Способ лечения диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови путем ингибирования masp-2 зависимой активации комплемента

Способ лечения диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови путем ингибирования masp-2 зависимой активации комплемента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка истребует приоритет согласно предварительной заявке №61/279279, поданной 16 октября 2009 г., и предварительной заявке №61/322722, поданной 9 апреля 2010 г., и которые включены в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ В ОТНОШЕНИИ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Перечень последовательностей, связанный с настоящей заявкой, предоставлен в текстовом формате вместо бумажной копии, и включен в настоящую заявку путем отсылки к описанию. Название текстового файла, содержащего перечень последовательностей: 35668_Seq_Final.txt. Размер текстового фала - 109 Кб. Он был создан 15 октября 2010 г., и предоставляется через EFS-Web совместно с подачей спецификаций.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Система комплемента представляет собой механизм раннего реагирования, служащий для инициации и усиления воспалительной реакции в ответ на микробную инфекцию и другие острые поражения (М.K.Liszewski and J.P.Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York). Несмотря на то, что активация комплемента обеспечивает весьма ценную первоочередную защиту от потенциальных патогенов, активность комплемента, которая вызывает защитную воспалительную реакцию, может также представлять потенциальную угрозу для организма хозяина (K.R.Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P.Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). Например, протеолитические продукты С3 и С5 мобилизуют и активируют нейтрофильные лейкоциты. Эти активированные клетки являются неразборчивыми при выработке разрушающих ферментов и могут привести к поражению органов. Кроме того, активация комплемента может привести к накоплению цитолитического комплекса терминальных компонентов комплемента как на микробных клетках-мишенях, так и на соседних клетках организма хозяина, что приводит к лизису клеток организма хозяина.

Считается, что система комплемента принимает участие в патогенезе многочисленных острых и хронических заболеваний, включая: инфаркт миокарда, реваскуляризация вследствие нарушения мозгового кровообращения, респираторный дистресс-синдром у взрослых (ARDS), поражение вследствие реперфузии, септический шок, капиллярное кровотечение вследствие термического ожога, воспаление вследствие посткардиолегочного шунтирования, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, прогрессирующая миастения, и болезнь Альцгеймера. Почти во всех перечисленных случаях комплемент не является непосредственной причиной данных заболеваниях, но представляет собой один из серьезных факторов, вовлеченных в патогенез. Тем не менее, активация комплемента может быть главным патологическим механизмом и представлять собой эффективный показатель для клинического контроля при многих из указанных выше заболеваниях. Растущее признание важности комплемент-опосредованных поражений тканей во множестве болезней подчеркивает необходимость создания эффективных медикаментов для ингибирования комплемента. В настоящее время не существует официально одобренных для использования человеком медикаментов, которые бы имели специфическую нацеленность и ингибировали бы активацию комплемента. В настоящее время широко известно, что система комплемента может быть активирована тремя различными путями: классическим путем активации, пектиновым путем активации и альтернативным путем активации комплемента. Классический путь активации обычно инициируется при связывании антитела с инородной частицей (т.е., антигеном) и, таким образом, требует предварительного воздействия данного антигена для генерации специфического антитела. Поскольку активация классического пути связана с развитием иммунной реакции, классический путь активации является частью приобретенной иммунной системы. В отличие от этого, лектиновый и альтернативный пути не зависят от клонального иммунитета и являются частью врожденной иммунной системы.

Первым шагом в активации классического пути является прикрепление специфической молекулы распознавания, C1q, к антигенно-нагруженным элементам IgG и IgM. Результатом активации системы комплемента является последовательная активация зимогенов сериновой протеазы. C1q связан с проферментами сериновой протеазы C1r и C1s в комплексе, известном как C1u, при связывании C1q с иммунным комплексом, аутопротеолитическое расщепление участка Arg-Ile элемента C1r сопровождается C1r-активацией C1s, которая необходима для возможности расщепления С4 и С2. Расщепление С4 на два фрагмента, обозначенных соответственно С4а и C4b, позволяет фрагментам C4b сформировать ковалентные связи с примыкающим гидроксильными или аминогруппами и последующей генерацией конвертазы С3 (C4b2b) посредством нековалентного взаимодействия с фрагментом C2b активированного элемента С2. Конвертаза С3 (C4b2b) активизирует элемент С3, который направляет генерацию конвертазы С5 (C4b2b3b) и формирование мембраноатакующего комплекса (C5b-9), что может спровоцировать микробный лизис. Активированные формы С3 и С4 (C3b и C4b) ковалентно расположены на чужеродных целевых поверхностях, которые распознаются рецепторами комплемента на множественных фагоцитах.

Независимо, первым шагом в активации системы комплемента при лектиновом пути также является прикрепление специфической молекулы распознавания, за которым следует активация ассоциированных сериновых протеаз. Однако более верным, чем прикрепление к иммунным комплексам при помощи C1q, является то, что молекулы распознавания в лектиновом пути активации представляют собой белки, связывающие углеводороды (маннозосвязывающий лектин (MBL), Н-фиколин, М-фиколин, и L-фиколин) (J.Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, 2002; Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)). Икеда (Ikeda et al.) первым продемонстрировал, что подобно C1q, MBL может активировать систему комплемента С4-зависимым путем, прикрепляясь к эритроцитам, покрытым маннанами дрожжей (K.Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987). MBL, член семейства коллектиновых белков, представляет собой кальций-зависимый лектин, который связывает карбогидраты с 3- и 4-гидроксигруппами, ориентированными в экваториальной плоскости пиранозного кольца. Главными лигандами для MBL являются, таким образом, D-манноза и N-ацетил-D-глюкозамин, в то время как для карбогидратов, не соответствующих подобному стерическому требованию, афинность по отношению к MBL не выявлена (Weis, W.I., et al., Nature 360:127-134, 1992). Взаимодействие между MBL и моновалентными сахарами является чрезвычайно слабым, с типичными константами диссоциации порядка 2 ммоль. MBL достигает стойкого специфичного связывания с полисахаридными лигандами в процессе одновременного взаимодействия с множественными остатками моносахаридов (Lee, R.T, et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, 1992). MBL распознает углеводородные структуры, которые обычно покрывают микроорганизмы, такие как бактерии, дрожжи, паразиты и некоторые вирусы. Однако MBL не распознает D-галактозу и сиаловую кислоту, предпоследний и последний сахара, которые обычно покрывают «зрелый» гликоконъюгатный комплекс гликопротеинов, присутствующих в плазме млекопитающих и находящихся на поверхности их клеток. Данная специфичность связывания может помочь в защите от самопроизвольной активации. Однако MBL не образует высокоаффинных связей со скоплениями высокоразветвленных маннозных предшественников гликанов на N-связанных гликопротеинах и гликолипидах, находящихся в эндоплазмическом ретикулуме и звездчатых невроцитах (Гольджи) клеток млекопитающих (Maynard, Y., et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, 1982). Следовательно, поврежденные клетки являются потенциальными мишенями для пектинового пути активации посредством MBL-связывания.

Фиколины обладают отличным от MBL типом лектинового домена, известным как фибриноген-подобный домен. Фиколины связывают остатки сахара Са++-независимым путем. У людей идентифицировано три типа фиколинов: L-фиколин, М-фиколин и Н-фиколин. Два сывороточных фиколина, L-фиколин и Н-фиколин имеют общность в специфичности к М-ацетил-D-глюкозамину; однако Н-фиколин также связывается с N-ацетил-D-галактозамином. Специфичность по отношению к различным сахарам у L-фиколина, Н-фиколина и MBL означает, что различные пектины могут быть комплементарны различным, хотя и частично перекрывающимся гликоконъюгатам. Данная концепция поддерживается недавним сообщением о том, что среди известных науке пектинов, принимающих участие в пектиновом пути активации, только L-фиколин специфическим образом связывается с липотейхоевой кислотой, гликоконъюгатом клеточной стенки, обнаруженным во всех Грамм-положительных бактериях (Lynch, N. J., et al., J. Immunol. 172:1198-1202, 2004). Коллектины (т.е., MBL) и фиколины не имеют значительного сходства в аминокислотной последовательности. Однако эти две группы белков имеют схожие организации доменов и, подобно Clq, собираются в олигомерические структуры, которые максимально увеличивают возможность многосайтового связывания. У здоровых людей концентрация MBL в сыворотке сильно варьирует в популяциях, и он генетически контролируется полиморфизмом/мутациями как в промоторе, так и в кодирующей области MBL гена. Так как белок MBL является белком острой фазы, то его дальнейшая экспрессия регулируется во время воспалительного процесса. L-фиколин присутствует в сыворотке в такой же концентрации, как и MBL. Поэтому, роль L-фиколина в пектиновом пути активации по значимости потенциально сравнима с ролью MBL. MBL и фиколины могут также выступать в роли опсонинов, которые требуют взаимодействия между данными белками и рецепторами фагоцитов (Kuhlman, M., et al., J. Exp.Med. 169:1733, 1989; Matsushita, M., et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, 1996). Однако идентичность рецептора (ов) на клетках-фагоцитах не была установлена.

MBL человека при помощи своего коллагеноподобного домена осуществляет высокоаффинное специфичное взаимодействие с уникальными Clr/Cls-подобными сериновыми протеазами, названными MBL-ассоциированными сериновыми протеазами (MASPs). К настоящему времени описано три типа MASPs. Сначала одиночный фермент «MASP» был идентифицирован и охарактеризован как фермент, отвечающий за инициацию классического пути активации комплемента (т.е., расщепление С2 и С4) (Ji, Y.Н., et al., J. Immunol. 150:571-578, 1993). Позже выяснилось, что MASP на самом деле представляет собой комбинацию двух протеаз: MASP-1 и MASP-2 (Thiel, S., et al., Nature 386:506-510, 1997). Однако было продемонстрировано, что комплекс MBL-MASP-2 сам по себе является достаточным для активации комплемента (Vorup-Jensen, Т., et al. J. Immunol. 165:2093-2100, 2000). Кроме того, только MASP-2 расщеплял С2 и С4 с высокой результативностью (Ambrus, G, et al., J. Immunol. 170:1374-1382, 2003). Поэтому, MASP-2 представляет собой протеазу, ответственную за активацию С4 и С2 для генерации конвертазы С3, C4b2b. В этом заключается его значительное отличие от С1 комплекса где скоординированная активность двух специфичных сериновых протеаз (C1r и C1s) приводит к активации системы комплемента. Не так давно была выделена третья новая протеаза, MASP-3 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 и MASP-3 представляют собой продукты одного и того же гена, полученные в результате альтернативного сплайсинга. Их биологические функции до сих пор остаются невыясненными.

MASPs имеют одинаковую доменную организацию доменов с белками C1r и C1s, ферментными компонентам комплекса С1 (Sim, R.B., et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, 2000). Данные домены включают в себя N-концевой домен Clr/C1s/морского ежа ФРЭС/костного морфогенного белка (CUB), домен эпидермального фактора роста, второй домен CUB, тандем доменов белков, контролирующих комплемент, и домен сериновой протеазы. Как в протеазах С1, активация MASP-2 протекает при расщеплении связи Arg-Ile, примыкающей к домену сериновой протеазы, это приводит к расщеплению фермента на связанные дисульфидными связями цепочки А и В, последняя из которых состоит из домена сериновой протеазы. Генетически обусловленная неполноценность MASP-2 была описана в недавних исследованиях (Stengaard-Pedersen, K., et al., New Eng. J. Med. 349:554-560, 2003). Мутация одного нуклеотида приводит кАзр-у обмену в домене CUB1, что в свою очередь лишает MASP-2 способности связываться с MBL.

MBL также связывается с неферментным белком, обозначаемым как MBL-связанный белок 19 кДА kDa (МАр19) (Stover, C.M., J. Immunol. 162:3481-90, 1999) или малым MBL-связанным белком (sMAP) (Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11:859-863, 1999). МАр19 формируется при альтернативном сплайсинге продукта гена MASP 2 и содержит два первых домена MASP-2, за которыми следует дополнительная последовательность четырех уникальных аминокислот.Гены MASP I и MASP 2 расположены на хромосомах 3 и 1, соответственно (Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205:455-466, 2002).

Ряд данных указывает на то, что существуют различные комплексы MBL-MASPs, a также на то, что значительная часть находящихся в сыворотке MASPs не связана с MBL (Thiel, S., et al., J. Immunol. 165:878-887, 2000). Н- и L-фиколин также связываются с MASP и активируют лектиновый путь также, как MBL (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). Оба - лектиновый и классический, - пути активации комплемента формируют общую конвертазу С3 (C4b2b) и оба пути активации сходятся в этом пункте.

Повсеместно считается, что пектиновому пути активации комплемента принадлежит ведущая роль в иммунной защите организма против инфекции. Надежные доказательства вовлеченности MBL в иммунную реакцию были получены в результате наблюдений за субъектами, имеющими пониженный уровень функционального MBL в сыворотке (Kilpatrick, D.C., Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, 2002). Такие субъекты демонстрируют восприимчивость к рецидивирующим бактериальным и грибковым инфекциям (микозу). Данные симптомы обычно проявляются в раннем возрасте, во время определенного промежутка времени, когда титр производных от материнских антител снижается, а собственные антитела еще не вырабатываются в полном объеме. Данный синдром часто является следствием мутаций некоторых сайтов в коллагеновой части MBL, которая препятствует непосредственному образованию олигомеров MBL. Однако, так как MBL способен функционировать в качестве независимого от комплемента опсонина, остается невыясненным, до какого предела повышенная восприимчивость к инфекции обусловлена нарушениями в активации комплемента.

Несмотря на исчерпывающие доказательства участия всех путей активации - классического и альтернативных - в патогенезе неинфекционных человеческих заболеваний, роль пектинового пути активации только начинают оценивать. Недавние исследования показали, что активация пектинового пути может провоцировать активацию комплемента и воспаление, связанное с ишемическим реперфузионным поражением. Коллард (Collard et al.(2000)) сообщает, что культивируемые эндотелиальные клетки, подвергнутые окислительному стрессу, связываются с MBL и демонстрируют отложение С3 в присутствии человеческой сыворотки (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, 2000). Кроме того, обработка человеческой сыворотки блокирующими анти-MBL моноклональными антителами ингибирует связывание MBL и активацию комплемента. Данные открытия были проверены опытным путем на лабораторных крысах с миокардиальной ишемией-реперфузией, в процессе чего у крыс, подвергшихся лечению с блокирующими крысиный MBL антителами, наблюдали значительно меньше случаев поражения миокарда вследствие закупорки коронарной артерии, чем у крыс, подвергнутых лечению контрольными антителами (Jordan, J.E., et al., Circulation 104:1413-1418, 2001). Молекулярный механизм связывания MBL с эндотелием сосудов после окислительного стресса остается неясным; вследствие недавних исследований было выдвинуто предположение, что активация пектинового пути после окислительного стресса может быть опосредована связыванием MBL с васкулярными эндотелиальными цитокератинами, а не с гликоконьюгатами (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, 2001). В результате других исследований было выявлено, что роль классического и альтернативных путей активации в развитии патологического процесса ишемии/реперфузионного повреждения и роль пектинового пути в данном заболевании остается спорной (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).

В отличие от классического и пектинового путей, не было выявлено инициаторов альтернативного пути активации для осуществления распознавательных функций, выполняемых C1q и пектинами в двух вышеназванных путях. В настоящее время принято считать, что альтернативный путь активации инициируется спонтанно инородными или другими патологическими телами (бактерии, дрожжи, инфицированные вирусами клетки или поврежденные ткани). Существует четыре плазменных белка, напрямую вовлеченных в альтернативный путь активации: С3, факторы В и D, пропердин. Протеолитическая генерация C3b из нативного С3 необходима для функционирования альтернативного пути активации. Учитывая тот факт, что конвертаза альтернативного пути С3 (C3bBb) содержит C3b в качестве основной субъединицы, вопрос происхождения первой C3b посредством альтернативного пути активации представляет собой сложнейшую задачу, что стимулирует проведение соответствующих научных исследований.

Белок С3 принадлежит к семейству белков (совместно с С4 и а-2-макроглобулином), которое имеет редкую посттрансляционную модификацию, известную как тиоэфирное соединение. Тиоэфирная группа представлена глутамином, в котором конечная карбонильная группа связана с сульфгидрильной группой цистеина, который находится через три аминокислоты от глутамина. Данная связь является нестабильной, и электрофильная карбонил-группа глутамина может формировать ковалентную связь с другими молекулами через гидроксильную или аминокислотную группы. Тиоэфирная группа является достаточно устойчивой при секвестировании с гидрофобным участком неповрежденной С3. Однако протеолитическое расщепление С3 на С3а и C3b являет результатом экспозиции высоко реактивной тиоэфирной связи с C3b, и, при помощи подобного механизма, C3b ковалентно присоединяется к молекуле-мишени. Кроме хорошо известной роли в ковалентном прикреплении C3b к молекулярной мишени, тиоэфиру С3 также присваивают главную роль в инициации альтернативного пути активации комплемента. Согласно получившей широкое распространение теории «спящего механизма» (tick-over theory), альтернативный путь активации инициируется генерацией гомогенной конвертазы, iC3Bb, которая формируется из С3 и гидролизованного тиоэфира (iC3; С3(H2O)) и фактора В (Lachmann, PJ., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, 1984). C3b-подобная iC3 генерируется из исходной С3 путем медленного спонтанного гидролиза внутреннего тиоэфира в белковой молекуле (Pangburn, М.K., et al., J. Exp.Med. 154:856-867, 1981). В продолжение активности конвертазы iC3Bb, молекулы C3b размещаются на поверхности молекулярных мишеней, таким образом, инициируя альтернативный путь активации.

Очень мало известно о природе инициаторов активации альтернативного пути. Считается, что активаторы включают в себя дрожжевые клеточные стенки (зимозаны), множество чистых полисахаридов, кроличьи эритроциты, некоторые иммуноглобулины, вирусы, грибы, бактерии, животные опухолевые клетки, паразиты и поврежденные клетки. Единственной общей чертой у данных активаторов является наличие углевода, однако сложность строения и разнообразие углеводных структур представляют сложность в установлении общих молекулярных детерминант, которые распознаются в процессе активации.

Альтернативный путь активации может также предоставить мощный усиливающий контур для пектинового/классического пути активации конвертазы С3 (C4b2b) после того, как только любая синтезированная C3b начнет участвовать совместно с фактором В в формировании дополнительных конвертаз альтернативного пути С3 (C3bBb). Конвертаза альтернативного пути активации С3 стабилизируется связыванием с пропердином. Пропердин увеличивает период полураспада конвертазы альтернативного пути активации С3 в шести, десять раз. Добавление C3b к конвертазе С3 приводит к формированию С5 конвертазы альтернативного пути.

Считалось, что все три пути активации (т.е., классический, пектиновый и альтернативный) сходятся на С5, которая расщепляется для формирования продуктов с множественными провоцирующими воспаление эффектами. Конвергентный путь активации был отнесен к конечному пути активации комплемента. С5а является самым действенным анафилатоксином, индуцирующим изменения в гладкой мускулатуре и сосудистом тонусе, также как в проницаемости сосудов. Он также представляет собой эффективный хемотаксин и активатор как нейтрофилов, так и моноцитов. С5а-опосредованная клеточная активация может значительным образом усиливать воспалительные реакции путем индуцирования секреции множественных дополнительных воспалительных медиаторов, включая цитокины, гидролитические ферменты, метаболиты арахидоновой кислоты и активные формы кислорода. Расщепление С5 приводит к формированию C5b-9, также известного как мембраноатакующий комплекс (MAC). В настоящее время имеются веские доказательства того, что сублитическое отложение MAC может играть важную роль в воспалительном процессе в дополнение к роли литического пороформирующего комплекса.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Краткое изложение сущности изобретения приводится с целью представления в упрощенной форме выбора концепций, которые в дальнейшем описаны в разделе «Подробное описание». Настоящее краткое изложение не предназначено для идентификации ключевых признаков заявленного предмета изобретения, а также не предназначено для использования в качестве средства для определения объема заявленного предмета изобретения.

В одном своем аспекте настоящее изобретение предлагает способ ингибирования отрицательных эффектов при MASP-2-зависимой активации комплемента в живом организме. Способ включает в себя введение субъекту, который в этом нуждается, дозы агента, ингибирующего MASP-2, достаточной для эффективного подавления MASP-2-зависимой активации комплемента. В данном контексте, словосочетание «MASP-2-зависимая активация комплемента» относится к альтернативному пути активации комплемента, что происходит посредством пектин-зависимой системы MASP-2. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к агенту, ингибирующиму MASP-2, подавляющему активацию комплемента посредством пектин-зависимой системы MASP-2 без существенного ингибирования активации комплемента посредством классической или C1q-зависимой системы, таким образом, что dq-зависимая система остается функциональной.

В некоторых вариантах осуществления данных аспектов изобретения агент, ингибирующий MASP-2, представляет собой анти-MASP-2 антитело или его фрагмент.В следующих вариантах осуществления, анти-MASP-2 антитело обладает редуцированной эффекторной функцией. В некоторых вариантах осуществления, агент, ингибирующий MASP-2, представляет собой пептид, ингибирующий MASP-2, или непептидный ингибитор MASP-2.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает композиции для подавления отрицательных эффектов MASP-2-зависимой активации комплемента, содержащей терапевтически эффективную дозу агента, ингибирующего MASP-2, и фармацевтически приемлемый носитель. Также предлагаются способы для производства медикамента для использования с целью ингибирования отрицательных эффектов MASP-2-зависимой активации комплемента в живых субъектах, который в том нуждаются, включая комбинирование терапевтически эффективной дозы агента, ингибирующего MASP-2, и фармацевтического носителя. Также предлагаются способы производства лекарственных средств для использования с целью ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента при лечении каждого из состояний, заболеваний и расстройств, описанных ниже.

Способы, композиции и лекарственные средства по настоящему изобретению, используются для ингибирования отрицательных эффектов MASP-2-зависимой активации комплемента in vivo у объектов исследования, относящихся к млекопитающим, включая людей, страдающих острыми или хроническими патологическими состояниями или поражениями, как описано далее. Такие состояния и поражения включают в себя без ограничений MASP-2-опосредованную активацию комплемента в ассоциированных аутоиммунных расстройствах и/или воспалительных заболеваниях.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагаются способы ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у субъекта, страдающего нарушением свертывания крови или предрасположенного к нему, например, нарушением свертывания крови, опосредованным комплементом, или коагулопатией, путем введения терапевтически эффективной дозы агента, ингибирующего MASP-2, и фармацевтического носителя такому субъекту. Состояния, подлежащие лечению по настоящему изобретению, включают, путем примера, не имеющего ограничительного характера, диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС), также называемое коагулопатией потребления.

В одном аспекте изобретение предлагаются способы ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у субъекта, страдающего нарушением свертывания крови или предрасположенного к нему, путем введения субъекту дозы агента ингибирующего MASP-2, достаточной для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента.

В еще одном аспекте изобретение предлагаются способы ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента для лечения субъекта, страдающего нарушением свертывания крови или предрасположенного к нему, включая введение субъекту дозы агента, ингибирующего MASP-2, достаточной для выборочного ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента без существенного ингибирования C1q-зависимой активации комплемента.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагаются способы производства лекарственных средств для использования с целью ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у живого субъекта, страдающего нарушением свертывания крови, опосредованным комплементом, совмещающих терапевтически эффективную дозу агента, ингибирующего MASP-2, с фармацевтическим носителем.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагаются способы лечения, профилактики или снижения тяжести диссеминированного внутрисосудистого свертывания у нуждающегося субъекта, включающие введение субъекту композиции, включающей дозу агента, ингибирующего MASP-2, достаточной для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента.

ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Вышеупомянутые аспекты и множество сопутствующих преимуществ данного изобретения смогут быть быстрее оценены и станут более доступны для понимания путем ссылки на нижеследующее подробное описание, рассмотренное совместно с сопроводительными рисунками, как то:

ФИГУРА 1 представляет собой структурную схему, иллюстрирующую новое открытие того, что для активации комплемента посредством альтернативного пути требуется зависимая от пектинового пути MASP-2 активация;

ФИГУРА 2 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую геномную структуру MASP-2 человека;

ФИГУРА 3А представляет собой схематичную диаграмму, иллюстрирующую доменную структуру белка MASP-2 человека;

ФИГУРА 3В представляет собой схематичную диаграмму, иллюстрирующую доменную структуру белка М Ар 19 человека;

ФИГУРА 4 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую стратегию подавления гена MASP-2 у мыши;

ФИГУРА 5 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую минигенную конструкцию MASP-2 человека;

ФИГУРА 6А представляет результаты, демонстрирующие, что MASP-2-недостаточность ведет к потере опосредованной пектиновым путем С4 активации, что обусловлено отсутствием отложения C4b на маннане;

ФИГУРА 6В представляет результаты, демонстрирующие, что MASP-2-недостаточность ведет к потере опосредованной пектиновым путем С4 активации, что обусловлено отсутствием отложения C4b на зимозане;

ФИГУРА 6С представляет результаты, демонстрирующие относительные уровни С4 активации в образцах сыворотки, полученных из MASP-2+/-; MASP-2-/- и линий дикого типа, в результате отложения C4b на маннане и зимозане;

ФИГУРА 7А представляет результаты, демонстрирующие, что MASP-2-недостаточность ведет к потере опосредованной лектиновым путем и альтернативным путем С3 активации в результате отсутствия отложения C3b на маннане;

ФИГУРА 7В представляет результаты, демонстрирующие, что MASP-2-недостаточность ведет к потере опосредованной лектиновым путем и альтернативным путем С3 активации в результате отсутствия отложения C3b на зимозане;

ФИГУРА 8 представляет результаты, демонстрирующие, что добавление рекомбинантного мышиного MASP-2 к MASP-2-/- образцам сыворотки восстанавливает опосредованную лектиновым путем С4 активацию, величина которой находится в зависимости от концентрации белка, в результате отложения C4b на маннане;

ФИГУРА 9 представляет результаты, демонстрирующие, что классический путь активации функционирует у линий MASP-2-/-;

ФИГУРА 10 представляет результаты, демонстрирующие, что MASP-2-зависимая система активации комплемента активируется в фазе ишемии/реперфузии, сопровождаемой репарацией абдоминальной аневризмы аорты;

ФИГУРА 11А представляет результаты, демонстрирующие, что антитело №11 анти-MASP-2 Fab2 ингибирует формирование С3 конвертазы, как описано в Примере 24;

ФИГУРА 11В представляет результаты, демонстрирующие, что антитело №11 анти-MASP-2 Fab2 связывается с нативным MASP-2 крысы, как описано в Примере 24;

ФИГУРА 11С представляет результаты, демонстрирующие, что антитело №41 анти-MASP-2 Fab2 ингибирует расщепление С4, как описано в Примере 24;

ФИГУРА 12 представляет результаты, демонстрирующие, что все протестированные антитела анти-MASP-2 Fab2 подтвердили, что ингибирование формирования конвертазы С3 также явилось фундаментом для ингибирования расщепления С4, как описано в Примере 24;

ФИГУРА 13 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую использование рекомбинантных полипептидов, полученных из крысиного MASP-2, для картирования эпитопов анти-MASP-2 антител, блокирующих Fab2, как описано в Примере 25;

ФИГУРА 14 представляет результаты, демонстрирующие связывание антител анти-MASP-2 Fab2 №40 и №60 с полипептидами MASP-2 крысы, как описано в Примере 25;

ФИГУРА 15 представляет результаты, показывающие клиренс азота мочевины крови для «дикого» типа (+/+) и MASP-2(-/-) мыши через 24 и 48 часов после реперфузии в лабораторной модели ишемического реперфузионного повреждения почек, как описано в Примере 26;

ФИГУРА 16А представляет результаты, демонстрирующие масштабы инфаркта для «дикого» типа (+/+) и редуцированные масштабы инфаркта у MASP-2(-/-) мыши после повреждения в лабораторной модели с закупоркой коронарной артерии и реперфузии, как описано в Примере 27;

ФИГУРА 16В представляет результаты, демонстрирующие распределение единичных животных, использованных в лабораторной модели закупорки коронарной артерии и реперфузии, как описано в Примере 27;

ФИГУРА 17А представляет результаты, демонстрирующие исходные данные уровня белков VEGF в RPE-хориоидальном комплексе, выделенном из мышей «дикого» типа (+/+) и мышей MASP-2(-/-), как описано в Примере 28;

ФИГУРА 17В представляет результаты, демонстрирующие уровень белков VEGF в RPE-хориоидальном комплексе на третий день после нанесения поражения лазером на лабораторной модели дегенерации желтого пятна у мышей «дикого» типа (+/+) и MASP-2(-/-), как описано в Примере 28;

ФИГУРА 18 представляет результаты, демонстрирующие средние показатели уровня хориоидальной неоваскуляризации (CNV) на седьмой день после нанесения поражения лазером у мышей «дикого» типа (+/+) и мышей MASP-2(-/-), как описано в Примере 28;

ФИГУРА 19 представляет результаты, демонстрирующие средние показатели клинического артрита у мышей «дикого» типа (+/+) и мышей MASP-2(-/-) после моделирования у них Со12 mAb-индуцированного ревматоидного артрита, как описано в Примере 29;

ФИГУРА 20А представляет собой диаграмму, демонстрирующую направленное разрушение гена sMAP (Map 19), как описано в Примере 30;

ФИГУРА 20В представляет результаты Саузерн-блоттинга геномной ДНК, потомства от спаривания самца sMAP (-/-) химерной мыши и самки мыши линии C57BL/6, как описано в Примере 30;

ФИГУРА 20С представляет результаты генетический анализ методом PCR мышей «дикого» типа (+/+) и мышей sMAP (-/-), как описано в Примере 30;

ФИГУРА 21А представляет результаты Нозерн-блоттинга мРНК MAP и MASP-2 мышей sMAP (-/-), как описано в Примере 30;

ФИГУРА 21В представляет результаты количественного RT-PCR анализа кДНК, кодирующей Н-цепь MASP-2, L- цепь MASP-2 и sMAP, у мышей «дикого» типа (+/+) и мышей sMAP (-/-), как описано в Примере 30;

ФИГУРА 22А представляет иммуноблот sMAP(-/-), а именно МАр19(-/-), демонстрирующий отсутствие MASP-2 и sMAP в сыворотке мыши, как описано в Примере 30;

ФИГУРА 22В представляет результаты, демонстрирующие, что MASP-2 и sMAP были обнаружены в комплексе MBL-MASP-sMAP, как описано в Примере 30;

ФИГУРА 23А представляет результаты, демонстрирующие отложение С4 в покрытых маннаном лунках в сыворотке мышей «дикого» типа (+/+) и sMAP (-/-), как описано в Примере 30;

ФИГУРА 23В представляет результаты, демонстрирующие отложение С3 в покрытых маннаном лунках в сыворотки мышей «дикого» типа (+/+) и sMAP (-/-), как описано в Примере 30;

ФИГУРА 24А представляет результаты, демонстрирующие восстановление комплекса MBL-MASP-sMAP в сыворотке мышей sMAP (-/-), как описано в Примере 30;

ФИГУРА 24B-D представляет результаты, демонстрирующие конкурентное связывание rsMAP и MASP-2I с MBL, как описано в Примере 30;

ФИГУРА 25А-В представляет результаты, демонстрирующие восстановление активности отложения С4 при добавлении к MASP-2, но не rsMAP, как описано в Примере 30;

ФИГУРА 26А-В представляет результаты, демонстрирующие редукцию активности отложения С4 при добавлении rsMAP, как описано в Примере 30; и

ФИГУРА 27А-С представляет результаты, демонстрирующие, что MASP-2 отвечает за С4 активацию С3 по альтернативному пути, как описано в Примере 31.

ФИГУРЫ 28А и 28В представляют кривую зависимости от дозы для ингибирования отложения C4b (ФИГ.28В) и ингибирование активации тромбином после введения антитела MASP-2 Fab2 в нормальную крысиную сыворотку, как описано в Примере 32;

ФИГУРЫ 29А и 29В представляют измеренную агрегацию тромбоцитов (выраженную в области агрегации) у мышей MASP-2(-/-) (ФИГ.29В) по сравнению с агрегацией тромбоцитов у необработанных мышей «дикого» типа, у которых путь активации комплемента ингибирован фактором яда кобры (CVF) кровопускательного средства, и терминального ингибитора пути активации (антагониста C5aR) (ФИГУРА 29А) у локализованной модели реакции Шварцмана диссеминированного внутрисосудистого свертывания, как описано в Примере 33;

ФИГУРЫ 30А-30С иллюстрируют результаты исследования оборота С3 в плазме С4-/- в анализах, характерных для пути активации либо классического, либо пектинового путей;

ФИГУРА 31А графически иллюстрирует среднюю площадь, подверженную риску (AAR), и объемы инфаркта (INF) в процентах от общих объемов миокарда у мышей дикого типа (+/+) и MASP-2(-/-) после проведения окклюзии и реперфузии левой передней нисходящей артерии, как описано в Примере 34;

ФИГУРА 31В графически иллюстрирует отношение между объемом инфаркта (INF), построенного по средней площади, подверженной риску (MR), в процентах от объема миокарда левого желудочка у мышей дикого типа (+/+) и MASP-2(-/-) после проведения закупорки и реперфузии артерии, как описано в Примере 34;

ФИГУРА 31С графически иллюстрирует объем инфаркта (INF) в сердцах мышей дикого типа (+/+) и MASP-2(-/-), залитых буферным раствором, и подготовленных в соответствии с моделью перфузии изолированного сердца мыши по Лангендорфу, в которой общая ишемия и реперфузия проводились в отсутствии сыворотки, как описано в Примере 34;

ФИГУРА 31D графически иллюстрирует отношение между объемом инфаркта (INF) и зоной риска в сердцах мышей дикого типа (+/+) и MASP-2(-/-), залитых буферным раствором, и подготовленных в соответствии с моделью перфузии изолированного сердца мыши по Лангендорфу, как описано в Примере 34;

ФИГУРА 32 графически иллюстрирует уровни азота мочевины крови (BUN), измеренных либо у мышей дикого типа (+/+) (В6) или MASP-2(-/-), реципиентов почек от мышей-доноров дикого типа (+/+), как описано в Примере 35;

ФИГУРА 33 графически иллюстрирует процент выживаемости мышей дикого типа (+/+) и MASP-2(-/-) в зависимости от количества дней после микробной инфекции в модели лигирования и пункции слепой кишки (CLP), как описано в Примере 36;

ФИГУРА 34 графически иллюстрирует количество бактерий, измеренное у мышей дикого типа (+/+) и MASP-2(-/-) после микробной инфекции в модели лигирования и пункции слепой кишки (CLP), как описано в Примере 36;

ФИГУРА 35 представляет собой график Каплана-Мейера, иллюстрирующий процент выживаемости мышей дикого типа (+/+), MASP-2(-/-) и С3 (-/-) через шесть дней после контрольного заражения путем интраназального введения синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa}, как описано в Примере 37;

ФИГУРА 36 графиче