Средства для стимуляции регенерации тканей путем привлечения мезенхимных стволовых клеток и/или плюрипотентных стволовых клеток костного мозга в кровь

Средства для стимуляции регенерации тканей путем привлечения мезенхимных стволовых клеток и/или плюрипотентных стволовых клеток костного мозга в кровь

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к стимулирующим регенерацию тканей средствам, которые вводят в ткань, отличную от ткани, нуждающейся в регенерации.

Уровень техники

Регенеративная медицина нацелена на функциональную и структурную регенерацию поврежденных органов с использованием клеток или тканей, культивированных и обработанных ex vivo. Например, культивируемый слой кожи получают взятием клеток кожи от пациента или другого индивидуума, культивированием их вне организма и преобразованием их в форму слоя, а затем трансплантируют на поврежденную кожу. В регенеративной медицине для получения клеток, используемых для лечения, требуются культивирование или пролиферация клеток ex vivo. Поскольку методика культивирования может вызывать повреждение клеток (старение, генез опухолей или контаминация бактериями, вирусами и т.д.), для поддерживания безопасности необходимо, чтобы получение проводили на оборудовании, сертифицированном как удовлетворяющее стандартам Good Manufacturing Practice (GMP). Ожидается, что это приведет к проблеме высокой стоимости лечения.

Между тем, живой организм имеет механизмы регенерации для репарации повреждений в случае повреждения органов. Однако известно, что, если поврежденная область является крупной, они заполняются нефункциональными рубцовыми тканями. Заживление повреждения такими рубцовыми тканями становится ингибирующим фактором для регенерации нервов при инфаркте головного мозга или повреждении спинного мозга, становится этиологическим фактором для разрыва сердца при инфаркте миокарда, или приводит к образованию келоидного рубца в хирургических ранах или при обширных ожогах, тем самым приводя к в высокой степени плохому прогнозу и качеству жизни (QOL) в косметическом аспекте. Если бы можно было активировать собственные регенерационные механизмы организма для репарации повреждения ткани, то можно ожидать, что возможно индуцировать регенерацию поврежденных тканей (органов) с функциональными тканями, а не рубцевание.

Известно, что костный мозг содержит мезенхимальные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в кость, хрящ, жировую ткань и другие, а также гемопоэтические стволовые клетки, которые дифференцируются в лейкоциты, эритроциты и т.п. Недавно было установлено, что костный мозг также содержит плюрипотентные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в эпителиальные и нервные клетки.

Документы уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: WO 2008/053892

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачи, решаемые изобретением

Задачей настоящего изобретения является разработка нового терапевтического способа, посредством которого активируется механизм физиологической регенерации/репарации для индукции заживления поврежденных тканей, тем самым осуществляя лечение трудноизлечимых заболеваний, таких как обширное изъязвление кожи, трудноизлечимые переломы костей и инфаркт головного мозга, которые трудно лечить общепринятыми способами терапии.

Средства для решения задач

Эффект HMGB-1 и S100A8 при привлечении происходящих из костного мозга клеток на язву кожи в процессе заживления язвы кожи оценивали с использованием мышей. Результат продемонстрировал, что введение HMGB-1 или S100A8 в венозную кровь, которая была нецелевой областью, отдаленной от изъязвления кожи, приводило к привлечению происходящих из костного мозга клеток к язве кожи. Затем оценивали эффект внутривенного введения HMGB-1 и S100A8 на стимуляцию заживления язвы кожи. В результате, заживление язвы кожи успешно стимулировалось HMGB-1 и S100A8, вводимыми в кровеносный сосуд, который был нецелевой областью, отдаленной от области изъязвления. Кроме того, оценка их эффекта стимуляции заживления язвы кожи без рубцов показала, что внутривенное введение HMGB-1 может стимулировать раннее закрытие и заживление без рубцов язвы кожи путем усиления дальнейшего привлечения происходящих из костного мозга клеток в область изъязвления.

Более того, тестировали модель инфаркта головного мозга у мышей на присутствие происходящих из костного мозга клеток в их головном мозге. В результате в головном мозге мышей, которым после индукции инфаркта головного мозга внутривенно вводили HMGB-1, были выявлены происходящие из костного мозга клетки, экспрессирующие маркеры нервных клеток. Затем оценка эффекта уменьшения инфаркта головного мозга продемонстрировала значительное улучшение у мышей после инфаркта головного мозга, которым внутривенно вводили HMGB-1, по сравнению с контрольными мышами. Кроме того, оценка улучшения уровня выживания после инфаркта головного мозга показала, что внутривенное введение HMGB-1 приводило к увеличению уровня выживаемости мышей.

Дальнейшую оценку проводили с использованием мышей для установления того, были ли плюрипотентные стволовые клетки костного мозга из областей, отличных от области перелома костей, вовлечены в процесс заживления перелома. Результат показал, что происходящие из костного мозга клетки мигрировали из областей, отдаленных от поврежденной области, в область перелома кости для репарации поврежденной ткани.

Более того, для оценки активности внутривенно вводимого HMGB-1 при привлечении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в поврежденную область проводили тест с использованием модели перелома костей на мышах. Было выявлено, что внутривенное введение HMGB-1 приводило к накоплению мезенхимальных стволовых клеток, привлеченных в кровь в области перелома кости.

Исходя из этих открытий, настоящая заявка относится к следующим изобретениям:

[1] средство, стимулирующее регенерацию тканей, содержащее любое из:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3;

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) экстракт клеток или тканей; и

(q) связывающая гепарин фракция экстракта клеток или тканей;

где средство вводят в ткань, отличную от ткани, нуждающейся в регенерации.

[2] средство согласно [1], которое вводят парентерально;

[3] средство согласно [2], которое вводят путем инъекции;

[4] средство согласно [1], которое вводят внутрисосудистым путем, внутримышечно, подкожно, внутрикожным путем или внутрибрюшинно;

[5] средство согласно любому из [1]-[4], где экстракт клеток или тканей получают способом, включающим стадию погружения клетки или ткани в растворитель;

[6] средство согласно любому из [1]-[4], где связывающую гепарин фракцию экстракта клеток или тканей получают способом, включающим стадии:

(a) погружения клетки или ткани в растворитель;

(b) контактирования иммобилизованного гепарина с экстрактом, полученным на стадии (a); и

(c) элюирования связывающей гепарин фракции с иммобилизованного гепарина;

[7] средство согласно любому из [1]-[6] для применения в стимуляции регенерации нервной, костной или кожной ткани;

[8] набор для стимуляции регенерации ткани, который содержит композицию, содержащую любое из:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3;

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) экстракт клеток или тканей; и

(q) связывающая гепарин фракция экстракта клеток или тканей;

где композицию вводят в ткань, отличную от ткани, нуждающейся в регенерации.

[9] набор согласно [8], который вводят парентерально;

[10] набор согласно [9], который вводят путем инъекции;

[11] набор согласно [8], который вводят внутрисосудистым путем, внутримышечно, подкожно, внутрикожным путем или внутрибрюшинно;

[12] набор согласно любому из [8]-[11], который используют для стимуляции регенерации нервной, костной или кожной ткани;

[13] способ стимуляции регенерации ткани, который включает стадию введения эффективного количества композиции в ткань, отличную от ткани, нуждающейся в регенерации, где композиция содержит любое из:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3;

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) экстракт клеток или тканей; и

(q) связывающая гепарин фракция экстракта клеток или тканей;

[14] способ согласно [13], где введение представляет собой парентеральное введение;

[15] способ согласно [14], где введение представляет собой инъекцию;

[16] способ согласно [13], где введение представляет собой внутрисосудистое, внутримышечное, подкожное, внутрикожное или внутрибрюшинное введение;

[17] способ согласно любому из [13]-[16], который стимулирует регенерацию нервной, костной или кожной ткани;

[18] применение композиции для продуцирования средства, стимулирующего регенерацию тканей, где композиция содержит любое из:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3;

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) экстракт клеток или тканей; и

(q) связывающая гепарин фракция экстракта клеток или тканей;

где средство вводят в ткань, отличную от ткани, нуждающейся в регенерации;

[19] применение согласно [18], где средство вводят парентерально;

[20] применение согласно [19], где введение представляет собой инъекцию;

[21] применение согласно [18], где средство вводят внутрисосудистым путем, внутримышечно, подкожно, внутрикожным путем или внутрибрюшинно;

[22] применение согласно любому из [18]-[21], где средство представляет собой средство для стимуляции регенерации нервной, костной или кожной ткани;

[23] композиция для применения в способе стимуляции регенерации тканей, содержащая любое из:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3;

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) экстракт клеток или тканей; и

(q) связывающая гепарин фракция экстракта клеток или тканей;

где композицию вводят в ткань, отличную от ткани, нуждающейся в регенерации;

[24] композиция согласно [23], которую вводят парентерально;

[25] композиция согласно [24], которую вводят путем инъекции;

[26] композиция согласно [23], которую вводят внутрисосудистым путем, внутримышечно, подкожно, внутрикожным путем или внутрибрюшинно; и

[27] композиция согласно любому из [23]-[26], где способ стимуляции регенерации ткани представляет собой способ стимуляции регенерации нервной, костной или кожной ткани.

Эффекты изобретения

Клеточные факторы роста, такие как HGF, EGF, VEGF и FGF известные как фармацевтические средства для регенерации поврежденных тканей. Их используют, ожидая, что они будут стимулировать рост клеток при введении непосредственно в поврежденную область и окружающие ее ткани.

HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 и S100A9 обладают активностью привлечения плюрипотентных стволовых клеток костного мозга. Плюрипотентные стволовые клетки костного мозга могут дифференцироваться в эпителиальные и нервные клетки, а также в мезенхимальные клетки. В случае обширного повреждения тканей, ожидается, что если бы можно было привлечь плюрипотентные стволовые клетки костного мозга в поврежденную область через кровоток, они будут стимулировать функциональную регенерацию/репарацию поврежденных тканей.

Настоящее изобретение относится к способам стимуляции репарации поврежденных тканей, в которых HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 и S100A9, которые являются факторами для привлечения плюрипотентных стволовых клеток костного мозга, вводят в область, отдаленную от поврежденной области, путем внутривенного введения или сходным с ним, тем самым привлекая плюрипотентные стволовые клетки костного мозга в периферическую кровь. Например, при лечении заболевания глубоко расположенного органа, такого как инфаркт головного мозга, трудно вводить лекарственное средство непосредственно в поврежденную область (головной мозг). С другой стороны, в настоящем изобретении, такое лечение можно проводить путем внутривенного введения, которое широко используют в общей медицинской практике. Таким образом, возможно вводить лекарственное средство в любой концентрации и с любой частотой безопасным и простым образом. Этот эффект является лучшим по сравнению с общепринятыми способами терапии.

Между тем, недавно разработанный способ на основе клеток костного мозга, который, как известно, является эффективным для лечения инфаркта головного мозга, вовлекает сбор клеток из костного мозга пациента и повторное введение клеток в кровоток. Этот способ неизбежно ассоциирован с тяжелой инвазией, поскольку клетки костного мозга необходимо аспирировать ширококанальной иглой, помещенной в костный мозг, который расположен глубоко в организме. Напротив, настоящее изобретение позволяет привлечение клеток костного мозга непосредственно в кровоток путем внутривенного введения средства, и таким образом, не вовлекает тяжелую инвазию, даже когда средство часто вводят пациентам с инфарктом головного мозга.

Плюрипотентные стволовые клетки костного мозга обладают потенциальной способностью дифференцироваться в различные типы клеток, такие как мезенхимальные клетки, эпителиальные клетки и нервные клетки. После миграции в поврежденную область они могут дифференцироваться, в зависимости среды ниши, окружающей поврежденную область, а затем индуцировать репарацию ткани. В регенеративной медицине и клеточной терапии плюрипотентные стволовые клетки костного мозга, которые являются редкими клетками, размножаются путем культивирования ex vivo перед применением для лечения. Однако это требует надлежащего контроля безопасности, поскольку, в отличие от общепринятых фармацевтических средств, существует риск повреждения клеток (перерождение в злокачественные и контаминация бактериями, вирусами и т.д.), которое может возникнуть в процессе культивирования. В настоящем изобретении плюрипотентные стволовые клетки костного мозга привлекаются в периферический кровоток путем введения HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 и/или S100A9. Это является в высокой степени безопасным терапевтическим способом, поскольку клетки не удаляются из организма для искусственного манипулирования.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлен набор фотографий, демонстрирующих процесс очистки HMGB1. HEK293 трансфицировали экспрессирующим вектором, содержащим GST-метку, 6XHis-метку и последовательность расщепления HRV3C на N-конце HMGB1. Культуральный супернатант наносили на никелевую колонку и связывающуюся фракцию элюировали имидазолом. Связавшуюся с никелевой колонкой фракцию обрабатывали HRV3C для отщепления GST-метки и 6XHis-метки от HMGB1. Затем фракции позволяли связаться с аффинной колонкой с гепарином и элюировали хлоридом натрия. Связавшуюся с гепарином фракцию наносили на Q-колонку и элюировали хлоридом натрия. Для детекции степени очистки на каждой стадии очистки каждую связавшуюся с колонкой фракцию подвергали SDS-PAGE, а затем окрашиванию Кумасси.

На фиг.2 представлен набор фотографий, демонстрирующих сигналы GFP в коже и тонких срезах кожи после закрытия язвы. Кожную язву создавали на спине мышей с трансплантированным костным мозгом с GFP, и мышам внутривенно вводили HMGB1 или S100A8. По сравнению с контролем, в коже мышей, которым внутривенно вводили HMGB1 или S100A8, было выявлено много GFP-положительных происходящих из костного мозга клеток.

На фиг.3 представлен график, демонстрирующий площадь язвы кожи, измеренную с течением времени. Язву кожи создавали на спине мышей и мышам внутривенно вводили HMGB1 или S100A8. Через 3 суток после создания язвы наблюдали эффект уменьшения язвы кожи в группе введения HMGB1 по сравнению с контрольной группой. Через 7 суток после создания язвы в группе введения S100A8 наблюдали эффект уменьшения язвы кожи по сравнению с контрольной группой (вертикальная ось, [площадь язвы]/[площадь язвы во время создания]×100; горизонтальная ось, сутки после создания язвы).

На фиг.4 представлен набор фотографий, демонстрирующий результаты окрашивания гематоксилином-эозином (HE) и окрашивания трихромной краской Массона (MT) тонких срезов кожи после закрытия язвы кожи. Язву кожи создавали на спине мышей, и мышам внутривенно вводили HMGB1. У контрольных мышей наблюдали аномальное увеличение коллагеновых волокон, в то время как такое аномальное увеличение коллагеновых волокон было снижено у мышей, которым внутривенно вводили HMGB1.

На фиг.5 представлен набор фотографий, демонстрирующих результат детекции клеток, экспрессирующих нестин (маркер нервных стволовых клеток) и β III тубулин (маркер нейронов). У мышей с трансплантированным костным мозгом с GFP создавали инфаркт головного мозга, а затем проводили им внутривенное введение HMGB1. После введения получали срезы головного мозга и подвергали их иммуногистохимии. На левой фотографии стрелки указывают на GFP-положительные, нестин-положительные клетки. На правой панели стрелки указывают на GFP-положительные, β III тубулин-положительные клетки. Было продемонстрировано, что происходящие из костного мозга клетки экспрессируют маркеры нейронов.

На фиг.6 представлен набор фотографий, демонстрирующих результат детекции областей инфаркта. Получали модель заболевания на мышах для инфаркта головного мозга, а затем им внутривенно вводили HMGB1. После введения получали тонкие срезы головного мозга и подвергали их окрашиванию Ниссля. В случае введения PBS (контроль), в коре наблюдали некротические ткани. В случае введения HMGB1 в коре не было выявлено некротической ткани.

На фиг.7 представлен набор графиков, демонстрирующий уровни выживания в течение 7 суток после создания инфаркта головного мозга. Получали модель заболевания на мышах для инфаркта головного мозга (путем 45-минутной или 60-минутной ишемии), а затем проводили им внутривенное введение HMGB1. Было показано, что введение HMGB1 увеличивает уровень выживаемости в случае как ишемии в течение 45 минут, так и ишемии в течение 60 минут.

На фиг.8 представлен набор фотографий, демонстрирующий, что, когда мышь с трансплантированным костным мозгом с GFP соединяли через кожу с мышью дикого типа, клетки костного мозга мигрировали из химерной мыши с костным мозгом с GFP в область перелома кости правой задней конечности мыши дикого типа и дифференцировались в остеобласты. Мышь с костным мозгом с GFP соединяли через кожу с мышью дикого типа. Затем у мыши дикого типа создавали перелом кости. После заживления перелома кости, было выявлено, что некоторые экспрессирующие остеокальцин остеобласты являются положительными по GFP клетками. Это указывает на то, что в процессе заживления перелома кости, клетки, происходящие из костного мозга, отдаленные от поврежденной области, мигрируют в область перелома кости, а затем дифференцируются в остеобласты для физиологического заживления повреждения.

На фиг.9 представлены фотографии, демонстрирующие накопление флуоресценции GFP, наблюдаемой в трансплантате кожи после трансплантации кожи на спину мышей с трансплантированным костным мозгом с GFP. Сверху слева представлено изображение области трансплантации кожи, наблюдаемое невооруженным глазом, сверху по центру представлено изображение окрашенной HE ткани кожи реципиента вблизи границы между пересаженной кожей и кожей реципиента (показано стрелкой), и сверху справа представлено изображение окрашенной HE ткани трансплантата кожи. Более того, на изображении снизу слева представлено накопление флуоресценции GFP в трансплантированной коже, снизу по центру представлено увеличенное изображение области трансплантации кожи, и снизу справа представлено увеличенное изображение, демонстрирующее накопление флуоресценции GFP на том же увеличенном изображении трансплантата кожи.

На фиг.10 представлен набор фотографий, демонстрирующих происходящие из костного мозга эпидермальные клетки и происходящие из костного мозга дермальные фибробласты, которые накапливались в трансплантированной коже на спине мышей с трансплантированным костным мозгом с GFP. В первом ряду сверху представлены изображения кожи области трансплантации при низком увеличении (× 100), в среднем ряду представлены увеличенные изображения того же самого, демонстрирующие границу эпидермис/дермис при высоком увеличении (× 200), и в нижнем ряду представлены далее увеличенные изображения того же самого, демонстрирующие волосяной фолликул при высоком увеличении (× 200). В крайней левой колонке представлено окрашивание DAPI (ядерное окрашивание), во второй слева колонке представлены флуоресцентные изображения GFP соответствующих областей первого ряда. На третьей колонке слева представлены изображения, демонстрирующие иммуноокрашивание по кератинину 5 (K5). В четвертой колонке слева представлены объединенные изображения для каждого из этих типов флуоресценции. Наблюдали большие количества положительных по GFP эпидермальных клеток и дермальных фибробластов.

На фиг.11 представлен набор фотографий, демонстрирующих результаты анализа способности к миграции/активности происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток в экстракте кожи с использованием камеры Бойдена. На верхнем левом изображении представлены мезенхимальные стволовые клетки, прикрепленные к силиконовой мембране, на нижней стороне камеры, мигрировавшие из верхнего отделения камеры Бойдена в отделение кожного экстракта (нижнее отделение камеры) через тонкие поры в силиконовой мембране, которые окрашены синим пигментом. Окрашенные изображения представлены непосредственно после культивирования (0 ч), после 12 часов (12 ч) и после 24 часов (24 ч) (четыре лунки для каждого случая) сверху. Верхнее правое изображение представляет собой изображение для 0 ч при высоком увеличении. Снизу слева представлено изображение для 12 ч при высоком увеличении. Снизу справа представлено изображение для 24 ч при высоком увеличении.

На фиг.12 представлена фотография, демонстрирующая результат способности к миграции/активности происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, исследованных в препаратах очищенных фракций кожных экстрактов с использованием камеры Бойдена, и соответствие результату SDS-PAGE-электрофореза для каждого препарата очищенной фракции. Слева, дорожка 1 (М.М.): маркер молекулярной массы; дорожка 2 (C.E.): неочищенный экстракт кожи, дорожка 3 (H.A.): связывающаяся с аффинной колонкой с гепарином фракция (полуочищенная фракция); и дорожки 4-13 (A.E.): связывающиеся с анионообменной колонкой фракции (конечная очищенная фракция), элюированные различными концентрациями NaCl, все из которых были окрашены серебром после электрофореза. Кроме того, в конечной очищенной фракции No. 4, которая продемонстрировала наиболее сильную активность миграции происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, окрашенные полосы в окрашенном серебром электрофоретическом геле (дорожка 7) вырезали, а затем подвергали масс-спектрометрии и анализу баз данных. Результат показал, что полоса, указанная стрелкой, представляет собой HMGB1.

На фиг.13 представлена фотография, демонстрирующая результат оценки активности HMGB1 в отношении индукции миграции происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток с использованием камеры Бойдена. Два изображения сверху представляют собой окрашенные изображения происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, которые мигрировали в экстракт кожи. Средние два изображения представляют собой окрашенные изображения происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, которые мигрировали в очищенный препарат HMGB1. Снизу представлены окрашенные изображения происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, которые мигрировали в очищенный препарат HMGB1, который использовали для центральных изображений, но который был нейтрализован добавлением поликлонального антитела против HMGB1 (активность миграции была практически полностью утрачена).

На фиг.14 представлен набор фотографий, демонстрирующий активность HMGB1 в отношении мобилизации происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток in vivo. Фракция HMGB1 (конечная очищенная фракция No. 4) продемонстрировала активность мобилизации, приблизительно в три раза превышающую активность мобилизации контроля (конечная очищенная фракция No.1).

На фиг.15 представлена фотография, демонстрирующая клетки, мобилизованные in vivo фракцией HMGB1 (конечная очищенная фракция No. 4) при высоком увеличении.

На фиг.16 представлен набор фотографий, демонстрирующих изображения сразу после начала культивирования клеток, которые мигрировали в силиконовую трубку. Слева представлено изображение светового поля с мигрирующими клетками, инокулированными в среду, и справа представлено их GFP-флуоресцентное изображение в темном поле.

На фиг.17 представлен набор фотографий, демонстрирующих изображения через 24 часа после начала культивирования клеток, которые мигрировали в силиконовую трубку. На левом изображении представлено изображение в световом поле подобных фибробластам клеток и подобных эпителиальным клеток, которые пролиферировали и прикрепились на пластмассовую чашку для культивирования, и на правом изображении представлено их GFP-флуоресцентное изображение в темном поле.

На фиг.18 представлен набор фотографий, демонстрирующих изображения через 2 недели после начала культивирования клеток, которые мигрировали в силиконовую трубку. На фотографиях слева и справа представлено одно и то же поле зрения, причем слева представлены изображения для светового поля, в то время как справа представлены изображения через флуоресцентный фильтр (флуоресценция GFP выявлена в B и D и флуоресценция кератина 5 выявлена в F). Подобную волосу линейную форму (указана треугольником (стрелка)) наблюдают слева от положительной по костному мозгу с GFP популяции клеток, образующих круговые колонии на пластмассовой чашке для культивирования. F указывает на то, что происходящие из костного мозга клетки морфологически трансформированы в подобную волосу форму, и, кроме того, экспрессируют кератин 5 (указано треугольником (стрелкой)).

На фиг.19 представлен набор фотографий, демонстрирующих семейство HMGB в экстракте кожи новорожденных мышей, детектированное способом вестерн-блоттинга.

На фиг.20 представлена иллюстрация карты экспрессирующего вектора для семейства HMGB в клетках млекопитающих, которое имеет, ниже промотора, энхансер цитомегаловируса и промотор β-актина курицы, для синтеза большого количества мРНК, кодируемой кДНК (комплементарной ДНК) семейства HMGB.

На фиг.21 представлен набор фотографий, демонстрирующих результат вестерн-блоттинга очищенных рекомбинантных слитых белков Flag-метка - семейство HMGB, экспрессироанных в клетках HEK293.

На фиг.22 представлен набор графиков, демонстрирующих активность рекомбинантных HMGB1/HMGB2/HMGB3 в отношении индукции миграции мезенхимальных клеток костного мозга в камере Бойдена. Все рекомбинантные белки продемонстрировали более высокую активность индукции миграции по сравнению с контрольными группами.

На фиг.23 представлен набор графиков, демонстрирующих результат лечения на моделях лечения кожных язв с использованием семейства HMGB. Все из HMGB1, HMGB2 и HMGB3 продемонстрировали значительные эффекты в отношении снижения площади язвы по сравнению с контрольными группами.

На фиг.24 представлена фотография, демонстрирующая оценку активности HMGB1 человека и экстракта кожи человека в отношении индукции миграции происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, проведенную с использованием камеры Бойена.

На фиг.25 представлен набор фотографий, демонстрирующий оценку активности веществ, привлекающих мезенхимальные клетки костного мозга, в экстрактах сердца, головного мозга и кожи мыши, проведенную с использованием камеры Бойдена после очистки веществ с помощью колонки с гепарином.

На фиг.26 представлен набор фотографий, демонстрирующих оценку активности экстракта HEK293 и экстракта HeLa в отношении индукции миграции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, проведенную с использованием камеры Бойдена. Обе культивированные клеточные линии продемонстрировали активность миграции в отношении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

На фиг.27A представлена фотография, на которой показана мышь, фиксированная к стереотаксическому устройству для головного мозга с разрезом головы по средней линии скальпелем, с последующей трепанацией с использованием бура. На фиг.27B представлена фотография, на которой показан головной мозг, к которому применяют отрицательное давление с использованием шприца для аспирирования части ткани головного мозга. На фиг.27C представлена фотография после инъекции 5 мкл очищенной на колонке с гепарином фракции экстракта кожи, растворенного в фибриновом адгезивном составе (фибриноген) в головной мозг, и последующей инъекции 5 мкл состава фибринового клея (тромбин). На фиг.27D и фиг.27E представлены фотографии модели повреждения головного мозга, полученные через 2 недели после лечения. Более высокое накопление положительных по GFP клеток наблюдали в группе лечения с использованием очищенной на колонке с гепарином фракции экстракта кожи, на E, по сравнению с контролем, на D. На фиг.27F и фиг.27G представлены фотографии модели повреждения головного мозга, полученные через 6 недель после лечения. Более высокое накопление GFP-положительных клеток наблюдали в группе лечения с использованием очищенной на колонке с гепарином фракции экстракта кожи, на G, по сравнению с контролем, на F.

На фиг.28 представлена диаграмма, демонстрирующая введение экстракта кожи (SE) мыши через хвостовую вену и взятие периферической крови.

На фиг.29 представлена диаграмма, демонстрирующая введение HMGB1 мыши через хвостовую вену и взятие периферической крови.

На фиг.30 представлен набор диаграмм, демонстрирующих фракционирование проточной цитометрией фракций мононуклеарных клеток периферической крови мыши, которые были получены через 12 часов после введения экстракта кожи (SE), а затем флуоресцентно мечены антителом против PDGFRα мыши и антителом против CD44 мыши. На верхних трех панелях показана группа введения PBS в качестве отрицательного контроля (n=3), и на нижних трех панелях показана группа введения экстракта кожи (SE) (n=3). Вертикальные и горизонтальные оси указывают на уровни экспрессии CD44 и PDGFRα, соответственно. Область, заключенная в рамку синего цвета соответствует популяции CD44-положительных, PDGFRα-положительных клеток, которая была увеличена в экстракте коже группы введения (SE) по сравнению с группой PBS.

На фиг.31 представлен набор диаграмм, демонстрирующих фракционирование проточной цитометрии фракций мононуклеарных клеток периферической крови мыши, которые были получены через 12 часов после введения HMGB1, а затем флуоресцентно мечены антителом против PDGFRα мыши и антителом против CD44 мыши. На верхней панели представлены мыши, которым вводили PBS, в качестве отрицательного контроля, и на правой панели представлены мыши, которым вводили HMGB1. Вертикальные и горизонтальные оси указывают на уровни экспрессии CD44 и PDGFRα, соответственно. Область, заключенная в рамку синего цвета соответствует популяции CD44-положительных, PDGFRα-положительных клеток, которая была увеличена у мышей, которым вводили HMGB1, по сравнению с мышами, которым вводили PBS.

На фиг.32A представлена диаграмма результата проточной цитометрии, которая демонстрирует присутствие клеток, имеющих CD44 и PDGFRα. Введение HMGB1 увеличивало обе популяции из PDGFRα- и CD44-двойных положительных клеток, и PDGFRα-положительных CD44-отрицательных клеток в периферической крови. На фиг.32B и 32C представлены результаты сравнения между группами введения PBS и HMGB1 на присутствие PDGFRα- и CD44-двойных положительных клеток, и PDGFRα-положительных CD44-отрицательных клеток в периферической крови, соответственно. Обе популяции клеток были статистически значимо увеличены в группе введения HMGB1.

На фиг.33 в наборе фотографий представлено накопление флуоресценции GFP в пересаженной коже, наблюдаемое после трансплантации кожи на спину мышей с трансплантированным костным мозгом с GFP. На левой фотографии (A) представлено окрашивание ядер с помощью DAPI. На средней фотографии (B) представлена зеленая флуоресценция положительных по GFP происходящих из костного мозга клеток, накопленных в области трансплантата кожи. На правой фотографии (C) представлено объединенное изображение фотографий (A) и (B). Происходящие из костного мозга клетки реконструируют ткани кожи.

На фиг.34 представлена фотография, на которой показан результат анализа измерения активности миграции происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток в экстрактах кожи с использованием камеры Бойдена. На этом изображении показаны окрашенные синим цветом мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, мигрировавшие из верхнего отделения камеры Бойдена через микропоры размером 8 мкм мембранного фильтра из поликарбоната в нижнее отделение, содержащее экстракты кожи, и прикрепившиеся к мембране со стороны нижнего отделения. В нижние отделения были помещены экстракты кожи, взятой от мышей в возрасте двух дней или шести недель.

На фиг.35 представлен набор фотографий детекции посредством вестерн-блоттинга белков S100A8 и S100A9 в экстрактах кожи.

На фиг.36 представлена фотография, на которой показано элюирование гепарин-связывающего белка кожных экстрактов, элюированного с аффинной колонки с гепарином посредством градиента концентрации NaCl. Белки в каждой фракции разделяли посредством SDS-PAGE и подвергали детекции окрашиванием серебром.

На фиг.37 представлена фотография, на которой показаны результаты анализа по измерению активности в отношении миграции происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток в экстракты кожи с использованием камеры Бойдена. На изображении показаны окрашенные синим цветом мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, которые мигрировали из верхнего отделения камеры Бойдена через микропоры фильтра к каждой гепарин-связывающей фракции в экстрактах (в нижнее отделение) и прикрепляли