1 или белок Vip3. В еще одном варианте осуществления Cry1-белок представляет собой Cry1Ab. Примеры белка Cry1Ab имеют следующие номера доступа в GenBank: Cry1Ab1 (AAA22330), Cry1Ab2 (AAA22613), Cry1Ab3 (AAA22561), Cry1Ab4 (BAA00071), Cry1Ab5 (CAA28405), Cry1Ab6 (AAA22420), Cry1Ab7 (CAA31620), Cry1Ab8 (AAA22551), Cry1Ab9 (CAA38701), Cry1Ab10 (A29125), Cry1Ab11 (112419), Cry1Ab12 (AAC64003), Cry1Ab13 (AAN76494), Cry1AbH (AAG16877), Cry1AM5 (AA013302), Cry1Ab16 (AAK55546), Cry1Ab17 (AAT46415), Cry1Ab18 (AAQ88259), Cry1Ab19 (AAW31761), Cry1Ab20 (ABB72460), Cry1Ab21 (ABS18384), Cry1Ab22 (ABW87320), Cry1Ab23 (HQ439777), Cry1Ab24 (HQ439778), Cry1Ab25 (HQ685122) и Cry1Ab26 (HQ847729). Еще в одном варианте осуществления белок Cry1Ab является тем белком, который включен в событие Bt11 и раскрыт в патенте США №6114608. Специалист в данной области техники признает, что другие активные в отношении жесткокрылых Cry-белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry3B, Cry8 и Cry34/Cry35. Специалист в данной области техники также признает, что другие активные в отношении чешуекрылых белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry1E, Cry IF, Cry1G, Cry1H, Cry1J, Cry2A и Cry9. Белок Vip3 можно выбрать из группы, состоящей из Vip3A, Vip3B и Vip3C. В одном варианте осуществления Vip3A белок представляет собой Vip3Aa20. Однако специалист в данной области техники признает, что другие белки Vip3 являются пригодными в настоящем изобретении.

[0052] Еще в одном варианте осуществления жесткокрылый вредитель представляет собой колорадского жука или кукурузного корневого червя. В одном варианте осуществления кукурузный корневой червь представляет собой западного кукурузного корневого червя, северного кукурузного корневого червя, южного кукурузного корневого червя или мексиканского кукурузного корневого червя.

[0053] В другом варианте осуществления семена трансгенного растения и растение выбирают из группы, состоящей из сои, хлопка, рапса, канолы, овощей, подсолнечника, табака, томата, сахарного тростника, риса, пшеницы, кукурузы, ржи, ячменя, дерна и фуражной сельскохозяйственной культуры. В другом варианте осуществления семена трансгенного растения и растение представляет собой семена и растение трансгенной кукурузы.

[0054] Коэкспрессия по меньшей мере одного активного в отношении жесткокрылых белка и по меньшей мере одного активного в отношении чешуекрылых белка в том же самом трансгенном растении может быть достигнута при помощи генной инженерии растения, чтобы оно содержало и экспрессировало все гены, необходимые в так называемом молекулярном гибриде. В качестве альтернативы растение, исходное растение 1, можно подвергать генной инженерии для экспрессии определенных генов, кодирующих инсектицидные белки настоящего изобретения. Второе растение, исходное растение 2, можно подвергать генной инженерии для экспрессии других определенных генов, кодирующих инсектицидные белки настоящего изобретения. Путем скрещивания исходного растения 1 с исходным ратстением 2 получают потомство растений, которые экспрессируют все гены, введенные исходным растениям 1 и 2, обозначенные в данном документе как "селекционный гибрид". Такой селекционный гибрид для создания композиции настоящего изобретения может быть достигнут путем скрещивания кукурузы, включающей событие MIR604, с кукурузой, включающей событие Bt11. Таким образом, потомство селекционного гибрида включает белок mCry3A и белок Cry1Ab, раскрытые в данном документе, для обеспечения синергичного контроля жесткокрылых насекомых-вредителей.

[0055] Композиции настоящего изобретения, например, семена трансгенного растения, можно также обрабатывать инсектицидным покрытием для семян, как описано в патентах США №№5849320 и 5876739, которые включены в данный документ посредством ссылки. Где как инсектицидное покрытие для семян, так и трансгенные семена настоящего изобретения являются активными в отношении того же самого целевого насекомого, причем данная комбинация является пригодной (i) в способе дополнительного усиления активности синергичной композиции настоящего изобретения в отношении целевого насекомого и (ii) в способе предотвращения развития устойчивости к композиции настоящего изобретения посредством обеспечения еще одного механизма действия в отношении целевого насекомого. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ усиления активности в отношении или предотвращения развития устойчивости целевого насекомого, например, кукурузного корневого червя, включающий нанесение инсектицидного покрытия для семян на трансгенные семена настоящего изобретения. Такие химические обработки могут включать инсектициды, фунгициды или нематоциды. Примеры таких инсектицидов включают, без ограничений, динотефуран, такой как тиаметоксам, имидаклоприд, ацетамиприд, нитенпирам, нидинотефуран, хлорфенапир, тебуфенпирад, тебуфенозид, метоксифенозид, галофенозид, триазамат, авермектин, спиносад, фипринол, ацефат, фенамифос, диазинон, хлорпирифос, хлорпирифон-метил, малатион, карбарил, алдикарб, карбофуран, тиодикарб и оксамил. Даже в том случае, когда инсектицидное покрытие для семян является активным в отношении разных насекомых, инсектицидное покрытие для семян является пригодным для расширения диапазона контроля насекомых, например, посредством добавления инсектицидного покрытия для семян, которое проявляет активность в отношении чешуекрылых насекомых, на трансгенные семена настоящего изобретения, которые проявляет активность в отношении жесткокрылых насекомых, при этом полученные покрытые трансгенные семена контролируют как чешуекрылых, так и жесткокрылых насекомых-вредителей.

ПРИМЕРЫ

[0056] Настоящее изобретение будет далее описано посредством ссылки на следующие подробные примеры. Эти примеры обеспечивают только для иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Стандартные методики рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, применяемые в данной работе, хорошо известны в настоящем уровне техники и описаны J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); T.J. Silhavy, M.L. Herman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) и Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter, et al., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992), и Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998).

Пример 1. Взаимодействие между токсинами в отношении колорадского жука

[0057] В данном примере влияния mCry3A на токсичность Cry1Ab и влияния Cry1Ab на токсичность mCry3A измеряют при помощи биоанализов, тестируя инсектицидные белки отдельно и в комбинации. Событие кукурузы Bt11 и событие кукурузы MIR604 экспрессируют инсектицидные белки Cry1Ab и модифицированный Cry3A (mCry3A), соответственно. Cry1Ab является активным в отношении определенных Lepidoptera, в то время как mCry3A является активным в отношении некоторых видов Coleoptera. В Соединенных Штатах (США) основное применение кукурузы Bt11 предназначено для контроля мотылька кукурузного (Ostrinia nubilalis; ECB), а главными целями кукурузы MIR604 являются западный кукурузный корневой червь (Diabrotica virgifera virgifera; WCR) и северный кукурузный корневой червь (Diabrotica longicornis barberi; NCR). Посредством обычных селекционных гибридов растений Bt11 и MIR604 были созданы гибриды маиса Bt11 х MIR604 с пакетированными генами, продуцирующие как Cry1Ab, так и mCry3A. Эти гибриды маиса обеспечивают борьбу с ECB, а также WCP и NCR.

[0058] Применяемыми индикаторными организмами являются ECB первой личиночной стадии, который является высокочувствительным к Cry1Ab и колорадский жук первой личиночной стадии (Leptinotarsa decemlineata; СРВ), который является высокочувствительным к mCry3A. ECB является нечувствительным к mCry3A, а СРВ является нечувствительным к Cry1Ab. Хотя СРВ не является целевым вредителем маиса MIR604 или Bt11 х MIR604, он является более восприимчивым к лабораторному тестированию, чем виды корневого червя, намеченные посредством mCry3A. Личинки как ECB, так и СРВ легко подвергать биоанализу с применением стандартных искусственных сред при тех же самых лабораторных условиях. Поскольку первые личиночные стадии этих видов являются высокочувствительными либо к Cry1Ab, либо к mCry3A, возможность обнаружения многих значительных изменений в токсичности любого белк