Способы и система для ферментативного синтеза сложных алкилэфиров жирных кислот

Способы и система для ферментативного синтеза сложных алкилэфиров жирных кислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Раскрыт ферментативный способ получения сложных алкилэфиров жирных кислот для применения в областях производства биотоплива, продуктов питания и детергентов. В этом способе источник жирных кислот и спирт или донор спирта вводят в реакцию в присутствии ферментов, иммобилизированных на гидрофобной смоле, в присутствии щелочного водного буфера или воды. Раскрытый способ можно осуществлять как порционно, так и непрерывно, применяя поточные колоночные реакторы с мешалкой или уплотненным слоем.

Уровень техники

Иммобилизация ферментов была описана в огромном количестве методов, в основном направленных на уменьшение доли затрат, связанных с ферментами, в общем ферментативном способе; облегчение выделения ферментов из продуктов; и обеспечение непрерывного режима способа.

Методы иммобилизации в основном подразделяются в соответствии со следующим:

1. Физическая адсорбция ферментов на твердые подложки, такие как диоксид кремния или нерастворимые полимеры.

2. Адсорбция на ионообменных смолах.

3. Ковалентное взаимодействие ферментов с материалом твердых подложек, таких как неорганические или полимерные эпоксидные подложки.

4. Захват ферментов в растущем полимере.

5. Локализация ферментов в мембранном реакторе или в полупроницаемом геле.

6. Ферментные кристаллы (CLECS) или агрегаты (CLEAS), образованные при помощи поперечных межмолекулярных связей.

Все вышеупомянутые процедуры иммобилизации ферментов состоят из следующих этапов:

1. Растворение фермента в подходящей буферной системе, что касается рН, температуры, типа буферных солей и ионной силы.

2. Добавление твердой подложки в ферментный раствор и перемешивание в течение некоторого времени до тех пор, пока молекулы фермента не иммобилизируются на твердой подложке.

3. Фильтрация с твердой подложки, которая содержит иммобилизированный фермент.

4. Промывка подложки подходящим буфером для удаления слабосвязанных молекул фермента и затем высушивание твердой подложки.

Поверхностные ферменты, в основном липазы, были иммобилизированы посредством вышеупомянутых методов. Эти предложенные препараты иммобилизированных ферментов обладают низкой синтетической активностью и коротким периодом полураспада при эксплуатации. В попытке повысить синтетическую активность и стабильность иммобилизированных липаз и других поверхностных ферментов были применены различные способы. Эти способы включают:

1. Связывание поверхностных функциональных групп ферментов с гидрофобными остатками, такими как жирные кислоты или полиэтиленгликоль.

2. Покрытие поверхности ферментов поверхностно-активными веществами, такими как сложные полиолэфиры жирных кислот.

3. Приведение ферментов в контакт с гидрофобными подложками, обычно полипропиленовыми, которые были предварительно обработаны гидрофильными растворителями, такими как этанол или изопропанол.

Ни один из вышеуказанных способов не давал удовлетворительных результатов в отношении стабилизации и экономической эффективности иммобилизированных поверхностных ферментов для того, чтобы осуществить обратное ферментативное превращение в промышленных масштабах. Также, сообщалось, что большинство ферментов, иммобилизированных в соответствии с вышеупомянутыми процедурами, либо теряют значительную часть синтетической активности, либо не проявляют своей полной активности вследствие определенных ограничений, связанных с процедурой иммобилизации, или вследствие присутствия определенных ингибиторов ферментов в реакционной среде.

Еще одним значительным недостатком липаз и фосфолипаз является их низкая устойчивость к гидрофильным субстратам, в частности к спиртам с короткими цепочками и жирным кислотам с короткими цепочками (до С4). Во многих научных исследованиях было обнаружено, что спирты с короткими цепочками и жирные кислоты с короткими цепочками, как например, метанол и уксусная кислота, соответственно, ответственны за отщепление присущих им молекул воды от четвертичной структуры этих ферментов, что приводит к их денатурации и последующей утрате их каталитической активности. Этот недостаток препятствовал применению липаз для получения промышленных количеств сложных метилэфиров жирных кислот «биодизель» с применением триглицеридов масел и метанола в качестве субстратов.

Дополнительным недостатком применения иммобилизированных липаз для переэтерификации/этерификации источника жирных кислот со свободным спиртом является накопление образовавшихся побочных - продуктов глицерина и воды на биокатализаторе и, вследствие этого, препятствие свободному доступу субстратов к активному центру иммобилизированного фермента. Такие биокатализаторы в основном утрачивают свои каталитические свойства после нескольких циклов при применении одинаковой порции биокатализатора.

Современные изобретатели разработали особые препараты иммобилизированных ферментов, обладающие хорошей стабильностью на протяжении многих производственных циклов с сохранением активности. Примеры таких ферментных препаратов раскрываются в том числе в WO/2008/084470, WO/2008/139455 и WO2009/069116.

Условия, при которых осуществляется каталитическая реакция, могут отрицательно влиять на стабильность и эффективность препаратов иммобилизированных ферментов. Важно иметь ферментные препараты, которые сохраняют стабильность и активность в реакционных условиях.

Эти и другие объекты настоящего изобретения станут очевидными из следующего далее описания.

Раскрытие изобретения

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу переэтерификации/этерификации источника жирных кислот со спиртом с образованием сложных алкилэфиров жирных кислот, который включает введение в реакцию источника жирных кислот и спирта или донора спирта в присутствии препарата иммобилизированной липазы, где препарат иммобилизированной липазы включает в себя по меньшей мере одну липазу, иммобилизированную на гидрофобной пористой подложке, и реакционная среда содержит водный щелочной буферный раствор.

Указанный водный щелочной буферный раствор может быть водным слабощелочным буферным раствором. Указанный водный щелочной буферный раствор может содержаться в реакционной среде в количестве до 5 вес.% источника жирных кислот.Водный щелочной буферный раствор может иметь рН от 7 до приблизительно 11, например любой из: 7-8,5, 7-9, 7-9,5, 7-10 и 7-11. pKa добавленного слабощелочного реагента, входящих в состав буферного раствора, выше или равно pKa кислот, включая источник жирных кислот.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу переэтерификации/этерификации источника жирных кислот со спиртом с образованием сложных алкилэфиров жирных кислот, который включает введение в реакцию источника жирных кислот и спирта в присутствии препарата иммобилизированной липазы, где препарат иммобилизированной липазы содержит по меньшей мере одну липазу, иммобилизированную на гидрофобной пористой положке, а реакционная среда содержит воду. Вода находится в форме водного раствора с рН от 3 до 11. Реакционная среда может содержать воду или водный раствор в количестве до 5 вес.% источника жирных кислот.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения спирт может быть спиртом с короткой цепью, например C₁-С₆ алкиловым спиртом, точнее говоря, C₁-C₄ алкиловым спиртом, в частности метанолом или этанолом. Если указанным спиртом является метанол, то указанными полученными сложными эфирами жирных кислот являются сложные метилэфиры жирных кислот (FAME - биодизель). Спирт также может быть жирным спиртом с цепью средней длины (С₆-С₁₀) или жирными спиртами с длинными цепями (C₁₂-C₂₂). Донор спирта может быть сложным моноалкилэфиром или диалкилкарбонатом, таким как диметилкарбонат или диэтилкарбонат.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения указанная иммобилизированная липаза способна катализировать этерификацию свободных жирных кислот, с образованием сложных алкилэфиров жирных кислот и воды в качестве побочного продукта, и переэтерификацию триглицеридов и частичных глицеридов, с образованием сложных алкилэфиров жирных кислот и глицерина в качестве побочного продукта.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения, связанных с применением щелочного буфера или щелочного раствора, количество указанного щелочного буфера или раствора в реакционной среде составляет от 0,001 до 5 вес.% источника жирных кислот.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения указанная по меньшей мере одна липаза может быть липазой, полученной из любого из Rhizomucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus niveus, Mucor javanicus, Rhizopus oryzae, Aspergillus niger, Penicillium camembertii, Alcaligenes sp., Acromobacter sp., Burkholderia sp., Thermomyces lanuginosa, Chromobacterium viscosum, Candida antarctica B, Candida rugosa, Candida antarctica А, семян папайи и панкреатина. Препарат липазы может включать по меньшей мере две липазы, которые могут быть каждая отдельно иммобилизированная на гидрофобной подложке или совместно иммобилизированными на одной и той же гидрофобной подложке. Указанные липазы могут обладать идентичной или различной региоспецифичностью. Указанные липазы способны одновременно или последовательно катализировать этерификацию свободных жирных кислот, с образованием сложных алкилэфиров жирных кислот и воды в качестве побочного продукта, и переэтерификацию триглицеридов и частичных глицеридов, с образованием сложных алкилэфиров жирных кислот и глицерина в качестве побочного продукта.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения указанной подложкой может быть любая из подложки на основе гидрофобного алифатического полимера и подложки на основе гидрофобного ароматического полимера. Указанная гидрофобная полимерная подложка может состоять их линейных или разветвленных органических цепей. Указанная подложка может включать макросетчатые органические полимерные или сополимерные цепи. Указанная подложка может быть пористой или непористой неорганической подложкой, которая может быть гидрофобной или покрытой гидрофобным органическим материалом. Указанный органический материал может быть линейной, разветвленной или функционализированной гидрофобной органической цепью.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения, если применяют щелочной буферный раствор, то указанный водный щелочной буферный раствор может быть раствором неорганической щелочной соли или органического основания. Указанный щелочной буферный раствор может быть раствором любого из гидроксида, карбоната, бикарбоната, фосфата, сульфата, ацетата и цитрата щелочных металлов, первичного, вторичного и третичного амина, и любых их смесей. В особых вариантах осуществления указанный щелочной буферный раствор может быть раствором слабого основания, выбранного из бикарбонатов и карбонатов натрия или калия. В некоторых особых вариантах осуществления способа настоящего изобретения указанный щелочной буферный раствор может быть добавлен к указанному источнику жирных кислот на стадии, предшествующей смешиванию, или непосредственно в реакционную среду.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения, если применяют щелочной буферный раствор, содержание указанного щелочного буферного раствора в переэтерификационной/этерификационной реакционной среде может быть в диапазоне 0,001-5 вес.% от масляного сырья, например, 1-2 вес.% от масляного сырья.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сначала источник жирных кислот можно смешать со щелочным буферным раствором или с водой или водным раствором, и затем смесь можно обработать указанным препаратом иммобилизированной липазы с последующим добавлением указанного спирта и обеспечения протекания реакции в подходящих условиях до тех пор, пока источник жирных кислот не превратится в сложные эфиры жирных кислот.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения указанным источником жирных кислот может быть любое из растительного масла, животного жира, масла водорослей, рыбьего жира, отработанного масла и любых их смесей. Указанный источник жирных кислот может включать свободные жирные кислоты, моно-, ди- или триглицериды, их смеси в любых соотношениях, в присутствии или отсутствии других минорных производных жирных кислот, таких как фосфолипиды и сложные эфиры стеринов. Источник жирных кислот может быть неочищенным, очищенным, обесцвеченным, дезодорированным или любым из их комбинаций.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения реакцию можно осуществлять при температуре от 10°С до 100°С, в особенности при 25-30°С.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения указанный источник жирных кислот может быть предварительно смешан с указанным спиртом или донором спирта и с указанной водой или буферным раствором в предреакционном сосуде для приготовления с образованием эмульсии, которая может быть затем подана совместно с указанным препаратом иммобилизированной липазы в реакционный сосуд для переэтерификации/этерификации.

Во всех вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения указанную иммобилизированную липазу можно применять в колоночных реакторах с уплотненным слоем, работающих в порционном или непрерывном режиме.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечивается система для переэтерификации/этерификации жирных кислот со спиртом с образованием сложных алкилэфиров жирных кислот, включающая:

реакционный сосуд, сконфигурированный для прохождения реакции в реакционной среде, содержащей жирную кислоту и по меньшей мере один из спирта и донора спирта, в присутствии препарата иммобилизированной липазы, где препарат иммобилизированной липазы включает по меньшей мере одну липазу, иммобилизированную на гидрофобной пористой подложке, и реакционная среда содержит по меньшей мере одно из водного щелочного буферного раствора и воды.

Система может включать один или несколько из следующих признаков в любой желаемой комбинации или перестановке:

А. Реакционный сосуд может включать препарат иммобилизированной липазы, по меньшей мере во время работы указанной системы для получения указанных сложных алкилэфиров жирных кислот.

В. Дополнительно или в качестве альтернативы признаку А реакционный сосуд может содержать жирную кислоту и по меньшей мере один из спирта и донора спирта, по меньшей мере во время работы указанной системы для получения указанных сложных алкилэфиров жирных кислот.

С.Дополнительно или в качестве альтернативы признакам А или В указанная реакционная среда включает смесь, причем указанная система дополнительно включает предреакционный сосуд в избирательном жидкостном взаимодействии с указанным реакционным сосудом, причем указанный предреакционный сосуд сконфигурирован для предварительного смешивания по меньшей мере жирной кислоты и по меньшей мере одного из спирта и донора спирта с образованием указанной смеси, и для избирательной подачи указанной смеси в указанный реакционный сосуд по меньшей мере во время работы указанной системы для получения указанных сложных алкилэфиров жирных кислот. Система может факультативно дополнительно включать источник жирной кислоты в избирательном жидкостном взаимодействии с указанным предреакционным сосудом и сконфигурирована для избирательной подачи жирной кислоты в указанный предреакционный сосуд по меньшей мере во время указанной работы указанной системы, и источник спирта в избирательном жидкостном взаимодействии с указанным предреакционным сосудом и сконфигурирована для избирательной подачи по меньшей мере одного из спирта и донора спирта в указанный предреакционный сосуд по меньшей мере во время указанной работы указанной системы. Система может факультативно дополнительно включать источник буфера в избирательном жидкостном взаимодействии с указанным предреакционным сосудом и сконфигурирована для избирательной подачи по меньшей мере одного из водного щелочного буферного раствора и воды в указанный предреакционный сосуд с включением в указанную смесь по меньшей мере во время указанной работы указанной системы.

D. Дополнительно или в качестве альтернативы признакам А-С система может быть сконфигурирована для избирательной подачи одного или нескольких из жирной кислоты, и/или по меньшей мере одного из спирта и донора спирта, и/или по меньшей мере одного из водного щелочного буферного раствора и воды в указанный предреакционный сосуд, каждый непрерывным образом или отдельными порциями, по меньшей мере во время указанной работы указанной системы.

Е. Дополнительно или в качестве альтернативы признакам A-D предреакционный сосуд может быть сконфигурирован для избирательной подачи указанной смеси в указанный реакционный сосуд непрерывным образом или отдельными порциями, по меньшей мере во время указанной работы указанной системы.

F. Дополнительно или в качестве альтернативы признакам А-Е система может быть сконфигурирована для избирательной и непосредственной подачи в указанный реакционный сосуд по меньшей мере одной из жирной кислоты; по меньшей мере одного из спирта и донора спирта; и по меньшей мере одного из водного щелочного буферного раствора и воды.

G. Дополнительно или в качестве альтернативы признакам A-F реакционный сосуд может включать систему терморегулирования, сконфигурированную для поддержания реакционной среды в указанном реакционном сосуде в выбранном диапазоне температур.

Н. Дополнительно или в качестве альтернативы признакам A-G система может факультативно включать удерживающее устройство, сконфигурированное для удержания препарата иммобилизированной липазы внутри указанного реакционного сосуда по меньшей мере во время работы указанной системы.

I. Дополнительно или в качестве альтернативы признакам А-Н система дополнительно включает сосуд для отделения продуктов в избирательном жидкостном взаимодействии с указанным реакционным сосудом, причем указанная система сконфигурирована для избирательной подачи реакционной смеси, включающей продукты реакции, из указанного реакционного сосуда в указанный сосуд для отделения продуктов, и где указанный сосуд для отделения продуктов сконфигурирован для избирательного отделения выхода сложных алкилэфиров жирных кислот из поступающей в него реакционной смеси. Например, сосуд для отделения продуктов может быть сосудом из системы центрифужного и гравитационного отделения.

J. Дополнительно или в качестве альтернативы признакам A-I реакционный сосуд сконфигурирован для избирательной подачи указанной реакционной смеси в указанный сосуд для отделения продуктов непрерывным образом и/или отдельными порциями во время указанной работы указанной системы.

К. Дополнительно или в качестве альтернативы признакам I-J система сконфигурирована для избирательной подачи указанного выхода сложных алкилэфиров жирных кислот из указанного сосуда для отделения продуктов. Например, система сконфигурирована для избирательной подачи указанного выхода сложных алкилэфиров жирных кислот из указанного сосуда для отделения продуктов непрерывным образом и/или отдельными порциями.

L. Дополнительно или в качестве альтернативы признакам А-К система сконфигурирована для повышения указанного выхода сложных алкилэфиров жирных кислот из реакционной смеси, подаваемой в указанный сосуд для отделения продуктов. В одной конфигурации системы, имеющей данный признак, система сконфигурирована для избирательного перенаправления указанного выхода сложных алкилэфиров жирных кислот в указанный реакционный сосуд для дополнительного повышения указанного выхода сложных алкилэфиров жирных кислот из реакционной смеси, впоследствии подаваемой в указанный сосуд для отделения продуктов. В другой конфигурации системы, имеющей данный признак, система сконфигурирована для избирательного перенаправления указанного выхода сложных алкилэфиров жирных кислот во вспомогательный реакторный модуль, где указанный вспомогательный реакторный модуль включает вспомогательный реакторный сосуд и вспомогательный сосуд для отделения продуктов, где указанный дополнительно повышенный выход сложных алкилэфиров жирных кислот позже избирательно подают через указанный вспомогательный сосуд для отделения продуктов.

Краткое описание фигур

Для того, чтобы понять настоящее изобретение и увидеть как оно может быть осуществлено на практике, далее будут описаны варианты осуществления посредством неограничивающих примеров со ссылкой на сопроводительные графические материалы, в которых:

Фигура 1: Переэтерификационная активность липазы Thermomyces lanuginosa (TL), иммобилизированной на Amberlite XAD 1600 (Amb. XAD 1600) в качестве гидрофобной смолы и на Duolite D568 (Duo D568) в качестве гидрофильной смолы, и липазы Pseudomonas sp. (PS), иммобилизированной на Sepabeads SP70 (SB SP70) в качестве гидрофобной смолы на пористом диоксиде кремния (Sil.) в качестве гидрофильной смолы.

Сокращения: Превр. - превращение. Цикл. - цикл.

Фигура 2: Превращение соевого масла в биодизель и глицерин через 6 часов реакции при различных уровнях 0,1 М раствора бикарбоната натрия с применением одинаковой порции биокатализатора в многократных периодических экспериментах. Биокатализатором была липаза, полученная из Thermomyces lanuginosa, иммобилизированная на гидрофобной и пористой смоле на основе полистирола и дивинилбензола.

Сокращения: Превр. - превращение; Цикл. - цикл.

Фигура 3: Превращение соевого масла в биодизель и глицерин через 6 часов реакции при различных уровнях 0,1 М раствора бикарбоната натрия при применении одинаковой порции биокатализатора в многократных периодических экспериментах. Биокатализатором была липаза, полученная из Pseudomonas sp., иммобилизированная на гидрофобной и пористой смоле на основе полистирола и дивинилбензола.

Сокращения: Превр. - превращение; Цикл. - цикл.

Фигура 4: Превращение соевого масла в биодизель и глицерин через 6 часов реакции без воды и при различных уровнях воды с применением одинаковой порции биокатализатора в многократных периодических экспериментах. Биокатализатором была липаза, полученная из Thermomyces lanuginosa, иммобилизированная на гидрофобной и пористой смоле на основе полистирола и дивинилбензола.

Сокращения: Превр. - превращение; Цикл. - цикл; DW - дистиллированная вода.

Фигура 5: Превращение соевого масла в биодизель и глицерин через 6 часов реакции при различных уровнях воды с применением одинаковой порции биокатализатора в многократных периодических экспериментах. Биокатализатором была липаза, полученная из Pseudomonas sp., иммобилизированная на гидрофобной и пористой смоле на основе полистирола и дивинилбензола.

Сокращения: Превр. - превращение; Цикл. - цикл; DW - дистиллированная вода.

Фигура 6: Превращение смеси FFA (свободных жирных кислот) и соевого масла в биодизель и глицерин и побочные водные продукты после 4 часов этерификации/переэтерификации при различных уровнях 0,1 М раствора бикарбоната натрия с применением одинаковой порции биокатализатора в многократных периодических экспериментах. Биокатализатором была липаза, полученная из Pseudomonas sp., иммобилизированная на гидрофобной и пористой смоле на основе полистирола и дивинилбензола.

Сокращения: Превр. - превращение; Цикл. - цикл; DW - дистиллированная вода.

Фигура 7: Этерификация гидролизата соевого масла в биодизель и воду через 4 часа реакции в присутствии 2% 0,1 М раствора бикарбоната натрия с применением одинаковой порции биокатализатора в многократных периодических экспериментах. Биокатализатором была липаза, полученная из Pseudomonas sp., иммобилизированная на гидрофобной и пористой смоле на основе полистирола и дивинилбензола.

Сокращения: Кисл. Числ. - кислотное число; Цикл. - цикл

Фигура 8: Переэтерификация рыбьего жира с этанолом через 6 часов реакции в присутствии 1 вес.% 0,1 М раствора бикарбоната натрия с применением одинаковой порции биокатализатора в многократных периодических экспериментах. Биокатализаторами были липазы, полученные из Thermomyces lanuginosa (TL Lip.) и Pseudomonas sp. (PS Lip.), иммобилизированные на Amberlite XAD 1600.

Сокращения: Превр. - превращение; Цикл. - цикл.

Фигура 9: Переэтерификация животного жира с этанолом через 6 часов реакции в присутствии 2 вес.% 0,1 М раствора бикарбоната натрия с применением одинаковой порции биокатализатора в многократных периодических экспериментах. Биокатализаторами были липазы Thermomyces lanuginosa, Pseudomonas sp. (PS Lip.; TL Lip.), иммобилизированные на Amberlite XAD 1600.

Сокращения: Превр. - превращение; Цикл. - цикл.

Фигура 10: Обработка реакционной среды переэтерификации/этерификации, полученной после 4 часов и имеющей кислотное число FFA 7 мг КОН/1 г, с применением Pseudomonas sp. или Thermomyces lanuginosa, иммобилизированных на гидрофобных пористых смолах, с Candida antarctica, иммобилизированной на гидрофобной пористой смоле.

Сокращения: Кисл. Числ. - кислотное число; Цикл. - цикл.

Фиг.11: схематически иллюстрирует первый вариант осуществления системы для получения сложных алкилэфиров жирных кислот в соответствии с аспектом настоящего изобретения.

Фиг.12 схематически иллюстрирует второй вариант осуществления системы для получения сложных алкилэфиров жирных кислот в соответствии с аспектом настоящего изобретения.

Осуществление изобретения

В исследованиях по улучшению ферментативно катализируемых производственных процессов, в частности, способов переэтерификации/этерификации источника жирных кислот со спиртом в присутствии иммобилизированной(иммобилизированных) липазы(липаз), современные изобретатели разработали особые условия, при которых стабильность иммобилизированной(иммобилизированных) липазы(липаз) сохраняется на протяжении многих циклов производства.

В варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу получения сложных алкилэфиров жирных кислот, а именно сложных алкилэфиров жирных кислот с короткими цепочками, таких как сложные метиловые и этиловые эфиры жирных кислот (биодизель), в щелочной микроводной системе без растворителей. В особых вариантах осуществления, щелочная микроводная система является слабощелочной микроводной системой. Способ включает обеспечение источника жирных кислот и введение его в реакцию со свободным спиртом или донором спирта в присутствии препарата иммобилизированной липазы в указанных щелочных или слабощелочных условиях. Не ограничиваясь теорией, предварительная обработка источника жирных кислот щелочным буферным раствором приведет к нейтрализации кислот, что может иметь ингибирующий эффект на фермент. Количество спирта, необходимое для завершения реакции до 100% превращения, может быть добавлено поэтапно или за одну порцию. Дополнительно, спирт может быть спиртом с короткой цепочкой, например метанолом или этанолом. Можно применять другие доноры спирта в реакции с источником жирных кислот в присутствии гидролазы, и позволяя реакции протекать в подходящих условиях до тех пор, пока указанный источник жирных кислот не превратится в сложные алкилэфиры жирных кислот, а именно в сложные метиловые эфиры жирных кислот (FAME) или сложные этиловые эфиры жирных кислот, где указанный препарат гидролазы содержит одну или несколько липаз, раздельно или совместно иммобилизированных на подходящей подложке на основе пористого макросетчатого гидрофобного полимера.

В дополнительном варианте осуществления реакция переэтерификации/этерификации между источником жирной кислоты и спиртом или донором спирта осуществляют в водной микросреде с добавлением воды в реакционную смесь. В особых вариантах осуществления вода может быть добавлена в количестве 0,0001-5 вес.% от источника жирных кислот. Под водой, используемой здесь, подразумевается чистая или дистиллированная вода, а также «водные растворы», которые могут быть, но без ограничений, водопроводной водой, морской водой или водой из любого другого естественного водного источника или резервуара, опресненной водой, химически или ферментативно очищенной или обработанной водой и любыми иными водными растворами. рН реакционной системы или водного раствора может варьировать и может быть, например, приблизительно 3-11, например 4-10, 5-10, 5-9, 6-10, 6-9 или 7-9.

Способ настоящего изобретения можно осуществлять до тех пор, пока из реакционной смеси постоянно удаляется образующийся глицерин и любая излишняя вода. Превращение ацильных групп жирных кислот или свободных жирных кислот, содержащихся в указанном источнике жирных кислот, в сложные алкилэфиры, а именно сложные метилэфиры, жирных кислот может быть проконтролировано в различные моменты времени в течение реакции. Реакционную среду можно удалить при помощи подходящих средств в любой желаемый момент времени в течение реакции, таким образом останавливая реакцию, и из реакционной среды выделяют образовавшиеся сложные метилэфиры жирных кислот и, факультативно, образовавшийся глицерин. Реакция, в частности, может быть остановлена, когда превращение ацильных групп жирных кислот или свободных жирных кислот, содержащихся в указанном источнике жирных кислот, в сложные метилэфиры жирных кислот достигнет по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90%.

Реакционная система может быть аналогичной описанной в одновременно находящемся на рассмотрении документе WO 2009/069116. Например, в производственной системе можно применять реактор с мешалкой с фильтром из спеченного стекла или нержавеющей стали в нижней части, который удерживает биокатализатор в реакторе, однако позволяет реакционной среде проходить сквозь реактор. Такая конфигурация реактора позволяет побочным продуктам, конкретно глицерину и воде, которые самодесорбируются из иммобилизированного фермента, оседать ко дну реактора и проходить сквозь фильтр. Результатом является непрерывное удаление десорбированного образованного глицерина, а также избытка воды из реакционной среды, что приводит к сдвигу реакции в направлении к синтезу, тем самым достигая превращений выше 98%. Биокатализатор, применяемый в этом реакторе, может быть составлен из одного или многих типов липаз, принимая во внимание их позиционную специфику, а также их происхождение, как описано в данном документе. В другом случае можно применять два последовательных реактора с мешалками с фильтром в нижней части. Между двумя реакторами можно применять отстойный резервуар или центрифугу. Первый реактор может содержать иммобилизированный биокатализатор, состоящий из одного или многих типов липаз. Роль отстойного резервуара или центрифуги между обоими реакторами заключается в удалении образованного глицерина и избытка воды из реакционной среды, что приводит к повышению превращения сырья в его соответствующие сложные алкилэфиры жирных кислот до более 98% во втором реакторе за приемлемое время реакции. Некоторые конкретные системы и способы реакции описаны ниже.

Выражения «реакционная смесь», «реакционная система» и «реакционная среда» могут применяться в данном документе как синонимы.

Применение липаз, иммобилизированных на гидрофобных смолах, в присутствии щелочного буферного раствора или воды, как в вариантах осуществления способа настоящего изобретения, обеспечивает высокую стабильность фермента, а также избежание накопления гидрофильных веществ, как например вода и образованный как побочный продукт глицерин, на биокатализаторе. В конкретных вариантах осуществления способа настоящего изобретения применяют 0,001-5% щелочной или слабощелочной буферный раствор, например, 0,01-5%, 0,05-5%, 0,1-5%, 0,5-5%, как например 0,001%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 0,75%, 1%. 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5% или 5%. В конкретных вариантах осуществления способа настоящего изобретения, где применяют воду, воду применяют на уровнях 0,0001-5% воды, например 0,001-5%, 0,01-5%, 0,05-5%, 0,1-5%, 0,5-5%, как например 0,0001%, 0,001%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 0,75%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5% или 5%. Как упоминалось, если применяют щелочной раствор, он может нейтрализовать кислоты, как правило, присутствующие в источнике жирных кислот или производятся в результате побочных реакций. Непрерывное активное удаление этих побочных продуктов может даже повысить эффективность данного способа. Выделенный глицерин можно применять в промышленности.

Источник жирных кислот, применяемый в способе изобретения, может включать по меньшей мере одно из соевого масла, канолового масла, масла водорослей, рапсового масла, оливкового масла, касторового масла, пальмового масла, подсолнечного масла, арахисового масла, хлопкового масла, ятрофного масла, нерафинированного кукурузного масла, рыбьего жира, жира животных, отработанного кулинарного жира, темного жира, масляных триглицеридов, полученных из несъедобных растительных источников, неполных глицеридов и свободных жирных кислот, полученных из этих жиров, или любой смеси по меньшей мере двух указанных веществ в любой желаемой пропорции.

Во всех способах изобретения сложные алкилэфиры жирных кислот с короткой цепью, образованные реакцией, представляют собой, в особенности, сложные метиловые, этиловые, изопропиловые или бутиловые эфиры жирных кислот (биодизель). Другие жирные спирты со средней цепью (С₆-С₁₀) и жирные спирты с длинной цепью (С₁₂-C₂₂) также можно применять в способе получения по данному изобретению. Эти более длинные спирты могут быть в особенности подходящими при получении различных видов воска, например, для косметических изделий.

Липазы могут быть липазами, полученными из Thermomyces lanuginosa, Rhizomucor miehei, Mucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus sp., Mucor javanicus, Penicillium roqueforti, Aspergillus niger, Chromobacterium viscosum, Acromobacter sp., Burkholderia sp., Candida antarctica A, Candida antarctica B, Candida rugosa, Alcaligenes sp., Penicillium camembertii, семян папайи и панкреатина, но не ограничиваются этим.

Липазы могут быть совместно иммобилизированными на подходящей подложке, в особенности подложке на основе гидрофобного алифатического полимера или подложке на основе гидрофобного ароматического полимера. Каждая из указанных липаз может быть иммобилизирована на подходящей подложке, где подложки, на которых иммобилизированы указанные липазы, являются идентичными или различными. Используемые липазы могут быть региоспецифичными для их подложки или случайными. При применении более одной липазы, липазы можно иммобилизировать на одной или на различных гидрофобных подложках. Липазы, совместно иммобилизируемые на одной подложке, могут демонстрировать идентичные или различные субстратные избирательности или региоспецифичности для их подложек.

Липазы могут быть региоспецифичными (или сайт-специфичными), каждая применяемая отдельно или в комбинации с липазами одной или другой сайт-специфичности. Обращаясь к положениям sn-1, sn-2- или sn-3, это положения на глицериновом скелете различных глицеридов. Таким образом, липазы, применяемые в способе настоящего изобретения, могут обладать избирательностью к положению sn-2 больше, чем избирательность случайных липаз, т.е. они способствуют катализу реакции между спиртом или донором спирта с жирной ацильной группой положения sn-2, тогда как случайная липаза демонстрирует ту же переэтерификационную активность в отношении жирных ацильных групп во всех трех положениях на глицериновом скелете. Некоторые липазы единственно демонстрируют позиционную активность на положение sn-2, особенно при конкретных условиях, определяемых субстратами, продуктами и т.п. Другие липазы, применяемые в способе настоящего изобретения, являются специфичными к положению sn-1,3. Их можно применять отдельно или вместе со случайной липазой, в особенности липазой, которая обладает сродством к неполным глицеридам, и необязательно с третьей липазой с высоким сродством к положению sn-2.

Подложка является, в частности, пористой и макросетчатой гидрофобной подложкой, которая может быть органической или неорганической. Примерами подложек являются пористые неорганические подложки, такие как, без ограничения, гидрофобизированные подложки на основе кремния или окиси алюминия, и гидрофобные орган