Антитела рецептора 1 интерферона альфа и их применение

Антитела рецептора 1 интерферона альфа и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 60/581747, поданной 21 июня 2004 г; содержание которой включено в настоящую заявку в качестве ссылки в полном объеме.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интерфероны (IFN) типа I (IFN-α, IFN-β, IFN-ω, IFN-τ) представляют собой семейство структурно родственных цитокинов, обладающих противовирусными, противоопухолевыми и иммуномодуляторными эффектами (Hardy et al. (2001) Blood 97:473; Cutrone and Langer (2001) J.Biol.Chem. 276: 17140). Локус IFNα человека включает два подсемейства. Первое подсемейство состоит из 14 неаллельных генов и 4 псевдогенов, имеющих гомологию не менее 80%. Второе подсемейство αII или омега (ω), содержит 5 псевдогенов и 1 функциональный ген, который на 70% гомологичен генам IFNα (Weissman and Weber (1986) Prog.Nucl.Acid Res. Mol. Biol., 33: 251-300). Подтипы IFNα обладают различными видами специфической активности, но имеют одинаковый биологический спектр (Streuli et al. (1981) Proc.Natl.Acad.Sci USA 78:2848) и один и тот же клеточный рецептор (Agnet M. et. al. in “Interferon 5” Ed.I. Gresser p. 1-22, Academic Press, London 1983).

Интерферон β (IFNβ) закодирован одним геном, который имеет примерно 50% гомологию с генами IFNα.

Гамма-интерферон, который вырабатывается активированными лимфоцитами, не обладает какой-либо гомологией с интерферонами альфа/бета и не взаимодействует с их рецептором.

Все интерфероны человека типа I связываются с рецептором на клеточной поверхности (IFN альфа рецептором, IFNAR), состоящим из двух трансмембранных белков, т.е. IFNAR-1 и IFNAR-2 (Uze et al. (1990) Cell 60:225; Novick et al. (1994) Cell 77:391). IFNAR-1 важен для высокоаффинного связывания и дифференциальной специфичности комплекса IFNAR (Cutrone, 2001, см.выше). Хотя функциональные различия каждого из подтипов IFN типа I не были установлены, предполагают, что каждый из них может осуществлять различные взаимодействия с компонентами рецептора IFNAR, ведущие к появлению потенциально различных сигналов (Cook et al. (1996) J.Biol.Chem. 271: 13448). В частности, исследования с использованием мутантных форм IFNAR1 и IFNAR2 позволили предположить, что сигналы альфа- и бета-интерферонов по-разному передаются рецептором за счет различного взаимодействия с соответствующими цепями (Lewerenz et al. (1998) J.Mol.Biol. 282: 585).

Первоначально функциональные исследования интерферонов типа I были сконцентрированы на природной защите против вирусных инфекций (Haller et al. (1981) J.Exp.Med. 154:199; Lindenmann et al. (1981) Methods Enzymol. 78: 181). Однако в более поздних исследованиях интерфероны типа I рассматривают как мощные иммунорегуляторные цитокины при адаптивном иммунном ответе. Конкретно, было показано, что интерфероны типа I облегчают дифференцировку «необученных» T-клеток в направлении пути Th1 (Brinkmann et al. (1993) J.Exp.Med 178: 1655), усиливают выработку антител (Finkelman et al. (1991) J.Exp.Med. 174:1179) и поддерживают функциональную активность и сохранение памяти T-клеток (Santini et al. (2000) J.Exp.Med. 191:1777; Tough et al. (1996) Science 272:1947).

В современных работах многочисленных исследовательских групп предполагается, что IFN-α может улучшать созревание или активацию дендритных клеток (DC) (Santini, et al. (2000) J.Exp.Med.191:1777; Luft et al. (1998) J.Immunol.161:1947; Luft et al. (2002) Int.Immunol. 14:367; Radvanyi et al. (1999) Scand.J.Immunol. 50:499). Кроме того, увеличение экспрессии интерферонов типа I было описано при многочисленных аутоиммунных заболеваниях (Foulis et al.(1987) Lancet 2: 1423; Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum. 25:396; Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol.Immunopathol. 48:192; Hopkins and Meager (1988) Clin.Exp.Immunol. 73:88; Arvin and Miller (1984) Arthritis Rheum. 27:582). Большинство изученных примеров этих заболеваний представляют собой инсулин-зависимый сахарный диабет (IDDM) (Foulis (1987), см. выше) и системную красную волчанку (SLE) (Hooks (1982), см. выше), которые связаны с повышенными уровнями IFN-α, а также ревматоидный артрит (RA) (Hertzog (1988), Hopkins and Meager (1988), Arvin and Miller (1984) см. выше), при котором более важную роль может играть IFN-β.

Кроме того, сообщалось, что введение интерферона α обостряет основное заболевание у пациентов с псориазом и рассеянным склерозом и вызывает SLE-подобный синдром у пациентов, у которых ранее отсутствовали аутоиммунные заболевания. Также было показано, что интерферон α вызывает гломерулонефрит у нормальных мышей и ускоряет начало спонтанного аутоиммунного заболевания мышей NZB/W. Кроме того, было показано, что в некоторых случаях IFN-α терапия ведет к нежелательным побочным эффектам, в том числе к повышению температуры и неврологическим расстройствам. Следовательно, имеются патологические состояния, при которых ингибирование активности интерферонов типа I может оказать благоприятный эффект у пациента, и существует потребность в средствах, эффективных для ингибирования активности интерферонов типа I.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам человека, которые связываются с IFNAR-1 и ингибируют биологическую активность интерферона типа I, предпочтительно, нескольких интерферонов типа I. Кроме того, указанные антитела не связываются с тем же эпитопом, что и анти-IFNAR-1 антитело мыши, т.е. 64G12.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному антителу человека или его антиген-связывающему участку, причем антитело специфично связывается с IFNAR-1 и проявляет одно или несколько из следующих свойств:

a) связывается с IFNAR-1 с K_D, равной 1×10^-7М, или с более высокой аффинностью;

b) ингибирует биологическую активность нескольких интерферонов типа I;

c) ингибирует активность IFN-α 2b в анализе пролиферации клеток Daudi;

d) ингибирует активность IFN омега в анализе пролиферации клеток Daudi;

e) ингибирует секрецию IP-10 моноядерными клетками периферической крови, вызванную IFN-α 2b;

f) ингибирует секрецию IP-10 моноядерными клетками периферической крови, вызванную IFN омега;

g) ингибирует развитие дендритных клеток, опосредованное плазмой системной красной волчанки; и

h) связывается с другим эпитопом, чем моноклональное антитело 64G12 мыши (ECACC, депозитарный № 92022605).

Предпочтительные антитела по настоящему изобретению специфично связываются c рецептором 1 интерферона альфа человека, причем связывание осуществляется с K_D 1×10^-8М или большей аффинностью, или с K_D 1×10^-9М или большей аффинностью, или с K_D 5×10^-10М или большей аффинностью, или с K_D 2×10^-10М или большей аффинностью.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антиген-связывающему участку, включающим вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или производным генов V_H 4-34 или 5-51 человека, причем указанное антитело специфично связывается с рецептором 1 интерферона альфа человека. В другом аспекте изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антиген-связывающей части, включающим вариабельную область легкой цепи, которая является продуктом или производным генов V_K L18 или A27 человека, причем указанное антитело специфично связывается с рецептором 1 интерферона альфа человека. В еще одном аспекте изобретение относится к выделенному моноклональному антителу человека или его антиген-связывающему участку, включающим:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или производным генов V_H 4-34 или 5-51 человека; и

(b) вариабельную область легкой цепи, которая является продуктом или производным генов V_K L18 или A27 человека;

где антитело специфично связывается с рецептором 1 интерферона альфа человека.

В предпочтительных вариантах осуществления антитело включает вариабельную область тяжелой цепи гена V_H 4-34 человека и вариабельную область легкой цепи гена V_K L18 человека или же антитело включает вариабельную область тяжелой цепи гена V_H 5-51 человека и вариабельную область легкой цепи гена V_K A27 человека.

В другом аспекте, изобретение относится к выделенному моноклональному антителу человека или его антиген-связывающему участку, включающим:

вариабельную область тяжелой цепи человека, включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3; и вариабельную область легкой цепи человека, включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем:

(a) последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 9, 10, 11 и 12 и их консервативных модификаций;

(b) последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 24 и их консервативных модификаций;

(c) антитело специфично связывается с рецептором 1 интерферона альфа человека со сродством к связыванию не менее 1×10^-8М или большим; и

(d) антитело ингибирует биологическую активность хотя бы одного интерферона типа I.

Предпочтительно, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5, 6, 7 и 8 и их консервативных модификаций; и последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 17, 18, 19 и 20 и их консервативных модификаций. Предпочтительно, последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4 и их консервативных модификаций; и последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 13, 14, 15 и 16 и их консервативных модификаций.

В другом аспекте, изобретение относится к выделенному моноклональному антителу человека или его антиген-связывающему участку, включающим вариабельную область тяжелой цепи человека и вариабельную область легкой цепи человека, причем:

(a) вариабельная область тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 26, 27 и 28;

(b) вариабельная область легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 31 и 32;

(c) антитело специфично связывается с рецептором 1 интерферона альфа человека со сродством к связыванию не менее 1×10^-8М или большим; и

(d) антитело ингибирует биологическую активность хотя бы одного интерферона типа I.

Предпочтительные антитела по настоящему изобретению включают выделенные моноклональные антитела человека или их антиген-связывающие участки, включающие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1 человека, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4;

(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2 человека, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6, 7 и 8;

(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3 человека, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 10, 11 и 12;

(d) вариабельную область легкой цепи CDR1 человека, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 14, 15 и 16;

(e) вариабельную область легкой цепи CDR2 человека, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 18, 19 и 20; и

(f) вариабельную область легкой цепи CDR3 человека, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 24;

причем антитело специфично связывается с рецептором 1 интерферона альфа человека со сродством к связыванию не менее 1×10^-8М или большим.

Предпочтительные комбинации областей CDR включают следующие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1 человека, включающую SEQ ID NO:1;

(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2 человека, включающую SEQ ID NO:5;

(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3 человека, включающую SEQ ID NO:9;

(d) вариабельную область легкой цепи CDR1 человека, включающую SEQ ID NO:13;

(e) вариабельную область легкой цепи CDR2 человека, включающую SEQ ID NO:17; и

(f) вариабельную область легкой цепи CDR3 человека, включающую SEQ ID NO:21.

(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1 человека, включающую SEQ ID NO:2;

(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2 человека, включающую SEQ ID NO:6;

(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3 человека, включающую SEQ ID NO:10;

(d) вариабельную область легкой цепи CDR1 человека, включающую SEQ ID NO:14;

(e) вариабельную область легкой цепи CDR2 человека, включающую SEQ ID NO:18; и

(f) вариабельную область легкой цепи CDR3 человека, включающую SEQ ID NO:22.

(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1 человека, включающую SEQ ID NO:3;

(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2 человека, включающую SEQ ID NO:7;

(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3 человека, включающую SEQ ID NO:11;

(d) вариабельную область легкой цепи CDR1 человека, включающую SEQ ID NO:15;

(e) вариабельную область легкой цепи CDR2 человека, включающую SEQ ID NO:19; и

(f) вариабельную область легкой цепи CDR3 человека, включающую SEQ ID NO:23.

(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1 человека, включающую SEQ ID NO:4;

(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2 человека, включающую SEQ ID NO:8;

(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3 человека, включающую SEQ ID NO:12;

(d) вариабельную область легкой цепи CDR1 человека, включающую SEQ ID NO:16;

(e) вариабельную область легкой цепи CDR2 человека, включающую SEQ ID NO:20; и

(f) вариабельную область легкой цепи CDR3 человека, включающую SEQ ID NO:24.

Другие предпочтительные антитела по настоящему изобретению включают выделенные моноклональные антитела человека или их антиген-связывающие участки, включающие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 26, 27 и 28; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 31 и 32;

причем антитело специфично связывается с рецептором 1 интерферона альфа человека со сродством к связыванию не менее 1×10^-8М или большим.

Предпочтительные комбинации тяжелой и легкой цепей включают следующие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29.

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30.

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31.

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32.

Другой аспект изобретения относится к антителам, которые конкурируют за связывание с IFNAR-1 с контрольными антителами, разработанными в настоящем изобретении. Соответственно, в другом варианте осуществления изобретение относится к:

выделенному моноклональному антителу или его антиген-связывающему участку, причем антитело принимает участие в перекрестной конкуренции с контрольным антителом за связывание с рецептором 1 интерферона альфа человека, где контрольное антитело выбрано из группы, состоящей из:

(a) антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29;

(b) антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30;

(c) антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31; и

(d) антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антителу человека или его антиген-связывающему участку, причем антитело не связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело 64G12 мыши (ECACC депозитарный № 92022605), (т.е. не участвует в перекрестной конкуренции с ним).

Антитела по настоящему изобретению могут принадлежать к любому изотипу. Предпочтительные антитела относятся к изотипам IgG1, IgG3 или IgG4. Антитела по настоящему изобретению могут быть полноразмерными антителами, включающими вариабельные и константные области, или же они могут являться их антиген-связывающими фрагментами, как, например, антителами с одной цепью или фрагментами Fab или Fab'2.

Кроме этого изобретение относится к иммуноконъюгату, включающему антитело по настоящему изобретению или его антиген-связывающий участок, связанные с терапевтическим средством, таким как цитотоксин или радиоактивный изотоп. Изобретение также относится к биспецифичной молекуле, включающей антитело или его антиген-связывающий участок, по настоящему изобретению, связанные со вторым функциональным фрагментом, имеющим специфичность связывания, отличную от указанного антитела или его антиген-связывающего участка.

Композиции, содержащие антитело или его антиген-связывающий участок, или иммуноконъюгат или биспецифичную молекулу по настоящему изобретению, и кроме того фармацевтически приемлемый носитель, также относятся к настоящему изобретению.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела или их антиген-связывающие участки по настоящему изобретению, также входят в объем изобретения, также как и векторы экспрессии, включающие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы экспрессии. Кроме того, изобретение относится к трансгенным мышам, имеющим трансгены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека, причем мыши экспрессируют антитела по настоящему изобретению, а также к гибридомам, полученным из таких мышей, причем гибридомы вырабатывают антитела по настоящему изобретению.

Помимо этого изобретение относится к способам получения «второго поколения» антител анти-IFNAR-1, основанным на последовательностях антител анти-IFNAR-1, разработанных в настоящем изобретении. Например, изобретение относится к способу получения антитела анти-IFNAR-1, включающему:

(a) получение: (i) последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, включающей последовательность CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4, последовательность CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6, 7 и 8; и последовательность CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 10, 11 и 12; или (ii) последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, включающей последовательность CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 14, 15 и 16, последовательность CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 18, 19 и 20, а также последовательность CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 24;

(b) изменение хотя бы одного аминокислотного остатка в хотя бы одной вариабельной области последовательности антитела, причем упомянутая последовательность выбрана из последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, для создания хотя бы одной измененной последовательности антитела; и

(c) экспрессию измененной последовательности антитела в виде белка.

Кроме этого, настоящее изобретение относится к способу ингибирования биологического действия интерферона типа I на экспрессируемый клетками рецептор 1 интерферона альфа, включающий взаимодействие клетки с антителом по настоящему изобретению, с тем, чтобы ингибировать биологическую активность интерферона типа I. Изобретение также относится к способу лечения заболеваний или расстройств у индивидуума, опосредованных интерфероном типа I, в случае необходимости такого лечения, включающему введение индивидууму антитела или его антиген-связывающего участка по настоящему изобретению, с тем, чтобы подвергнуть лечению заболевание, опосредованное интерфероном типа I. Заболевание, опосредованное интерфероном типа I, может, например, представлять собой заболевание, опосредованное интерфероном альфа.

Примеры заболеваний или расстройств, для которых может быть эффективно применение способов по настоящему изобретению, включают системную красную волчанку, инсулин-зависимый сахарный диабет, воспалительные заболевания кишечника, рассеянный склероз, псориаз, аутоиммунный тиреоидит, ревматоидный артрит, гломерулонефрит, ВИЧ-инфекцию, СПИД, отторжение трансплантата и реакцию «трансплантат против хозяина».

Другие отличительные особенности и преимущества настоящего изобретения станут ясны из следующего подробного описания и примеров, которые не должны истолковываться как ограничивающие. Содержание всех ссылок, позиций в генобанке, патентов и опубликованных заявок на патенты, цитируемых в тексте настоящей заявки, непосредственно включено в настоящую заявку с помощью ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1A показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:33) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:25) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела 3F11 человека. Выделены области CDR1(SEQ ID NO:1), CDR2(SEQ ID NO:5) и CDR3(SEQ ID NO:9).

На фиг.1B показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:37) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:29) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела 3F11 человека. Выделены области CDR1(SEQ ID NO:13), CDR2(SEQ ID NO:17) и CDR3(SEQ ID NO:21).

На фиг.2A показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:34) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:26) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела 4G5 человека. Выделены области CDR1(SEQ ID NO:2), CDR2(SEQ ID NO:6) и CDR3(SEQ ID NO:10).

На фиг.2B показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:38) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:30) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела 4G5 человека. Выделены области CDR1(SEQ ID NO:14), CDR2(SEQ ID NO:18) и CDR3(SEQ ID NO:22).

На фиг.3A показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:35) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:27) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела 11E2 человека. Выделены области CDR1(SEQ ID NO:3), CDR2(SEQ ID NO:7) и CDR3(SEQ ID NO:11).

На фиг.3B показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:39) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:31) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела 11E2 человека. Выделены области CDR1(SEQ ID NO:15), CDR2(SEQ ID NO:19) и CDR3(SEQ ID NO:23).

На фиг.4A показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:36) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:28) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела 9D4 человека. Выделены области CDR1(SEQ ID NO:4), CDR2(SEQ ID NO:8) и CDR3(SEQ ID NO:12).

На фиг.4B показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:40) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:32) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела 9D4 человека. Выделены области CDR1(SEQ ID NO:16), CDR2(SEQ ID NO:20) и CDR3(SEQ ID NO:24).

На фиг.5 показано совмещение аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи 3F11 с аминокислотной последовательностью зародышевой линии V_H 4-34 человека (SEQ ID NO:41).

На фиг.6 показано совмещение аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи 4G5 с аминокислотной последовательностью зародышевой линии V_H 4-34 человека (SEQ ID NO:41).

На фиг.7 показано совмещение аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи 11E2 и 9D4 с аминокислотной последовательностью зародышевой линии V_H 5-51 человека (SEQ ID NO:42).

На фиг.8 показано совмещение аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 3F11 с аминокислотной последовательностью зародышевой линии V_k L18 человека (SEQ ID NO:43).

На фиг.9 показано совмещение аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 4G5 с аминокислотной последовательностью зародышевой линии V_k L18 человека (SEQ ID NO:43).

На фиг.10 показано совмещение аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 11E2 и 9D4 с аминокислотной последовательностью зародышевой линии V_k A27 человека (SEQ ID NO:44).

Фиг.11 представляет собой график, показывающий результаты экспериментов, демонстрирующих, что моноклональное антитело человека, а именно 3F11, направленное против IFNAR-1 человека не конкурирует с моноклональным антителом 64G12 мыши за связывание с IFNAR-1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, которые связываются с рецептором 1 интерферона альфа (IFNAR-1) и которые способны блокировать действие интерферонов типа I. В настоящем изобретении разработаны выделенные антитела, способы получения этих антител, иммуноконъюгаты и биспецифичные молекулы, включающие такие антитела, а также фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела, иммуноконъюгаты или биспецифичные молекулы по настоящему изобретению. Кроме этого настоящее изобретение относится к способам применения этих антител для ингибирования связывания интерферона типа I с IFNAR-1 на клетках, экспрессирующих IFNAR-1, например, при лечении иммунно-опосредованных расстройств у индивидуума, включая аутоиммунные расстройства, отторжение трансплантатов и реакцию трансплантат против хозяина (GVHD).

Для более легкого понимания настоящего изобретения в начале определяются некоторые термины. Дополнительные определения приведены по ходу подробного описания изобретения.

Термины «рецептор-1 интерферона альфа», «IFNAR-1» и «антиген IFNAR-1» являются взаимозаменяемыми и включают варианты, изоформы, разновидности гомологов IFNAR-1 человека, а также его аналоги, имеющие хотя бы один общий эпитоп с IFNAR-1. Соответственно, антитела человека по настоящему изобретению в некоторых случаях могут вступать в перекрестное взаимодействие с IFNAR-1 других биологических видов, кроме человека, или другими белками, которые структурно родственны с IFNAR-1 человека (например, гомологами IFNAR-1 человека). В других случаях антитела могут быть полностью специфичны для IFNAR-1 человека и могут не проявлять признаков способности к перекрестным взаимодействиям других типов.

Полная последовательность кДНК IFNAR-1 человека имеет инвентарный номер генобанка NM_000629.

Термин «интерферон типа I» в настоящем описании предназначен для указания на членов семейства молекул интерферонов типа I, которые являются лигандами для IFNAR-1 (т.е. членов семейства молекул интерферонов типа I, которые способны связываться с IFNAR-1). Примерами лигандов, относящихся к интерферонам типа I, являются интерферон альфа 1, 2a, 2b, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 21, интерферон бета и интерферон омега.

Термин «иммунный ответ» относится к действию, например, лимфоцитов, антигенпредставляющих клеток, фагоцитов, гранулоцитов и растворимых макромолекул, вырабатываемых указанными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к селективному повреждению или разрушению, или удалению из организма человека проникших в него патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных клеток или тканей.

Термин «путь трансдукции сигнала» относится к биохимической связи между различными молекулами, преобразующими сигнал, которые играют роль в передаче сигнала из одной части клетки в другую ее часть. В настоящем описании фраза «рецептор клеточной поверхности» включает в себя, например, молекулы и комплексы молекул, способные получать сигнал и передавать этот сигнал через цитоплазматическую оболочку клетки. Примером «рецептора клеточной поверхности» в настоящем изобретении является рецептор IFNAR-1.

Термин «антитело» в рамках настоящего описания включает целые антитела и любые их антиген-связывающие фрагменты (т.е. «антиген-связывающие участки») или отдельные цепи. Термин «антитело» относится к гликопротеинам, содержащим, как минимум, две тяжелых цепи (H) и две легких цепи (L), связанных дисульфидными связями, или к их антиген-связывающим участкам. В каждую тяжелую цепь включена вариабельная область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемая в тексте V_H) и константная область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов C_H1, C_H2 и C_H3. В каждую из легких цепей включена вариабельная область легкой цепи (сокращенно обозначаемая в тексте V_L) и константная область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, обозначаемого C_L. Области V_H и V_L далее могут быть подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), которые чередуются с более консервативными фрагментами, именуемыми каркасными областями (FR). Каждая из цепей V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающие домены, которые взаимодействуют с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с хозяйскими тканями или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, клетки-эффекторы) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Термин «антиген-связывающий участок» антитела (или просто «участок антитела») в настоящем описании относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, IFNAR-1). Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином «антиген-связывающий участок» антитела, включают (i) фрагмент Fab, т.е. моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) фрагмент F(ab')₂, т.е. бивалентный фрагмент, включающий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов V_H и C_H1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена V_H; и (vi) выделенная область, определяющая комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, т.е. V_L и V_H, закодированы отдельными генами, они могут быть объединены синтетическим линкером с использованием рекомбинантных способов, причем линкер дает возможность получить их в виде единой белковой цепи, в которой пара областей V_L и V_H образует моновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 5879-5883). Имеется в виду, что такие одноцепочечные антитела также охвачены термином «антиген-связывающий участок» антитела. Эти фрагменты антител получают с использованием стандартных методик, известных специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергают отбору по их полезности тем же способом, что и интактные антитела.

Термин «выделенное антитело» в настоящем изобретении предназначен для указания на антитело, которое в основном свободно от других антител, обладающих другими антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфично связывается с IFNAR-1, в основном свободно от антител, которые специфично связываются с другими антигенами, отличающимися от IFNAR-1). Однако, выделенное антитело, которое специфично связывается с IFNAR-1, может обладать перекрестной реакционной способностью в отношении других антигенов, таких как молекулы IFNAR-1 других видов. Кроме того, выделенное антитело может быть в основном свободно от других клеточных веществ и/или химических соединений.

Термины «моноклональное антитело» или «композиция на основе моноклонального антитела» в настоящем описании относятся к препарату на основе молекул антитела одного молекулярного состава. Композиция на основе моноклонального антитела проявляет одну специфичность связывания и сродство к конкретному эпитопу.

Предполагается, что в настоящем описании термин «антитело человека» включает антитела, имеющие вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR области получены из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии клеток человека. Кроме того, если антитело содержит константную область, константная область также получена из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии клеток человека. Антитела человека по настоящему изобретению могут включать аминокислотные остатки, которые не закодированы иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевой линии клеток человека (например, мутации, внесенные случайным или сайт-специфичным мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo). Однако в настоящем описании не предполагается, что термин «антитело человека» включает антитела с последовательностями CDR, полученными из зародышевых линий клеток других видов млекопитающих, как, например, мышей, которые привиты к каркасным последовательностям человека.

Термин «моноклональное антитело человека» относится к антителам, демонстрирующим одну специфичность связывания, которые имеют вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR области получены из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии клеток человека. В одном из вариантов осуществления моноклональные антитела человека вырабатываются гибридомой, которая включает B-клетки, полученные из трансгенных животных, не относящихся к человеческому роду, например, трансгенных мышей, имеющих геном, который включает трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, слитый с иммортализованной клеткой.

Термин «рекомбинантное антитело человека» в настоящем описании включает все антитела человека, которые образуются, экспрессируются, создаются или изолируются средствами рекомбинантных технологий, как, например, (a) антитела, изолированные из животных (например, мышей), которые являются трансгенными или трансхромосомными, для получения из них генов иммуноглобулина человека или гибридомы (описанного ниже по тексту), (b) антитела, выделенные из клеток-хозяев, преобразованных для экспрессии антител человека, например, из трансфектомы, (c) антитела, выделенные из рекомбинантных, комбинаторных библиотек антител человека и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который включает сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные области, в которых каркасные и CDR области получены из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии клеток человека. Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека могут быть подвергнуты in vitro мутагенезу (или, если используется животное, являющееся трансгенным вследствие наличия последовательностей Ig человека, in vivo соматическому мутагенезу) и, таким образом, аминокислотные последовательности областей V_H и V_L рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, будучи получены из, и являясь родственными последовательностям V_H и V_L зародышевых линий клеток человека, могут отсутствовать в природе в ассортименте антител зародышевой линии человека in vivo.

В настоящем описании термин «изот