Способ получения биологически активного вещества из черноморской мидии mytilus galloprovincialis lam.

Способ получения биологически активного вещества из черноморской мидии mytilus galloprovincialis lam.

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологий и предназначено для получения биологически активного вещества, обогащенного тестостероном, из гонад и половых продуктов черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam., которое может быть использовано в фармакологии при создании средств для поддержания общего физиологического статуса и репродуктивной активности человека.

С возрастом, обычно после 30-35 лет, в крови человека происходит заметное снижение содержания некоторых гормонов, в частности тестостерона. Наиболее интересными источниками гормоносодержащего сырья являются ткани и биологические жидкости животных, далеко отстоящих от человека по эволюционной лестнице, основное преимущество которых состоит в отсутствии вероятности передачи человеку перекрестных (например, вирусных) болезней. В экспериментах, выполненных на крысах-самцах, установлено, что нативные и лиофильно высушенные гонады морских ежей оказывают стимулирующее действие на половое поведение. Доказано связь между половой активностью с влиянием компонентов гонад на андрорецепторы репродуктивной системы животных [5]. Компоненты нативных и лиофилизированных гонад морских гидробионтов являются перспективными источниками для получения биологически активных добавок к пище или лекарственных препаратов - стимуляторов либидо.

Известен способ переработки икры морских ежей с получением БАД "Биологически активная добавка к пище" (см. патент RU №2165719, МКИ A23L 1/30, 1/39, опубл. 27.04.2001). Способ включает отдельное приготовление водно-спиртовых настоек из сырья растительного и животного происхождения, в состав одной из которых входит и икра морских ежей, при последующем их смешивании. Биологически активная добавка к пище обладает направленным действием на сердечно-сосудистую и нервную системы организма, а также укрепляет капилляры и стенки артерий, нормализует давление и вес. Недостатком является то, что из-за большого числа компонентов композиции биологическая активность икры морских ежей не проявляется в полной мере, а отсутствие целенаправленной экстракции определенного компонента из икры морских ежей усложняет процедуру экстракции.

Известен Способ безотходной переработки икры морских ежей (см. Патент РФ №2283006), относящийся к области получения БАД из икры морских гидробионтов. Способ включает заготовку сырья, последовательную обработку его двумя экстрагентами и фильтрование. При этом сначала икру обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом, настаивают в течение 6-10 суток при комнатной температуре. Полученный экстракт декантируют, а икру вновь обрабатывают 10%-ным водным раствором этилового спирта и настаивают в течение 2-4 суток при температуре 4-10°С. Полученный экстракт декантируют, оба экстракта объединяют и отстаивают, а твердый остаток икры сушат и измельчают. Недостатком является использование только икры морских гидробионтов, в то время как в половых продуктах морских гидробионтов концентрация отдельных биологически активных веществ превышает их концентрацию в органах.

В основу изобретения «Способ получения биологически активного вещества из черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam.» поставлена задача получения продукта с высоким содержанием тестостерона из гонад и/или половых продуктов черноморской мидии.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве исходного сырья используют не только гонады черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam., но и ее половые продукты (яйцеклетки и сперматозоиды).

Способ включает заготовку сырья, последовательную обработку его экстрагентом, настаивание и фильтрование. При этом предварительно собранные половые продукты и/или гонады сначала обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом, настаивают в течение суток при комнатной температуре. Полученный экстракт декантируется, а гонады и/или половые продукты вновь обрабатываются 95%-ным этиловым спиртом и настаиваются в течение суток при комнатной температуре. Полученный экстракт декантируется, оба экстракта объединяются, настаиваются в течение суток при комнатной температуре и отфильтровываются. Изобретение позволяет произвести экстракцию биологически активных компонентов, в частности тестостерона, из гонад и/или половых продуктов гидробионтов.

Общим для прототипа и заявляемого способа является последовательная обработка сырья двумя экстрагентами и объединение экстрактов. Модификация и подбор условий экстрагирования были выполнены авторами в лабораторных экспериментах. Применение гонад и/или половых продуктов черноморской мидии в качестве исходного сырья для получения средства, поддерживающего общий физиологический статус и репродуктивную активность человека, ранее не было известно.

Целесообразность использования гонад и/или половых продуктов черноморской мидии в качестве исходного сырья для получения средства, поддерживающего общий физиологический статус и репродуктивную активность человека, подтвердили результаты иммуноферментного анализа, проведенного авторами. В таблице 1 приведены концентрации общего тестостерона в гонадах и половых продуктах черноморской мидии в пересчете на 1 г сухого веса гонад и половых продуктов.

Таблица 1. Концентрация общего тестостерона в гонадах и половых продуктах черноморской мидии в пересчете на 1 г лиофилизированных гонад/половых продуктов.

Зная содержание общего тестостерона в 1 г лиофилизированных гонад и/или половых продуктов в исходном сырье, можно приблизительно рассчитать концентрацию общего тестостерона в готовом продукте, но содержание гормонов в организме животных не является величиной постоянной и зависит от очень многих обстоятельств. Так как тестостерон в организме гидробионтов находится преимущественно в виде эфиров, то экстракцию 95%-ным этиловым спиртом можно считать наиболее эффективной. Первым условием безопасного использования гормонсодержащего сырья является ограничение по содержанию индивидуальных гормонов. Концентрация гормонов должна быть сопоставима с их содержанием в крови человека. Вторым условием безопасного использования гормонсодержащего сырья является соблюдение соотношений индивидуальных гормонов, близких к аналогичным соотношениям в крови человека. В таблице 2 приведена концентрация общего тестостерона в биологических жидкостях человека [1, 3, 6, 7, 8]. Точность измерений и, в этой связи, их интерпретация оказывается в зависимости от использованной методики измерений.

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности применения гонад и/или половых продуктов черноморской мидии в качестве сырья для биологически активной добавки, предназначенной для поддержания общего физиологического статуса и репродуктивной активности человека. Гонады и половые продукты гидробионтов отличаются относительной стабильностью содержания гормонов, вне зависимости от вида, так как концентрация каждого гормона в большинстве случаев имеет один и тот же порядок величин у разных видов животных.

На базе Института биологии южных морей им. А.О. Ковалевского, г. Севастополь была разработана методика отбора половых продуктов черноморской мидии [2], которой авторы воспользовались для получения чистого однородного осадка сперматозоидов и яйцеклеток, использовавшихся в качестве исходного сырья для получения биологически активных веществ.

Примеры выполнения способа.

Пример 1

Замороженные или свежесобранные гонады черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam. помещали в реактор, заливали 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:5 (исходное сырье:этиловый спирт), настаивали в течение суток при комнатной температуре, полученный экстракт декантировали. Гонады вновь заливали 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:5 (сырье:этиловый спирт), настаивали в течение суток при комнатной температуре, полученный экстракт декантировали. Оба экстракта объединяли, отстаивали при комнатной температуре в течение суток до получения прозрачного раствора, который затем фильтровали. Полученный продукт обладал оранжевым цветом с характерным вкусом свежих дрожжей. Концентрацию общего тестостерона в готовом продукте определяли с помощью иммуноферментного анализатора типа "Shorus" (Италия) при помощи набора для иммуноферментного анализа, произведенного в Германии (фирма DRG), на длине волны 450 нм. Концентрации стандарта тестостерона были равны: 0-0.2-0.5-1-2-6-16 нг/мл (1 нг/мл=1000 пг/мл=3.467 нмоль/л). Концентрация общего тестостерона в полученном продукте в пересчете на 1 г сухой массы гонад составила 569.7870 пг/г. Количество массы гонад в сырой рассчитывали исходя из того, что масса гонады после усушки составляет в среднем 10% от массы сырой гонады [4].

Пример 2

Замороженные или свежесобранные сперматозоиды черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam. помещали в реактор, заливали 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:5 (исходное сырье:этиловый спирт), настаивали в течение суток при комнатной температуре, полученный экстракт декантировали. Сперматозоиды вновь заливали 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:5 (сырье:этиловый спирт), настаивали в течение суток при комнатной температуре, полученный экстракт декантировали. Оба экстракта объединяли, отстаивали при комнатной температуре в течение суток до получения прозрачного раствора, который затем фильтровали. Полученный продукт обладал прозрачным цветом с характерным вкусом свежих дрожжей. Концентрацию общего тестостерона в готовом продукте определяли с помощью иммуноферментного анализатора типа "Shorus" (Италия) при помощи набора для иммуноферментного анализа, произведенного в Германии (фирма DRG), на длине волны 450 нм. Концентрации стандарта тестостерона были равны: 0-0.2-0.5-1-2-6-16 нг/мл (1000 пг/мл = 3.467 нмоль/л). Концентрация общего тестостерона в полученном продукте в пересчете на 1 г лиофилизированных половых продуктов составила 14306.32 пг/г. Количество сухой массы сперматозоидов в сырой рассчитывали исходя из того, что количество лиофилизированных сперматозоимдов, полученных от одной мидии, составляет в среднем 0.197±0.157 г [3].

Пример 3

В качестве исходного сырья использовали яйцеклетки черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam. Конечный продукт получали аналогично примерам 1, 2. Полученный продукт обладал оранжевым цветом с характерным вкусом свежих дрожжей. Концентрация тестостерона в готовом продукте составила 10 пг/г. Количество сухой массы яйцеклеток в сырой рассчитывали исходя из того, что количество лиофилизированных яйцеклеток, полученных от одной мидии, составляет в среднем 0.360±0.121 г [3].

Библиографический список использованной литературы

1. Базарнова М.А. Клиническая биохимия. - Киев: Изд-во "Вища школа", 1986. - 188 с.

2. Караванцева Н.В., Поспелова Н.В., Бобко Н.И. Методика отбора половых продуктов мидии Mytilus galloprovincialis Lam. // Системы контроля окружающей среды. - 2012. - Вып. 17. - С. 184-187.

3. Николаева А.Ю. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. - М.: Изд-во Медицина, 1984. - 166 с.

4. Поспелова Н.В. Элементы баланса каратиноидов, α-токоферола и некоторых металлов в системе "взвешенное вещество - биоотложения": автореф. дисс. канд. биол. наук. - Севастополь, 2007. - 153 с.

5. Юрьева М.И., Лисаковская О.В., Акулин В.Н. Гонады морских ежей - источник для создания препаратов, стимулирующих половое поведение. // Биология моря. - 2003. - 29, вып. 17. - С. 213-216.

6. Adamopoulps D.A. et al., Acta Eur. Fertil. 1976, 7(3) 219-255.

7. Matsuda S. et al., Tohoru J. Exp. Med., 1975, 116(2) 201-202.

8. Shirai M. et al., Igaku No Agumi., 1976, 96(3) 121-122.

Учитывая значимость тестостерона в регуляции основных жизненных функций, теоретическая актуальность нашего изобретения существенно дополняется практическим значением черноморской мидии, являющейся ценным объектом аквакультуры, характеризующегося массовостью и доступностью, перспективностью широкого использования в различных отраслях народного хозяйства и научных исследованиях.

Способ получения биологически активного вещества из черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam., включающий заготовку сырья, последовательную обработку экстрагентами и объединение экстрактов, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют гонады, половые продукты (яйцеклетки и сперматозоиды) черноморской мидии, которые дважды обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:5 (сырье:этиловый спирт), настаивают в течение суток при температуре 20°C±2°C и отделяют экстракт, после чего объединенные экстракты отстаивают в течение 24 часов и отфильтровывают.