Композиции вакцин и способы их применения

Композиции вакцин и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Для данной заявки испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 61/165732, поданной 1-го апреля 2009 г. В данном документе авторы заявляют преимущество этой предшествующей патентной заявки, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение в основном относится к области химии и иммунологии. Более конкретно, изобретение относится к вакцинам, композициям и способам индукции иммунного ответа у субъекта.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предупреждение микробных инфекций и патогенных процессов с помощью вакцин считается одним из наиболее эффективных и предпочтительных методов борьбы с заболеваниями. Антигены или иммуногены вводят в организм таким образом, что они стимулируют иммунный ответ в организме-хозяине перед инфекцией или заболеванием. Однако для создания защиты от многих патогенов и раковых заболеваний традиционные вакцинные стратегии не эффективны. С помощью традиционных вакцинных стратегий успешные вакцины были получены только для 20 из более чем 100 патогенов. Из вакцин, которые индуцируют сильный цитотоксический Т-лимфоцитарный ответ (CTL-ответ), некоторые часто имеют невысокую частоту объективных ответов вследствие плохой иммуногенности, механизмов избегания иммунного ответа и антигенной вариабельности. Существующие способы доставки вакцин имеют невысокий процент успешности относительно индукции защитного иммунного ответа, поскольку они не вызывают выраженных «сигналов опасности», они запускают ингибиторные ответы, действующие по принципу обратной связи, и они доставляют антигены к непрофессиональным антиген-представляющим клеткам (АРС). Например, существующие противораковые вакцины, даже дающие высокий CTL-ответ, имеют низкую частоту объективных ответов (2,6%). У этих вакцин присутствует ряд недостатков, включая плохую иммуногенность и механизмы избегания иммунного ответа. Более того, наиболее многообещающие противораковые вакцины (на основе дендритных клеток и на базе G-vax) являются очень дорогими по себестоимости, а получение этих вакцин является очень сложным (например, требующим индивидуальных схем и производства по стандартам GMP).

Генетическая вакцинация или генетическая иммунизация, которая включает введение генетических материалов хозяевам-млекопитающим для продукции антигенов, рассматривается как потенциальный подход в отношении вакцин, в том числе противораковых вакцин. Доставленный в организм вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, который кодирует целевой антиген, приводит в результате к in vivo экспрессии и впоследствии к развитию антиген-специфичных ответов. Кроме того, гены представляют собой отрицательно заряженные полимеры, которые не могут преодолевать клеточные мембраны и проникать в ядро клетки, где они могут экспрессировать целевой белок. Генетическая вакцинация предоставляет ряд преимуществ, включая создание полного спектра нативных эпитопов, экспрессирующихся in vivo, получение нативной конформации белка по сравнению с введением рекомбинантного белка, экспрессированного in vitro, индукцию гуморального и клеточного иммунных ответов и устранение необходимости дорогостоящих и обычно проблемных стадий продукции антигена. Однако генетическая вакцинация связана с рядом недостатков, в том числе с нарушением толерантности к собственным антигенам, плохой in vivo доставкой нуклеиновых кислот в клетку и ядро, отсутствием специфичности к конкретным типам клеток и слабыми иммунными ответами.

Другие формы вакцин также имеют свои недостатки. Например, вирусная доставка генов приводит к сильным иммунным ответам на вирусные векторы, но ее безопасность вызывает вопросы. Очистка белка из бактерий и получение пептидов для использования в качестве антигенов дороги и занимают время.

На текущий момент не существует экономически выгодных, эффективных форм вакцин, мишенью которых являются АРС, для получения специфичных и сильных иммунных ответов, которые при этом не имеют или имеют немного побочных эффектов. Необходима вакцина, мишенью которой являются профессиональные АРС, которая вызывает сильный и специфичный клеточный и гуморальный ответы, а также безопасная, выгодная по себестоимости и легкая в применении.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описаны композиции, наборы и способы, а также платформы, на основе наночастиц для доставки антигена или нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, к профессиональным АРС (РАРС) in vivo, которые приводят в результате к сильному и специфичному иммунному ответу на антиген. Также в данном документе описаны композиции, наборы и способы, а также платформы, на основе наночастиц для доставки киРНК к профессиональным АРС и доставки нуклеиновых кислот, пептидов или белков к клеткам (например, опухолевым клеткам, экспрессирующим МНС II класса). Основной проблемой существующих вакцинных стратегий является то, что они индуцируют супрессорные клетки, включая регуляторные Т-клетки. Известно, что направленная доставка антигена к РАРС снижает или ингибирует активацию супрессорных механизмов, в частности, опосредованных регуляторными Т-клетками. Композиции, наборы и способы включают объединенное применение МНС-направленных и иммуногенных пептидов (например, PADRE, HA) с заряженными (например, положительно заряженными) высоко разветвленными полимерными дендримерами (например, РАМАМ и другими дендримерами) в качестве носителей для направленной доставки нуклеиновых кислот, пептидов или полипептидов к определенным клеткам, давая начало новому способу, основанному на применении наночастиц, для генетической или белковой вакцинации. Типичные вакцины, описанные в данном документе, включают заряженный (например, положительно заряженный) высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный с МНС-направленным и иммуногенным пептидом, таким как Т-хелперный пептид (например, эпитопом, таким как PADRE-пептид или НА вируса гриппа), по меньшей мере один полипептидный антиген или нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один антиген, и, необязательно, поли-I-С. Положительно заряженные высоко разветвленные полимерные дендримеры, описанные в данном документе, эффективно связывают отрицательно заряженные биомолекулы, включая ДНК, РНК и другие. Заряженные (например, положительно заряженные) высоко разветвленные полимерные дендримеры, конъюгированные с Т-хелперным пептидом (например, эпитопом, таким как PADRE-пептид или НА вируса гриппа), обеспечивают более эффективные вакцины благодаря специфичной доставке антигена к РАРС. В описанных в данном документе экспериментах показано первое применение PADRE для направленной доставки к РАРС через его связывание с молекулами МНС II класса. В представленных в данном документе экспериментах описано эффективное применение двух различных направленных пептидов, чьим уникальным признаком является связывание с МНС II класса. Таким образом, описанные в данном документе вакцины, способы и композиции охватывают все пептиды, связывающие МНС II класса. Вакцины, наборы и композиции, описанные в данном документе, обеспечивают специфичную и эффективную трансфекцию РАРС in vivo и встроенную универсальную Т-хелперную активность, что приводит к созреванию аутологичных РАРС и, следовательно, к сильным и специфичным иммунным ответам.

Дендримеры являются идеальными кандидатами для доставки ДНК, поскольку они обеспечивают структурный контроль по размеру и форме (вследствие наличия «грузового отсека»), биологически совместимы (нетоксичны и неиммуногенны), образуют высокоточные каркасы, имеют на поверхности строго определенные модифицируемые функциональные группы для направленного взаимодействия с молекулами, способны прикрепляться к клетке и за счет эндоцитоза попадать в цитоплазму или ядро, имеют приемлемую биодеградацию (способность безопасно разлагаться в организме), а их синтез (с медицинской чистотой) является легким и стабильно воспроизводимым. В описанных в данном документе экспериментах конъюгированный с ДНК, киРНК, пептидом или полипептидом положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример включает пептид (например, PADRE-пептид или НА вируса гриппа), который направленно связывается с АРС и активирует хелперные Т-клетки как у людей, так и у мышей. PADRE-пептид имеет две основные функции: сопровождение ДНК к РАРС благодаря своей способности связываться с присутствующими на РАРС МНС II класса и стимуляцию Т-хелперных клеток, что усиливает генерацию цитотоксических Т-клеток и переключение между классами, необходимое для гуморального ответа. Эта новая наноконструкция обладает уникальными свойствами в отношении доставки генов и пептидов, а также вакцинации. В описанных в данном документе экспериментах также показано, что положительно заряженные высоко разветвленные полимерные дендримеры (РАМАМ-дендримеры), конъюгированные с PADRE, задерживают рост и уменьшают размер сформировавшихся и высоко агрессивных опухолей меланомы B16/LU8 у мышей C57BL на 50% при терапевтической схеме введения и полностью (на 100%) элиминируют опухоль B16/OVA при профилактической схеме введения, индуцируют сильные иммунные ответы против продукта гена, используемого для вакцинации, демонстрируют 2- или 3-кратное увеличение эффективности трансфекции АРС как мыши, так и человека, доставляют плазмиду, кодирующую GFP, in vivo в дренирующие лимфатические узлы и эффективно доставляют киРНК в В- и Т-клетки человека и мышиные макрофаги.

Описанные в данном документе композиции и вакцины являются подогнанной и идеальной платформой для вакцинации, поскольку они направлены на клетки, положительные по МНС II класса, все или практически все из которых являются РАРС. Однако, что важно, клетки, положительные по МНС II класса, экспрессируют весьма важные коингибиторные и костимуляторные молекулы (в том числе, но не ограниченные этим, CD80, CD86, B7-H1, B7-H4, B7-DC, CD137, OX40, Foxp3 и их гипотетические костимуляторные рецепторы), которые подавляют или усиливают активацию Т-клеток. Направленные манипуляции с экспрессией молекул, вовлеченных в эти сигнальные пути, можно использовать для: i) иммунотерапии/вакцинации против рака, инфекционных заболеваний или других новых подходов в вакцинации, таких как вакцинация от различных типов зависимости или бесплодия, или нейтрализации болезнетворного агента у субъекта, а также для контроля аутоиммунных явлений. Описанная в данном документе направленная доставка вакцин к АРС предлагает решение проблем, ассоциированных с существующими стратегиями вакцинации, благодаря гораздо более сильным иммунным ответам, уменьшению действия супрессирующих механизмов/механизмов, действующих по принципу обратной связи, и предупреждению токсичности вследствие снижения дозы вакцины.

Соответственно, в данном документе описана вакцина, содержащая по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и с нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один антиген, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного антигена. В вакцине по меньшей мере один дендример может быть связан с полиинозиновой-полицитидиловой кислотой. Этот вариант осуществления может включать фармацевтически приемлемый носитель и/или эмульсию «вода в масле». В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одним Т-хелперным пептидом является эпитоп Pan-DR (PADRE), например, два PADRE-эпитопа, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. По меньшей мере один Т-хелперный пептид может также быть НА вируса гриппа. Нуклеиновая кислота может быть экспрессионным вектором, а по меньшей мере один антиген может быть раковым антигеном или антигеном из инфекционного патогена. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером.

Также в данном документе описана вакцина, содержащая по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одним пептидным или полипептидным антигеном, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена. В одном варианте осуществления изобретения один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример дополнительно конъюгирован со вторым пептидным или полипептидным антигеном, который отличается от по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена. Вакцина может дополнительно содержать второй заряженный сильно разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и со вторым пептидным или полипептидным антигеном, который отличается от по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и второй пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью второго заряженного сильно разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, второго заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и второго пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против второго пептидного или полипептидного антигена. По меньшей мере один дендример может быть связан с полиинозиновой-полицитидиловой кислотой. Вакцина может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель и/или эмульсию «вода в масле». По меньшей мере один Т-хелперный пептид является эпитопом Pan-DR (PADRE), например, двумя Pan-DR-эпитопами, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один Т-хелперный пептид является НА вируса гриппа. По меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген может быть раковым антигеном или антигеном из инфекционного патогена. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером.

Дополнительно в данном документе описан способ доставки антигена в организм млекопитающего и индукции в организме млекопитающего продукции моноклональных антител к антигену. Способ включает стадии: введения млекопитающему композиции, содержащей по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одним пептидным или полипептидным антигеном, или с нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один антиген, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота или по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты или по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена; причем композицию вводят в количестве, эффективном для индукции опосредованной МНС II класса активации Т-хелперных клеток, а введение композиции млекопитающему приводит к продукции моноклональных антител к по меньшей мере одному пептидному или полипептидному антигену. В варианте осуществления изобретения, в котором млекопитающее имеет раковое заболевание, по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген является раковым антигеном, а композиция является противораковой вакциной. Обычно введение композиции не вызывает местных побочных реакций у млекопитающего. В другом варианте осуществления изобретения, в которой млекопитающее имеет инфекционное заболевание, по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген относится к инфекционному патогену, а композиция представляет собой вакцину против инфекционного патогена, обычно не вызывающую местных побочных реакций у млекопитающего. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть связан с полиинозиновой-полицитидиловой кислотой, и/или может включать фармацевтически приемлемый носитель и/или эмульсию «вода в масле».

В одном варианте осуществления этого способа по меньшей мере один Т-хелперный пептид является PADRE-эпитопом, например, двумя PADRE-эпитопами, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. По меньшей мере один Т-хелперный пептид также может быть НА вируса гриппа. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть дополнительно конъюгирован со вторым пептидным или полипептидным антигеном, который отличается от по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена. Композиция может дополнительно содержать второй заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и со вторым пептидным или полипептидным антигеном, который отличается от по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и второй пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью второго заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, второго заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и второго пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против второго пептидного или полипептидного антигена.

В одном варианте осуществления изобретения для продукции и получения антител, млекопитающим может быть грызун или кролик, и моноклональные антитела выделяют из млекопитающего. В этом варианте осуществления изобретения моноклональные антитела получают с использованием следующих стадий: выделения антител из млекопитающего, титрования антител, удаления селезенки из млекопитающего и проведения слияния с миеломой. Антитела можно гуманизировать.

Дополнительно в данном документе описана композиция, включающая по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный кроме того по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной киРНК, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и киРНК конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером, по меньшей мере один Т-хелперный пептид может быть PADRE-пептидом, а киРНК может быть направлена против, например, CTLA-4, Foxp3, CD28, IDO или аргиназы 1.

Кроме того, в данном документе описан способ доставки киРНК в профессиональные антиген-представляющие клетки, включающий стадии: предоставления композиции, содержащей по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной киРНК, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и киРНК конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками; и введения композиции млекопитающему субъекту в условиях, при которых по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной киРНК, связывается с антиген-представляющей клеткой, и киРНК входит в профессиональную антиген-представляющую клетку. Заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером, по меньшей мере один Т-хелперный пептид может быть, например, PADRE, а киРНК может быть направлена против, например, CTLA-4, Foxp3, CD28, IDO или аргиназы 1. В одном варианте осуществления изобретения киРНК предупреждает экспрессию CTLA-4, Foxp3, CD28, IDO или аргиназы 1 в профессиональной антиген-представляющей клетке.

Еще дополнительно в данном документе описан способ ингибирования пролиферации опухолевых клеток, несущих на поверхности молекулы МНС II класса (например, лимфомы или части клеток лимфомы), или индукции апоптоза в опухолевых клетках, несущих на поверхности молекулы МНС II класса, у млекопитающего. Этот способ включает стадии: введения млекопитающему композиции, содержащей по меньшей мере один положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота конъюгированы и связаны с внешней поверхностью по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что, по меньшей мере, один Т-хелперный пептид специфично связывается с опухолевыми клетками, несущими на поверхности молекулы МНС II класса, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты или белка, кодируемого нуклеиновой кислотой, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток, несущих на поверхности молекулы МНС II класса, или индуцирует апоптоз в опухолевых клетках, несущих на поверхности молекулы МНС II класса. Например, положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером, по меньшей мере один Т-хелперный пептид может быть PADRE. Однако можно использовать любые подходящие положительно заряженные высоко разветвленные дендримеры и Т-хелперные пептиды.

Способ доставки нуклеиновой кислоты в клетку, описанный в данном документе, включает контактирование клетки с композицией, содержащей по меньшей мере один положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным эпитопом и с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид или белок, причем по меньшей мере один Т-хелперный эпитоп и нуклеиновая кислота конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный эпитоп связывается с клеткой, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного эпитопа, по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты интернализуется клеткой. В этом способе пептид или белок обычно экспрессируются в клетке. Хотя можно использовать любые подходящие положительно заряженные высоко разветвленные дендримеры и Т-хелперные пептиды, положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть, например, РАМАМ-дендримером, а по меньшей мере один Т-хелперный пептид может быть, например, PADRE-пептидом.

Композиция для доставки нуклеиновой кислоты в клетку, описанная в данном документе, включает по меньшей мере один положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид или белок, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с клеткой, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты интернализуется клеткой. Например, положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером, а по меньшей мере один Т-хелперный пептид может быть PADRE-пептидом. Однако можно использовать любые подходящие положительно заряженные высоко разветвленные дендримеры и Т-хелперные пептиды.

Если не указано иное, то все используемые в данном документе технические термины имеют такое же значение, которое обычно понимает под ними средний специалист в области, к которой относится изобретение.

Используемые в данном документе термины «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» означают цепь из двух или нескольких нуклеотидов, такую как РНК (рибонуклеиновая кислота) и ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), а также химически модифицированных нуклеотидов. «Очищенной» молекулой нуклеиновой кислоты является та, которая по существу отделена от других нуклеотидных последовательностей в клетке или организме, в которых нуклеиновая кислота встречается в природе (например, свободная от примесей на 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100%). Термины включают, например, молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включенную в вектор, плазмиду, вирус или геном прокариот или эукариот. Примеры очищенных нуклеиновых кислот включают кДНК, фрагменты геномных нуклеиновых кислот, нуклеиновые кислоты, полученные с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), нуклеиновые кислоты, полученные обработкой ферментом рестрикции геномных нуклеиновых кислот, рекомбинантные нуклеиновые кислоты и химически синтезированные молекулы нуклеиновых кислот. Молекула «рекомбинантной» нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, собранную искусственным объединением двух в ином случае разделенных сегментов последовательности, например, с помощью химического синтеза или с помощью манипуляций с выделенными сегментами нуклеиновых кислот с использованием методик генной инженерии.

При упоминании аминокислотного остатка в пептиде, олигопептиде или белке, термины «аминокислотный остаток», «аминокислота» и «остаток» используются взаимозаменяемо и при использовании в данном документе означают аминокислоту или аминокислотный миметик, ковалентно присоединенные по меньшей мере к одной другой аминокислоте или к одному другому аминокислотному миметику через амидную связь или имитацию амидной связи.

Используемые в данном документе термины «белок» и «полипептид» применяются в качестве синонимов для обозначения любой соединенной пептидной связью цепи аминокислот, вне зависимости от длины или пост-трансляционной модификации, например, гликозилирования или фосфорилирования.

При упоминании молекулы нуклеиновой кислоты, полипептида или инфекционного патогена, термин «нативный (нативная)» относится к нуклеиновой кислоте, полипептиду или инфекционному патогену, встречающимся в природе (например, дикого типа (WT)).

Используемый в данном описании термин «антиген» или «иммуноген» означает молекулу, которую специфично узнает и связывает антитело.

При упоминании эпитопа (например, Т-хелперного эпитопа) под биологической активностью понимается способность связывать соответствующую молекулу МНС, а в случае пептидов, пригодных для стимуляции CTL-ответов - способность индуцировать Т-хелперный ответ и CTL-ответ против целевого антигена или миметика антигена.

Термины «специфичное связывание» и «специфично связывает» относятся к такому связыванию, которое происходит между двумя такими парными элементами, как фермент/субстрат, рецептор/агонист, антитело/антиген и т.д., и которое может опосредоваться ковалентными или нековалентными взаимодействиями или комбинацией ковалентных и нековалентных взаимодействий. Когда взаимодействие двух элементов дает нековалентно связанный комплекс, то возникающее связывание обычно является электростатическим, образуется за счет водородных связей или является результатом липофильных взаимодействий. Соответственно, «специфичное связывание» возникает между парными элементами, когда между двумя элементами, образующими связанный комплекс, существует взаимодействие, имеющее характеристики взаимодействия антитела с антигеном или фермента с субстратом. В частности, специфичное связывание отличается связыванием одного члена пары с конкретными элементами, но не с другими элементами в семействе соединений, к которому принадлежит соответствующий член связанной пары.

Используемые в данном описании термины «Pan-DR-эпитопы», «Pan-HLA-DR-связывающий эпитоп», «PADRE» и «PADRE-пептиды» означают пептид от 4 до 20 остатков, способный связывать с высокой аффинностью по меньшей мере примерно 7 из 12 наиболее распространенных DR-аллелей (DR1, 2w2b, 2w2a, 3, 4w4, 4w14, 5, 7, 52a, 52b, 52c и 53). В данном документе «высокая аффинность» определена как связывание с IC₅₀% меньше 200 нМ. Например, высокоаффинное связывание включает связывание с IC₅₀% меньше 3100 нМ. Для связывания с МНС II класса, типичным порогом аффинности связывания является 1000 нМ, а аффинность меньше 100 нМ обычно считается высокоаффинным связыванием. Конструирование и применение PADRE-пептидов подробно описано в патенте США № 5736142, включенном в данный документ путем ссылки.

Используемый в данном документе термин «Т-хелперный пептид» относится к пептиду, распознаваемому Т-клеточным рецептором Т-хелперных клеток. Например, описанные в данном документе PADRE-пептиды являются Т-хелперными пептидами.

Используемый в данном документе термин «дендример» означает заряженную (например, положительно заряженную, отрицательно заряженную) высоко разветвленную полимерную макромолекулу приблизительно сферической формы. Примером положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера является РАМАМ-дендример. Под терминами «РАМАМ-дендример» и «поли-амидоаминный дендример» понимается тип дендримера, в котором третичные амины расположены в местах разветвления, а структурные слои соединены амидной связью.

Под терминами «РАМАМ-дендример» и «поли-амидоаминный дендример» понимается тип дендримера, в котором третичные амины расположены в местах разветвления, а структурные слои соединены амидной связью. РАМАМ-дендримеры имеют большой положительный заряд на своей поверхности.

Под термином «производное дендримера» понимается дендример, имеющий одну или несколько функциональных групп, конъюгированных с его поверхностью.

«PADRE-производное дендримера» или «PADRE-дендример» представляют собой наноконструкцию, в которой один или несколько PADRE-пептидов ковалентно присоединены к функциональным группам на поверхности заряженного (например, положительно заряженного) высоко разветвленного полимерного дендримера (например, РАМАМ-дендримера).

Термин «конъюгированный» означает, что одна молекула или агент физически или химически присоединены или прикреплены к другой молекуле или другому агенту. Примеры конъюгации включат ковалентную связь и электростатическое комплексообразование. Термины «находится в комплексе», «находится в комплексе с» и «конъюгированный» используются в данном документе взаимозаменяемо.

Используемая в данном документе фраза «идентичность по последовательности» означает процент идентичных субъединиц в соответствующих позициях в двух последовательностях (например, нуклеотидных последовательностях, аминокислотных последовательностях) при выравнивании двух последовательностей до максимального совпадения субъединиц, то есть с учетом пропусков и вставок. Идентичность по последовательности можно определить с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, программного пакета для анализа последовательностей от Accelrys CGC, San Diego, CA).

Фразы «выделенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который по существу или практически свободен от компонентов, обычно сопровождающих его в природе.

Используемый в данном документе термин «наночастица» означает микроскопическую частицу, чей размер исчисляется нанометрами. Например, наночастицей является конъюгат PADRE-дендримера или частица, объединяющая несколько PADRE-дендримерных конъюгатов и нуклеиновый или аминокислотный материал с общим диаметром в диапазоне приблизительно 2-500 нм.

Термин «антитело» включает поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAb), химерные антитела, гуманизированные антитела, анти-идиотипические (anti-Id) антитела к антителам, которые можно пометить в растворенной или или связанной форме, а также их фрагменты, области или производные, полученные с помощью любой известной методики, такой как, но не ограниченной этим, ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные методики.

Используемый в данном документе термин «адъювант» означает любой материал, который усиливает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ.

Используемые в данном документе термины «представленный» или «экспонированный на поверхности» считаются синонимами, и относятся к антигенам или другим молекулам, которые присутствуют (например, доступны для распознавания иммунного участка) на внешней поверхности структуры, такой как наночастица (например, PADRE-дендример).

Под термином «мультивалентный» подразумевается, что на наночастице представлено более одной копии или типа антигена или молекулы.

Используемый в данном документе термин «вакцина» включает все профилактические и терапевтические вакцины. Описанные в данном документе композиции вакцин подходят для введения субъектам в биологически совместимой форме in vivo. Используемое в данном документе выражение «биологически совместимая форма, подходящая для введения in vivo» означает форму вводимого вещества, для которой терапевтические эффекты перевешивают любые токсические эффекты. Вещества можно вводить любому животному, например, человеку. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцину, описанную в данном документе, вводят млекопитающему, например, грызуну или кролику, для получения моноклональных антител к конкретному антигену.

Под фразой «иммунный ответ» понимается индукция гуморального и/или иммунного клеточного ответов, специфичных к антигену или антигенам. Индукция иммунного ответа зависит от множества факторов, включая иммуногенное состояние вакцинируемого организма, химическую композицию и конфигурацию антигена и способа и времени введения антигена. Иммунный ответ имеет много