Вакцинный антиген бабезиоза собак

Вакцинный антиген бабезиоза собак

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области ветеринарной паразитологии, в частности, к бабезиозу собак. В частности, изобретение относится к полипептиду, являющемуся новым антигеном Babesia собак (CBA), или его фрагментам и к композициям, содержащим этот антиген, к нуклеиновым кислотам, кодирующим антиген, антителам к антигену и медицинским применениям этого антигена, фрагментов, антител или кодирующих нуклеиновых кислот. В частности, изобретение относится к использованию таких компонентов в вакцинах против Babesia собак.

Простейшие микроорганизмы рода Babesia являются передаваемыми клещами внутриэрицитарными паразитами отряда Piroplasmida в типе Apicomplexa. Виды Babesia разделяют на подклассы на основании нескольких критериев, в числе других по клещу-переносчику (клещам-переносчикам), содержащемуся в окружающей среде, который может переносить конкретные виды паразита Babesia. Клещ-переносчик, в свою очередь, определяет географическое распространение паразита и позвоночного хозяина, который является инфицированным.

Инфекция позвоночного хозяина паразитами Babesia вызывает заболевание бабезиоз, также называемое пироплазмозом, с широкой вариацией симптомов и тяжести, заболевание и его симптомы первые были описаны в 1904 году (Nuttall, J. Hyg. (Lond.) vol. 4, p. 219-257).

Для предотвращения бабезиоза используют несколько подходов, таких как, например, борьба с клещами. Этого достигают в основном обработкой хозяина, на котором питаются клещи, лекарственными средствами. Такие обработки включают растворы, наносимые орошением составы или парентеральные лекарственные средства, которые отпугивают или уничтожают клещей. Недостатками таких способов являются себестоимость таких обработок, которые, возможно, необходимо часто повторять, возможная токсичность лекарственного средства, возможные остатки лекарственного средства, содержащиеся в мясе или молоке мясомолочного скота, и появление устойчивости к лекарственному средству в популяции клещей. Аналогичные недостатки применимы к лечению на основе лекарственных средств животных, которые уже стали инфицированными Babesia.

Таким образом, альтернативой является профилактика или облегчение состояния бабезиоза посредством вакцинации животного-мишени, которое в этом случае является хозяином, на котором могут питаться клещи, и которое в результате может становиться инфицированным Babesia. В большинстве случаев такие вакцины содержат иммунологически эффективное количество антигенной молекулы из клеща или паразита Babesia в фармацевтически приемлемом носителе. Однако вследствие того, что паразит, такой как Babesia, представляет собой очень сложный организм, доказано, что крайне трудно определять отдельные антигены для вакцинации животного-мишени, которые обеспечивают возникновение иммунного ответа, который является быстрым, безопасным и эффективным. Фактически указанное представляет собой одну из наиболее сложных задач иммунопаразитологии в целом в настоящее время.

Паразиты Babesia могут инфицировать широкую группу позвоночных животных, но инфекции домашних млекопитающих и людей являются наиболее актуальными для ветеринарной практики и медицины. Хотя некоторые виды Babesia могут инфицировать животных, относящихся к собакам, наиболее преобладающие Babesia собак представляют собой для Европы: B. canis, и для региона к югу от Сахары и Южной Африки: B. rossi.

Раньше Babesia собак таксономически классифицировали как подвид B. canis, таким образом, как: B. canis canis и B. canis rossi и т.д., следуя предложению триноминальной системы номенклатуры (Uilenberg et al., 1989, Vet. Quart., vol. 1, p. 33-40). Однако в последние годы было описано все больше и больше видов Babesia у собак, и информацию получали на основании их жизненного цикла, их членистоногих переносчиком и характеристики их генетического материала. Это привело к понятию, что эти подвиды Babesia canis следует классифицировать, каждый, как соответствующий отдельный вид. Это описано у Schetters, 2005 (Trends in Parasitology, vol. 21, p. 179-184). Эту новую классификацию используют на всем протяжении настоящего описания.

B. canis и B. rossi представляют собой так называемые "крупные" виды Babesia собак, т.е. крупнее, чем радиус эритроцита. B. canis переносят клещи-переносчики рода Dermacentor, и B. rossi клещи рода Haemaphysalis. Паразиты B. rossi являются наиболее патогенными видами Babesia собак, паразиты B. canis являются несколько менее патогенными. Основные симптомы заболевания представляют собой анемию или иммунопатологию, похожую на малярию. Другие симптомы представляют собой почечную недостаточность, отек легких и общую реакцию шока. Животные, которые выздоравливают, могут страдать рецидивами в дальнейшем. Обзором, например, является работа Jacobson & Clark (1994, J. of S. Afr. Vet. Assoc., vol. 65, p. 134-145).

Главным образом вакцины предназначены для профилактики или снижения (уровня) инфекции микроорганизмом или заболевания, вызываемого инфекцией. Вакцины против бабезиоза собак были описаны ранее. Например, Ristic et al. (1988, в Babesiosis of domestic animals and man, ed. M. Ristic, p.163-189, CRC Press Inc., Boca Raton, FL, ISBN: 0849349087) и Schetters et al. (1992, Par. Immunol., vol. 14, p. 295-305).

В этих вакцинах использовали растворимые антигены паразита (SPA), которые представляют собой экзоантигены паразита, которые выделяет паразит, или которые происходят из разрушаемых или погибающих паразитов. При получении in vivo, например, таком как описано Sibinovic et al. (1967, The J. of Parasitology, vol. 53, p. 919-923), эти антигены накапливаются в плазме инфицированных собак-хозяев, альтернативно, при получении in vitro они накапливаются в супернатанте культуры эритроцитов, в которой амплифицируют Babesia (Schetters et al., 1992, Parasite Immunology, vol. 14, p. 295-305). SPA из культуры B. canis использовали для защиты собак от инфекции, вызываемой тем же (т.е. гомологичным = из источника, изолята или штамма, который является таким же, как тот, что использовали в культурах для получения антигена SPA, содержащегося в вакцине) штаммом B. canis. Стоит отметить, что гомологичная вакцинация не являлась эффективной в отношении B. rossi: SPA из культуры паразитов B. rossi не обеспечивали защиту собак от вызываемых B. rossi инфекции и заболевания. Для этого была необходима смесь SPA из культур SPA B. canis и B. rossi, как описано в EP 691131, в таком случае собаки могли быть эффективно иммунизованы SPA, выделяемыми из культур B. rossi и B. canis, с добавлением сапонина в качестве адъюванта, и развивали защитный иммунный ответ против паразитов B. canis и B. rossi и эритроцитов, инфицированных паразитами.

MSD Animal Health оптимизировала получение SPA в культуре in vitro в промышленном масштабе в запатентованном способе получения вакцины на их основе: Nobivac® Piro (Schetters et al., 1995, Parasitol. Today, vol. 11, p. 456-462). Однако культивирование in vitro или in vivo живых паразитов в промышленном применении имеет характерные недостатки, такие как необходимость всестороннего контроля для обеспечения качества и воспроизводимости продукта при значительной стоимости. Также может быть желательным уменьшение использования исходных веществ биологической природы, таких как кровь и сыворотка здоровых собак.

Дополнительный недостаток известных вакцин против Babesia на основе неочищенных SPA заключается в том, что они содержат остатки лизированных нормальных эритроцитов, которые сами могут вызывать аутоиммунный ответ против эритроцитов вакцинированного животного. В связи с этим существует острая необходимость в вакцине против бабезиоза собак, которая устраняет по меньшей мере некоторые из перечисленных выше недостатков.

Целью настоящего изобретения является получение антигенного компонента, который можно использовать для получения эффективной, безопасной и надежной вакцины для защиты от инфекции и/или заболевания, вызываемых паразитами Babesia собак, где компонент вакцины устранит недостатки классических вакцин на основе SPA и защитит не только от гомологичной, а также от гетерологичной инфекции паразитами Babesia.

Неожиданно обнаружено, что можно устранять недостатки известного уровня техники и можно достигать целей посредством конкретного выделенного полипептида, который можно использовать для получения вакцины для собак, которая является эффективной против инфекции паразитами Babesia и заболевания, которое она вызывает. Использование конкретного полипептида устраняет необходимость использовать неочищенную смесь растворимых (экзо-) антигенов паразита как в известных вакцинах против бабезиоза собак.

Очищенный и выделенный полипептид условно назван "антиген Babesia собак" (CBA), и обнаружено, что он принадлежит классу белковых антигенов CBA с представителями среди различных видов паразитов Babesia собак.

Различные полипептиды CBA имеют в целом рассчитанную молекулярную массу приблизительно 30 кДа (например, приблизительно от 29 до 33 кДа), относительно кислый pH (например, приблизительно 4,6-4,8) и содержат N-концевую сигнальную последовательность (например, приблизительно 16-18 аминокислот), которая соответствует тому факту, что полипептиды CAB активно секретируются Babesia после инфицирования эритроцита.

Обнаружено, что Babesia canis экспрессировала один антиген CBA, называемый в настоящем описании как CBA-1, тогда как B. rossi экспрессировала два гомолога CBA, обозначаемые в настоящем описании как CBA-2,1 и -2,2.

Члены этого нового класса антигенов Babesia являются частью консервативных областей аминокислотной последовательности, каждая из которых характеризует полипептиды CBA и отличает их от известных полипептидов.

Эти консервативные области последовательности предоставлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 1-5 (см. таблицу 1), и неожиданно выявлено, что они располагаются на N- и C-концах полипептида CBA, где N-концевая характеризующая область находится непосредственно после сигнальной последовательности. Центральная область полипептидов CBA является менее консервативной.

Первая их двух характеризующих областей полипептидов CBA представляет собой N-конец полипептида CBA из B. rossi, фактически последовательность является одной и той же для CBA-2,1 и CBA-2,2: MLLSNVSFPQPVSSVKLLEEY (SEQ ID NO:1).

При сравнении с известными полипептидами выявлено, что наибольшие совпадения с аминокислотами SEQ ID NO:1 имеют аминокислотную идентичность только 11 из 21 аминокислоты, которая представляет собой идентичность 52,3%.

Аналогично, вторую консервативную область последовательности: VLMVLTKCNLKMHVTEEQL (SEQ ID NO:3), представленную C-концом CBA-2,1, также сравнивали с известными полипептидами. Выявлено, что наибольшее совпадение имеют только 11 из 19 аминокислот, что представляет собой аминокислотную идентичность 57,9%.

В противоположность этому, идентичность аминокислотных последовательностей между соответствующими областями B. canis и B. rossi самих полипептидов CBA является значительно выше, более 68%, как представлено в таблице 2.

Таблица 1Список идентификаторов последовательностей, используемых в настоящем описании
SEQ ID NO:	Описание
1	Характеризующая область 1 вблизи N-конца CBA-2,1 и CBA-2,2 B. rossi
2	Характеризующая область 1 вблизи N-конца CBA-1 B. canis
3	Характеризующая область 2 вблизи C-конца CBA-2,1 B. rossi
4	Характеризующая область 2 вблизи C-конца CBA-2,2 B. rossi
5	Характеризующая область 2 вблизи C-конца CBA-1 B. canis
6	Аминокислотная последовательность CBA-1 B. canis
7	Аминокислотная последовательность CBA-2,1 B. rossi
8	Аминокислотная последовательность CBA-2,2 B. rossi
9	Последовательность мРНК CBA-1 B. canis (как кДНК)
10	Последовательность мРНК CBA-2,1 B. rossi (как кДНК)
11	Последовательность мРНК CBA-2,2 B. rossi (как кДНК)
12	Геномная последовательность CBA-1 B. canis
13	Геномная последовательность CBA-2,1 B. rossi

14	Геномная последовательность CBA-2,2 B. rossi
15	Коровая а/к последовательность характеризующей области 1

Таблица 2Идентичность аминокислотных последовательностей между аминокислотными последовательностями характеризующих областей белков CBA различных видов Babesia собак
Аминокислотная последовательность	Характеризующая область 1: MLLSNVSFPQPVSSVKLLEEY	Характеризующая область 2: VLMVLTKCNLKMHVTEEQL
CBA-1 B. canis	16/21 (76,2%)	14/19 (73,7%)
CBA-2,1 B. rossi	21/21 (100%)	19/19 (100%)
CBA-2,2 B. rossi	21/21 (100%)	13/19 (68,4%)

Аналогично, характеризующая область 2 (SEQ ID NO:3) обнаружена у видов Babesia собак с идентичностью по меньшей мере 68%, тогда как лучший гомолог в общедоступных базах данных являлся идентичным не более 57%. Кроме того, при исследование в BLAST молекулы, содержащей обе области, не получено каких-либо совпадений.

Полипептиды, определяемые в настоящем описании, таким образом, характеризуются наличием области высокой гомологии или идентичности с аминокислотной последовательностью одной или обеих SEQ ID NO 1 и 2.

Таким образом, изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотных последовательностей более 53% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, и/или обладающей идентичностью аминокислотных последовательностей более 58% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, где указанный полипептид способен индуцировать иммунный ответ против паразитов Babesia собак и/или их продуктов или эффектов.

По изобретению "полипептид" относится к молекулярной цепи аминокислот. Полипептид не является конкретной длины, структуры или формы, при необходимости его можно модифицировать in vivo или in vitro, например, гликозилированием, амидированием, карбоксилированием, фосфорилированием, пегилированием или изменениями пространственной укладки. В числе прочего белки, пептиды, олигопептиды входят в определение полипептида. Полипептид может быть биологического и/или синтетического происхождения.

Термин "выделенный" следует интерпретировать как выделенный из его естественной среды. Это также применимо к очистке полипептида CBA (или его кодирующей нуклеиновой кислоте) в композициях до количеств, которые являются больше количества других веществ в такой композиции, предпочтительно в намного большем количестве, таком что полипептид или нуклеиновая кислота составляет 70%, или 80%, или 90% или более от общей композиции. Предпочтительно полипептид или нуклеиновая кислота составляет 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или даже 99% от общей композиции.

Термин "идентичность аминокислотных последовательностей" следует интерпретировать как процент идентичных аминокислот в соответствующих положениях, когда два аминокислотные последовательности являются оптимально выровненными по всей их длине. Выравнивание можно проводить подходящим образом с использованием компьютерной программы, например, Blast® или ClustalW® с использованием параметров по-умолчанию.

Термин "способный индуцировать иммунный ответ" относится к способности полипептидов CBA по изобретению индуцировать иммунный ответ, который является эффективным против инфекции или заболевания, вызываемых паразитами Babesia собак. Такой эффективный иммунный ответ, например, представляет собой профилактику, предотвращение или улучшение состояния бабезиоза и/или паразитемии паразитов Babesia у собак.

Такой иммунный ответ может принимать различные формы и может действовать через различные ветви иммунной системы врожденного и/или приобретенного иммунитета, и может быть клеточного и/или гуморального типа. Существование или индукцию такого иммунного ответа можно детектировать хорошо известными способами и дополнительно способом, как описано в настоящем описании. Например, антитела к CBA можно детектировать, например, Elisa, посредством иммунофлуоресценции, иммуноблотингом и т.д. Клеточный иммунный ответ можно детектировать анализом активации лимфоцитов или посредством кожных реакций in vivo. Дополнительные способы включают наблюдение за симптомами иммунизированных пациентов или их физиологическими ответами, как правило, ассоциированными с инфекцией Babesia и заболеванием, такими как объем осажденных эритроцитов (также гематокритное число), количество инфицированных эритроцитов, размер селезенки и т.д., в дополнение к общим поведенческим шкалам.

В конечном итоге, полипептиды по изобретению (при применение в вакцине) способны предотвращать или снижать инфекцию и/или заболевание, вызываемое этой инфекцией, обусловленной инфекцией паразитами Babesia собак.

"Babesia собак" представляет собой паразита Babesia, который может инфицировать животное, являющееся собакой. Как правило, такие паразиты представляют собой Babesia canis, B. rossi, B. vogeli и B. gibsoni, а также описаны другие виды Babesia или ассоциированные с инфекциями собак (Uilenberg, 2006, Veterinary Parasitology, vol. 138, p. 3-10). В отношении точной таксономической классификации Babesia специалисту понятно, что она может изменяться со временем, т.к. новые представления приводят к реклассификации в новые или другие таксономические группы. Однако вследствие того, что характеристики и/или набор белков участвующего организма не изменяются, только их классификация, предполагают, что такие повторно классифицированные организмы входят в объем изобретения. "Собачьи" относятся ко всем (под)видам Canidae, в основном собакам, волкам и лисам, а также любым смешанным породам.

Кроме того, иммунологическая эффективность полипептида по изобретению против бабезиоза действует на различные виды Babesia различным образом, вакцинация может предотвращать паразитемию, а также заболевание от одного вида, но только противодействовать заболеванию от другого вида (см. например, Schetters et al., 1997, Parasitology, vol. 115, p. 485-493).

Авторы изобретения обнаружили, что не существует прямого способа выделения и характеристики полипептидов CBA по изобретению из неочищенных антигенных препаратов. В основном это обусловлено тем, что общепринятые способы являются не эффективными или не предоставляют необходимых данных. В результате существовала необходимость в применении нескольких адаптаций и не очевидных комбинаций известных способов для получения желаемых полипептидов. Например:

В качестве эффективной вакцины известной являлась только смесь экзоантигенов SPA: в обеих коммерческих вакцинах против Babesia, доступных на дату подачи настоящего изобретения, применяют неочищенную смесь экзоантигенов Babesia в качестве компонента вакцины. Также за многие десятилетия исследования бабезиоза собак еще не получено эффективной коммерческой вакцины на основе отдельных соединений. Таким образом, общепринято, что защита от бабезиоза, обеспечиваемая иммунизацией SPA собак, являлась обусловленной гетерогенным иммунным ответом, в который вовлечены многие антигены, и который нельзя приписывать отдельному белку. Этот факт разубедит любого специалиста в данной области приступать к исследованию отдельного вакцинного антигена.

Кроме того, отсутствие высокопродуктивных способов культивирования B. canis и B. rossi препятствует специалисту получать достаточные количества любого отдельного антигена Babesia для характеризации. Таким образом, хотя описаны общепринятые способы культивирования, существует необходимость в высокопродуктивном способе культивирования in vitro, который является собственностью заявителя, которым возможно получать достаточные количества белков Babesia для определения CBA в виде отдельных компонентов.

Также полипептид CBA по изобретению невозможно выделять непосредственно из SPA, т.к. SPA представляет собой неочищенную смесь многих различных компонентов из эритроцитов, из Babesia и из компонентов сыворотки животного, которая является необходимой для культивирования, до уровней 40% об./об.

Когда предпринимали попытку выделять CBA из окрашенных кумасси бриллиантовым голубым гелей полного SPA, это приводило к многочисленным неудачам, в основном вследствие того, что все фракции являлись сильно загрязненными белками сыворотки и гемоглобином из эритроцитов в культуре, а также большое количество полос от низкой до высокой молекулярной массы полностью препятствовало доступности любой одной полосы отдельного белка. Эксперименты, целью которых являлась очистка одностадийными способами, такими как аффинная хроматография с белком A, ионообменная хроматография и эксклюзионные колонки, являлись безуспешными. В дальнейшем удалось выделить CBA из SPA с использованием протокола сложной очистки, в котором применяют адаптированные способы культивирования и конкретную особенную комбинацию ряда последовательных способов разделения и осаждения.

В конечном итоге, этими способами получили достаточные количества полипептида CBA для дальнейшего анализа.

Однако не удалось визуализировать какой-либо выделенный полипептид CBA общепринятыми способами иммуноблотинга: авторы изобретения неожиданно обнаружили, что CBA является нераспознаваемым на иммуноблоте общего лизата паразита или из SPA ни стандартной антисывороткой от собак, иммунизированных SPA, ни антисывороткой от собак, которые являлись инфицированными Babesia. Это обусловлено тем, что количество CBA в SPA является слишком маленьким, или форма CBA в SPA является неподходящей для распознавания иммуноблотингом. Следует отметить, что CBA удалось определить только на иммуноблоте, когда авторы изобретения использовали сыворотку от собак, которых сначала многократно вакцинировали SPA, и затем экспериментально заражали Babesia, так называемая сыворотка после вакцинации и заражения.

Дополнительное ограничение заключалось в том, что необходимо получать такую сыворотку после вакцинации и заражения в очень конкретный период после заражения: между 6 сутками и 11 сутками. Для сыворотка, получаемой до или после этого периода, не удалось продемонстрировать слабую реактивность к полипептиду CBA с относительной молекулярной массой приблизительно 41 кДа.

В дальнейшем анализе, тот факт, что только N- и C-концы различных полипептидов CBA являлись консервативными, и, таким образом, совокупность (зрелых) полипептидов обладала небольшой консервативностью последовательности, вызывал значительное затруднение в определении соответствующего гена и последовательностей мРНК, кодирующих эти полипептиды в геноме Babesia. Кроме того, известны негеномные последовательности B. canis или B. rossi, так что эти геномы было необходимо секвенировать, анализировать возможные открытые рамки считывания и получать области вставок ПЦР. Для этого последнего этапа необходимо широкое применение вырожденных праймеров вследствие выявленных различий последовательностей в генах CBA.

В одном из вариантов осуществления идентичность аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1 и/или 2 составляет по меньшей мере 58%, предпочтительно по меньшей мере 59%, такую как 60% или 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 71%, 73%, 75% или 76%. В одном из вариантов осуществления полипептиды по изобретению отличаются тем, что они содержат аминокислотную последовательность, которая обладает идентичностью аминокислотных последовательностей более 58% с одной или более аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5.

По изобретению переходные фразы "содержащий" и "состоящий из" определяют область формулы изобретения в отношении того, что не перечисленные дополнительные компоненты или стадии, если таковые существуют, исключены из объема формулы изобретения.

Переходный термин "содержащий", который является синонимичным с "включающий" "состоящий" или "характеризующийся" является охватывающим или неограничивающим и не исключает дополнительных не перечисленных элементов или этапов способа.

Фраза "группа, состоящая из" является ограничивающим термином, который используют при составлении пункта формулы изобретения для обозначения "группы Маркуша", которая по своей природе является закрытой, и ее используют для различия или определения различных членов группы.

Переходная фраза "состоящий из" исключает любой элемент, этап или ингредиент, не описанный в пункте формулы изобретения.

Авторам изобретения в конечном итоге удалось получить полную аминокислотную последовательности ряда полипептидов CBA. Они предоставлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 6, 7 и 8.

При сравнении друг с другом для этих полноразмерных полипептидных последовательностей продемонстрирована замечательная консервативность их N- и C-концов с меньшей консервативностью в их основной центральной части, см. фиг.1. В кратком изложении, идентичность аминокислотных последовательностей между этими полными последовательностями является такой, как представлено в таблице 3.

При сравнении с известными полипептидами не удалось обнаружить значительных полноразмерных совпадений.

Таблица 3Идентичность аминокислотных последовательностей между полноразмерными аминокислотными последовательностями полипептидов CBA, описываемых в настоящем описании
% идентичности а/к последовательности	CBA-1 B. canis (SEQ ID NO:6)	CBA-2,1 B. rossi (SEQ ID NO:7)
CBA-2,1 B. rossi (SEQ ID NO:7)	29	×
CBA-2,2 B. rossi (SEQ ID NO:8)	35	43

Таким образом, в одном из вариантов осуществления полипептиды CBA по изобретению отличаются тем, что они обладают идентичностью аминокислотных последовательностей более 29% по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8.

Процент идентичности для этого варианта осуществления следует рассчитывать для полной длины полипептида CBA как в SEQ ID NO:6, 7 или 8. Термин "более 29%" можно интерпретировать как по меньшей мере 30%, 32%, 35%, 39%, 43%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или даже более 98%.

Выявлено, что характеризующая область № 1 сама по себе содержит коровую последовательность, которая является полностью консервативной для полипептидов CBA из B. canis и B. rossi. Эта последовательность: PVSSVKLL (SEQ ID NO:15) обнаружена в любом известном полипептиде с идентичностью аминокислотных последовательностей 8/8 (100%), таким образом, она может служить для дополнительной характеристики полипептида CBA по изобретению.

Таким образом, в дополнительном предпочтительном варианте осуществления полипептид по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой PVSSVKLL (SEQ ID NO:15).

Предпочтительно последовательность SEQ ID NO:15 содержится в полипептид по изобретению в N-концевой области зрелого полипептида.

В одном из вариантов осуществления изобретение также относится к иммуногенному фрагменту полипептида по изобретению.

Такой иммуногенный фрагмент можно получать хорошо известным способом с использованием информации, предоставленной в настоящем описании. Например, получением триптического гидролизата полипептидов CBA и тестированием иммуногенности получаемых фрагментов. Или фрагменты можно синтезировать и тестировать, как в хорошо известном способе PEPSCAN (WO 84/003564, WO 86/006487 и Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, p. 3998-4002). Альтернативно, иммуногенные соответствующие области можно теоретически рассчитывать с использованием хорошо известных компьютерных программ. Иллюстративный пример эффективности применения этих способов опубликован Margalit et al. (1987, J. of Immunol., vol. 138, p. 2213-2229), которые описали показатель эффективности 75% при теоретическом расчете T-клеточных эпитопов.

Как хорошо известно, для того чтобы являться иммуногенными, полипептиды должны иметь минимальную длину, как правило 8-11 а/к для связывания с рецептором MHC I, и 11-15 н/к для связывания с рецептором MHC II (описано, например, Germain & Margulies, 1993, Annu. Rev. Immunol., vol. 11, p. 403-450). Таким образом, по изобретению иммуногенный фрагмент полипептида по изобретению составляет по меньшей мере 8 аминокислот в длину.

Полипептидные фрагменты, которых еще не вызывают эффективный иммунный ответ, можно презентировать иммунной системе-мишени прикрепленными к или в виде молекулы носителя. Хорошо известные носители представляют собой бактериальные анатоксины, такие как столбнячный токсин или дифтеритный анатоксин, альтернативно, можно использовать KLH, BSA, или компоненты бактериальной клетки (выделяемые из) липида A и т.д. Также пригодными могут являться полимеры или другие частицы или повторяющиеся структуры, такие как вирусоподобные частицы и т.д. Связывание с молекулой носителя можно проводить известными в данной области способами с использованием химических или физических технологий.

Полипептиды CBA по изобретению или их иммуногенный фрагмент могут быть биологического или синтетического происхождения, и их можно получать выделением, очисткой, сборкой и т.д. Полипептиды можно выделять из in vivo или in vitro культур паразитов Babesia собак. Однако полипептиды получают более подходящим образом, способом рекомбинантной экспрессии посредством экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептиды или фрагмент.

Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, которая способна кодировать полипептид или его иммуногенный фрагмент по изобретению.

Понятие нуклеотидной последовательности, которая "способна кодировать" полипептид, хорошо известно в данной области и относится к центральной догме молекулярной биологии в отношении экспрессии генов и продукции белка: ДНК транскрибируется в РНК, и РНК транслируется в белок. Как правило, такая нуклеотидная последовательность, способная кодировать полипептид, называется открытой рамкой считывания (ORF), указывающей на то, что не содержится нежелательных стоп-кодонов, которые преждевременно завершат трансляцию белка рибосомой. Указанная нуклеотидная последовательность может представлять собой ген (т.е. ORF, кодирующую полный белок) или может представлять собой фрагмент гена. Она может быть природного или синтетического происхождения.

Изобретение предпочтительно относится к последовательности мРНК и геномной последовательности для ряда полипептидов CBA. Как указано, обнаружено, что геном B. rossi содержит два отдельных гена, кодирующих два различных варианта полипептида CBA, геном B. canis содержит только один ген CBA. Последовательности мРНК CBA (в виде кДНК) предоставлены в SEQ ID NO:9-11, и геномные последовательности CBA в SEQ ID NO:12-14 (см. таблицу 1).

Когда определяли и анализировали последовательности мРНК, выявили, что все соответствующие CBA гены содержат нетранслируемые области приблизительно 15-19% от полного гена. Хотя длины различных генов CBA отличаются, расположение и деление этих интронов являлось в высшей степени сходным, где все гены CBA содержат два интрона, расположенных приблизительно между номерами нуклеотидов от 170 и 200 и от 400 до 550 (см. таблицу 4 и фиг.2). Такая консервативная организация гена является дополнительной демонстрацией родства членов класса полипептидов CBA, определяемых в настоящем описании.

Таблица 4Расположение интронов в генах CBA
Ген CBA	Расположение интронов (номера нуклеотидов)	% от гена интрона
CBA-1 B. canis (SEQ ID NO:12)	170-203	408-550	15
CBA-2,1 B. rossi (SEQ ID NO:13)	173-207	406-569	19
CBA-2,2 B. rossi (SEQ ID NO:14)	170-204	406-552	18

Гены CBA или предпочтительно соответствующие последовательности кДНК можно подходящим образом применять для различных целей, например, для экспрессии и получения полипептидов CBA по изобретению. Однако, как хорошо известно в данной области, различные нуклеиновые кислоты могут кодировать один и тот же белок. Это приводит к тому, что известно в молекулярной биологии как "качание" или "вырожденность генетического кода", где несколько кодонов или триплетов мРНК обуславливают присоединение одной и той же аминокислоты к цепи аминокислот, растущей на рибосоме при трансляции. Это наиболее распространено во втором и особенно в третьем основании каждого триплета, кодирующего аминокислоту. Это явление может приводить к гетерологичности приблизительно 30% двух различных нуклеиновых кислот, которые все еще кодируют один и тот же белок. Таким образом, две нуклеиновые кислоты, обладающие идентичностью нуклеотидной последовательности только приблизительно 70%, все еще могут кодировать один и тот же белок.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность по изобретению обладает идентичностью нуклеотидной последовательности более 70% по меньшей мере с одной нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14.

Как также хорошо известно, альтернативный путь характеристики нуклеотидной последовательности посредством уровня идентичности ее нуклеотидной последовательности является путем не посредством компьютерного анализа, а физическим измерением, подходящим образом такое измерение можно проводить анализом, тестирующим гибридизацию в условиях повышенной жесткости.

Таким образом, в альтернативном варианте осуществления нуклеотидная последовательность по изобретению может гибридизоваться в жестких условиях по меньшей мере до одной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14.

Термин "гибридизоваться" относится к процессу связывания (также называемого отжигом, или последовательность-специфическим спариванием оснований) между двумя цепями нуклеиновых кислот. В процессе гибридизации комплементарные области нуклеиновой кислоты-мишени и пробы находят друг друга, отжигаются и становятся связанными. Нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК или РНК при условии, что они являются одноцепочечными и развернутыми. В соответствующих условиях мишень и проба связываются посредством образования водородных мостиков между нуклеотидами A и T и между G и C.

Как правило, нуклеиновая кислота-мишень представляет собой более крупную молекулу ДНК (плазмиду, хромосому или геном) или (м)РНК, и проба, как правило, представляет собой ДНК (т.к. она является более стабильной, чем РНК), одноцепочечную и меньшего размера, чем мишень, например, от 50 до 5000 оснований.

"Жесткость" на практике определяют в основном как функцию концентрации солей и температуры, используемых для гибридизации, и стадий промывания в протоколе испытаний гибридизации. Ограничение жестких условий следует из формулы температуры плавления Tm Meinkoth & Wahl (1984, Anal. Biochem., vol. 138, p. 267-284):

Tm=[81,5°C+16,6(log M)+0,41(% GC)-0,61(% формамид)-500/л]-1°C/1% несоответствия

В этой формуле M представляет собой молярность одновалентных катионов, % GC представляет собой процент нуклеотидов гуанозина и цитозина в ДНК, L представляет собой длину гибрида в парах оснований, и "несоответствие" представляет собой отсутствие идентичного совпадения.

Как хорошо известно, высокая концентрация соли и низкая температура представляют собой условия "низкой" жесткости, и низкая концентрация соли и высокая температура представляют собой высокую жесткость. Выбирая конкретную гибридизации и условия промывания, можно устанавливать определенный уровень жесткости, и таким образом определять минимальный уровень термостабильности, существование которой необходимо для дуплекса ДНК-ДНК (или РНК-ДНК), который образуется и сохраняется.

Стандартный буфер, используемый для установления жесткости, представляет собой буфер SSC (цитрат натрия в физиологическом растворе), где стандартный "20×" буфер SSC содержит 3 моль NaCl и 0,3 M цитрата в воде при pH 7. Таким образом, очень низкая жесткость представляет собой промывание в 20× SSC при комнатной температуре (3 M соли и 20°C), и более высокая жесткость представляет собой кипячение в дистиллированной воде (без соли и 100°C).

Это также подробно описано в руководствах, таких как Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986), pp. 75 78, и 84-87, Molecular Cloning, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982), pp. 387-389, и 2001.

По изобретению "жесткие условия" представляют собой такие условия, при которых нуклеотидная последовательность еще может гибридизоваться, если ее несоответствие нуклеотидной последовательности по изобретению составляет 30% или менее (т.е., если существует идентичность нуклеотидной последовательности более 70%). Более предпочтительно условия, при которых нуклеотидная последовательность, обладающая приблизительно 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью нуклеотидной последовательности, может оставаться гибридизованной с нуклеотидной последовательностью по изобретению.

Предпочтительно неограничивающий