Животная модель, экспрессирующая люциферазу под контролем промотора основного белка миелина (mbp-luci), и применение модели для визуализации биолюминесценции in vivo

Животная модель, экспрессирующая люциферазу под контролем промотора основного белка миелина (mbp-luci), и применение модели для визуализации биолюминесценции in vivo

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к изготавливаемой модели биовизуализации люциферазы под контролем основного белка миелина (MBP-luci), используемой, например, для визуализации и количественного определения демиелинизации/ремиелинизации на уровне транскрипции в режиме реального времени на живых животных с использованием методик биовизуализации.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

При разработке лекарственных средств степень потерь является высокой с учетом того, что только одно из пяти соединений проходит путь от разработки до разрешения к применению (DiMasi, JA, et al., J Health Econ 22,151-185). Более того, несмотря на значительно увеличившееся финансирование процент введения новых лекарственных средств на рынок остается относительно постоянным на протяжении последних 30 лет, с двумя-тремя веществами в новых классах лекарственных средств в итоге выходящими на рынок в год (Lindsay MA, Nature Rev Drug Discovery, 2, 831-838).

Молекулярная и функциональная визуализация, используемая на начальных стадиях разработки лекарственных средств, может дать информацию о биологической активности и подтвердить мишеневые лекарственные эффекты. Соответственно ожидается, что вложения в технологию молекулярной визуализации улучшат разработку лекарственных соединений (Rudin M, et al., Progress in Drug Res, 2005, vol 62, 185-255). Преимущество методик молекулярной визуализации по сравнению с более общепринятыми способами получения данных состоит в том, что их можно проводить на интактном организме с достаточным пространственным и временным разрешением для изучения биологических процессов in vivo. Кроме того, данные способы молекулярной визуализации позволяют повторное, неинвазивное, унифицированное и относительно автоматизированное исследование одного животного в различные точки времени, таким образом повышая статистическую мощность долгосрочных исследований и снижая требуемое число животных и стоимость исследований. Модель MBP-luci поддерживает как увеличение производительности первичного скрининга потенциальных лекарственных соединений in vivo, так и повышение чувствительности биологических анализов. Исходные прототипные соединения часто неоптимальны в качестве лекарственных продуктов для продажи, однако детекция специфичной и значительной активности in vivo может повлечь оптимизацию химических структур для достижения приемлемого уровня активности и минимизации токсичности in vivo в отношении лечения определенных заболеваний ЦНС.

Молекулярная визуализация

Молекулярная визуализация относится к объединению подходов из различных дисциплин (например, клеточной и молекулярной биологии, химии, медицины, фармакологии, физики, биоинформатики и инженерии) для использования и интеграции способов визуализации при оценке определенных молекулярных процессов на клеточном и субклеточном уровне в живом организме (Massoud T.F., Genes Dev. 17:545-580).

Возникновение генетической инженерии внесло, по-видимому, главные изменения в прикладную науку, включая, например, в направление поиска лекарственных средств. Аналогичным образом, разработка и использование процедур визуализации на животных обеспечивает новое средство в области доклинических исследований (Maggie A, Ciana P. Nat. Rev. Drug Discvy. 4, 249-255). Животные модели традиционно были трудоемкими вследствие сложности количественной оценки физиологических событий в реальном времени. Со временем были разработаны новые способы визуализации для преодоления данных сложностей (например, МРТ, КТ, ПЭТ). В последнее время для неинвазивной детекции активности генов-мишеней используют биолюминесцентную визуализацию на основе in vivo экспрессии люциферазы, светоизлучающего фермента светлячка.

В результате объединения генной инженерии животных со способами молекулярной визуализации стало возможным проводить динамические исследования определенных молекулярных процессов на живых животных. Этот подход мог бы потенциально оказать воздействие на протоколы доклинических исследований, таким образом, значительно меняя все аспекты медицины (Maggie A. Trends Pharmacolo. Sci. 25, 337).

Молекулярная визуализация: биолюминесцентная

Биолюминесцентная визуализация in vivo (BLI) представляет собой чувствительный инструмент, основанный на детекции эмиссии света из клеток или тканей. Использование технологии репортерных генов делает возможным анализ определенных клеточных и биологических процессов в живом организме посредством способов визуализации in vivo. Биолюминесценция, ферментативная выработка видимого света живым организмом, является природным феномером, наблюдаемым для многих видов животных, за исключением млекопитающих (Contag, CH, Mol. Microbiol. 18:593-603). Люциферазы представляют собой ферменты, которые катализируют окисление субстрата, высвобождая фотоны света (Greer LFIII, Luminescence 17:43-74). Наиболее широко используется биолюминесценция североамериканского светлячка. При экспрессии гена люциферазы светлячка (luc) продуцируется фермент люцифераза, который превращает субстрат D-люциферин в нереакционноспособный оксилюциферин, в результате испуская зеленый свет при 562 нм. Вследствие того, что ткани млекопитающих обычно не испускают биолюминесценцию, in vivo BLI является перспективным методом, поскольку изображения можно получать с очень низким фоновым сигналом.

BLI требует генетической инженерии клеток или тканей с использованием экспрессионной кассеты, состоящей из биолюминесцентного репортерного гена под контролем промотора выбранного гена, обеспечивающего экспрессию светового репортера (фиг. 1). Для начала испускания света субстрат (например, люциферин) вводят с помощью интрацеребрально-вентрикулярной, внутрисосудистой, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.

Свет, испускаемый люциферазой/люциферином способен проникать сквозь ткань толщиной от нескольких миллиметров до сантиметров; однако интенсивность потока фотонов снижается примерно в 10-раз на каждый сантиметр толщины ткани (Contag CH Mol. Microbio. 18: 593-603). Для детекции биолюминесценции in vivo необходимо использовать чувствительные инструменты светодетекции. Детекторы измеряют число фотонов, испускаемых на единицу площади. Низкий уровень света при длинах волн между 400 и 1000 нм можно детектировать с помощью камер с прибором с зарядовой связью (CCD), который превращает световые фотоны, ударяющие кремниевые пластины, в электроны (Spibey CP et al Electrophoresis 22:829-836). С помощью программного обеспечения можно конвертировать сигналы электронов в двумерное изображение. С помощью программного обеспечения также можно количественно оценить интенсивность испускаемого света (число испускаемых фотонов, попадающих на детекторы) и превратить эти числовые величины в псевдоцветную графику. Фактические данные измеряются числом фотонов, но псевдоцветная графика обеспечивает возможность быстрой визуальной интерпретации. Количественные измерения в пределах области, представляющей интерес, могут быть необходимы для более тонких различий. Использование охлаждаемых CCD-камер снижает температурный шум, а светонепроницаемый корпус позволяет оптимальную визуализацию и количественную оценку продуцируемого люциферазой света (Contag CH, Annu.Rev.Biomed.Eng. 4:235-260).

Полезно иметь изображение люциферазного сигнала, наложенное на другой тип изображения, такой как автограф или радиоавтограф для анатомического положения испускаемого сигнала (фиг. 2). Программное обеспечение осуществляет наложение изображений для визуализации и интерпретации.

Демиелинизирующее заболевание, олигодендроциты и основной белок миелина

Основной белок миелина (МВР) требуется для нормального уплотнения и функционирования миелина. Совместно с гликопротеином миелина олигодендроцитов (MOG) и протеолипидным белком (PLP) эти белки составляют семейство структурных белков миелина и синтезируются клетками, продуцирующими миелин: олигодендроцитами в центральной нервной системе (ЦНС) и Шванновскими клетками в периферической нервной системе (ПНС). В развивающейся ЦНС экспрессия МВР совпадает с временным периодом миелинизации. Соответственно, в данной области МВР принят в качестве маркера созревания олигодендроцитов. Высокий уровень экспрессии МВР (вместе с другими белками) совпадает с выработкой миелина, продолжается на всем протяжении миелиногенеза и снижается при разрушении аксона (Gupta et al. Brain Res. 464:133-141).

Заболевания, которые влияют на целостность миелина приводят к нарушенной проводимости аксональных сигналов в затронутых нейронах и могут привести к нарушению восприятия, движения, познания или других функций в зависимости затронутых нейронов. Термин «демиелинизирующие заболевания» описывает эффект заболевания, а не его причину, и они могут быть вызваны генетическими причинами, инфекционными средствами, аутоиммунными реакциями и неизвестными факторами. Все эти заболевания остаются патологическими состояниями человека с огромной нереализованной необходимостью медицинского вмешательства, часто связанного с необходимостью восстановительных методов лечения.

Демиелинизирующие заболевания центральной нервной системы включают:

- Рассеянный склероз (совместно с аналогичными заболеваниями, называемыми идиопатическими воспалительными демиелинизирующими заболеваниями);

- Поперечный миелит;

- Болезнь Девика;

- Прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию;

- Оптический неврит;

- Лейкодистрофии;

- Болезнь Пелицеуса-Мерцбахера;

- Дисфункцию/потерю миелина, также связанную с повреждением спинного мозга, болезнью Альцгеймера и Паркинсона и шизофренией.

Демиелинизирующие заболевания периферической нервной системы включают:

- Синдром Гийена-Барре и его хронический аналог, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию;

- Периферические нейропатии (вызываемые токсинами, диабетом анти-MAG, антителами и т.п.);

- Болезнь Шарко-Мари-Тута.

In vivo модели демиелинизации

Общей стадией при разработке доклинических потенциальных соединений для борьбы с демиелинизирующими заболеваниями является оценка действия терапевтических потенциальных соединений на животных моделях, которые повторяют частично или полностью процесс демиелинизации, и которые обладают способностью к эндогенной ремиелинизации. Химически индуцированную демиелинизацию можно получить на животных моделях, и 6-8 недельные молодые самцы мышей восприимчивы к демиелинизации, получаемой в результате 4-6 недельной диеты, включающей 0,2%-ный купризон (бис-циклогексанон-оксалдигидразон) (Ludwin SK, 1978, Lab Invest 39: 597-612). При воздействии купризона демиелинизация возникает по всему мозгу, но наиболее легко детектируется в области высокой концентрации белого вещества - мозолистом теле (Merkler et al., 2005, NMR Biomed 18: 395-403). Демиелинизация становится очевидной в течение 3 недель после начала диеты с купризоном. Замещение диеты нормальной пищей дает возможность практически полной ремиелинизации в течение 4-6 недель (Matsushima et al., 2001, Brain Pathol 11: 107-116). Иммуногистохимическое окрашивание аксональных повреждений с использованием белка-предшественника амилоида или импрегнации в серебро по Бильщовскому не выявляет значительных аксональных повреждений у 8-недельных мышей (Merkler). Однако поперечное сечение аксонов значительно увеличивалось у 6-7 месячных мышей, частично способствуя задержке ремиелинизации, наблюдаемых у старых животных (Irvine KA, et al., 2006, J Neuroimmunol 175: 69-76). Количество клеток-предшественников олигодендроцитов, которые после дифференцировки замещают миелин, а также клеток микроглии и макрофагов, резко возрастает примерно через 4 недели на купризоновой диете и необходимо для эффективной ремиелинизации (Franco RJM, 2002, Nat Rev 3: 705-714).

Для количественной оценки измерений содержания миелина целый мозг или его субобласти можно выделить и провести оценку с помощью дот-блоттинга или Вестерн-блоттига. В альтернативном варианте, краткосрочный подход с высоким разрешением (относительно долгосрочного) для контроля субобластей потери и восстановления миелина включает количественную стереологию. Например, компьютерную стереологическую систему (CAST) можно использовать для оценки измерения миелина, окрашенного люксолом быстрым синим (красителем миелина) в мозолистом теле. Толуидиновый синий и электронная микроскопия являются необходимыми конечными стадиями для гарантии того, что уплотненный миелин образует правильную оболочку ранее оголенных аксонов. В отношении долгосрочной оценки Т2-взвешенная МРТ является средством количественной оценки изменений миелина в мозолистом теле мышей на купризоновой диете (Sanofi-Aventis Neurology, 2008, неопубликованные данные).

Модель биовизуализации MBP-luci, которая отслеживает статус миелинизации in vivo в режиме реального времени

В статье 2003 года Farhadi et al. (The Journal of Neuroscience, November 12, 2003, 23(32):10214-10223) было опубликовано, что промотор МВР содержит регуляторные элементы, четыре далеко отстоящих консервативных модуля, M1, M2, M3 и M4, размер которых находится в диапазоне 0,1-0,4 т.п.о., которые критичны для регуляции времени миелинизации и ремиелинизации (см. фиг. 1, 3 и 4). С использованием Lac Z в качестве репортерного гена они продемонстрировали, что проксимальные модули M1 и M2 обеспечивают относительно низкий уровень экспрессии в олигодендроцитах в ходе развития ЦНС, в то время как расположенная выше (в 5'-направлении от них) М3-область обеспечивает высокий уровень экспрессии в олигодендроцитах в ходе развития ЦНС и в ЦНС взрослых животных. Более того, данная область М3 необходима для экспрессии в ходе ремиелинизации после демиелинизирующего повреждения. М4 также обеспечивает экспрессию МВР в миелинизирующх Шванновских клетках.

Существующие способы с использованием животных моделей для оценки изменений в миелине in vivo являются затратными по времени, обычно занимающими 4-8 недель, и требуют большого числа животных. МВР-промотор ДНК, который включает все 4 специфичные регуляторные области, экспрессирующий ген люциферазы, составляет основу трансгенной модели мыши биовизуализации MBP-luci, которая была разработана для отслеживания изменений в транскрипционной активности основного белка миелина (МВР) в мозге, спинном мозге и/или периферической нервной систем в режиме реального времени. Эту трансгенную модель на грызунах можно использовать для in vitro и in vivo доказательства первичных исследований, направленных на отбор разрабатываемых кандидатов для лечения демиелинизирующих заболеваний человека, и она предлагает множество улучшений относительно существующих моделей:

- Возможность неинвазивного отслеживания изменений в миелинизации нервной системы с помощью биолюминесценции снижает материальные и трудовые ресурсы, связанные с посмертными гистологическими анализами и анализами тканевой экспрессии.

- Долгосрочные исследования значительно увеличивают чувствительность модели к изменениям в миелинизации. В предшествующих методах анализа необходимо было использовать отдельные группы животных для каждой временной точки, и это ограничивало количество данных, которые можно было собрать в ходе исследования. Вводились дополнительные переменные из-за необходимости использования отдельных групп животных.

- Данные биовизуализации обрабатываются быстро, обычно в течение того же дня, таким образом, позволяя регулирование (например, увеличение продолжительности исследования для достижения достоверности или более раннего окончания вследствие отсутствия влияния лекарственного соединения) для оптимизации схемы исследования и снижения ненужных затрат ресурсов.

- Группы животных и соответствующие воздействия можно оценивать в нулевой временной точке, что оптимизирует статистическую достоверность исследования, одновременно снижая число животных, необходимых на каждую группу воздействия. Данные исследований можно нормализовать на исходные значения, значительно снижая природную биологическую вариабельность, в тоже время обеспечивая более убедительные выводы по эффектам конкретных методов лечения.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новой модели in vivo для оценки эффектов терапевтических соединений на степень демиелинизации (например, нейропротекцию, защиту миелина) и ремиелинизации (например, восстановление). Биовизуализация животных и способы скрининга соединений по настоящему изобретению позволяют скрининг и/или подтверждение первичной валидации фармацевтических соединений и других терапевтических агентов посредством получения в режиме реального времени соответствующих данных с высоким разрешением на живых животных. Дополнительно, оценки можно получить относительно потенциальной токсичности, PK/PD и терапевтического окна, тем самым позволяя более точный прогноз в отношении дозировок для приматов и человека.

Настоящее изобретение относится к улучшенным инструментам и способам для изучения событий миелинизации с использованием живого трансгенного модельного организма. Изобретение снижает общее число требуемых индивидов по сравнению с другими моделями, поскольку каждый индивид может служить в качестве своего собственного базового контроля в долгосрочных исследованиях. Таким образом, снижается вариабельность между организмами, повышая достоверность статистических результатов. В различных аспектах изобретения достигаются различные преимущества. Несколько различных способов применения описаны в нижеследующем обсуждении.

Путем корреляции с экспрессией МВР настоящее изобретение обеспечивает способы мониторинга событий демиелинизации и/или ремиелинизации в живом модельном организме. Способ может включать трансгенно-модифицированные клетки-предшественники для получения модельного организма, в котором экспрессируется ген люциферазы под контролем МВР-промотора. Ген люциферазы при экспрессии может функционировать, продуцируя свет (биолюминесценция), в присутствии субстрата, такого как люциферин. Миелинизирующую и демиелинизирующую активность можно оценить путем мониторинга биолюминесценции в организме. Аппарат для визуализации и анализа предусматривает быструю корреляцию биолюминесценции и событий миелинизации относительно определенных участков тела организма.

Для изучения событий в центральной и периферической нервной системе особенно подходящими модельными организмами являются позвоночные организмы, которые используют миелин в своей нервной ткани. Млекопитающие являются организмами, которые используют миелин для усиления нейрональной проводимости как в ЦНС, так и ПНС. Общепринятые модели на млекопитающих, таких как грызуны (например, крысы, мыши), кролики, овцы, приматы, морские свинки и т.п., являются подходящими модельными организмами для использования в практическом применении настоящего изобретения.

Размер организма не является per se лимитирующим фактором. Однако размер аппарата можно оптимизировать к форме или размеру конкретного организма.

Одно событие биовизуализации может обеспечить желаемую информацию. Однако преимущество настоящего изобретения относится к возможности повторять измерения одного животного в множестве временных точек и сравнивать данные множества измерений. Один организм служит, таким образом, в качестве своего собственного контроля или базовой линии.

Соответственно, возможна биовизуализация в течение одного или нескольких временных интервалов демиелинизации или ремиелинизации у одного организма. Более того, нормализация сигнала визуализации на протяжении интервалов демиелинизации или ремиелинизации, для которых визуализация на протяжении повторяющихся интервалов эффективна для детекции уровня транскрипта МВР в организме в течении одного или нескольких событий, обеспечивает более достоверные данные.

Биолюминесцентный сигнал ослабляется тканями тела. Соответственно, нервная ткань, ближайшая к поверхности тела, дает наиболее сильный сигнал. Сигнал на детекторе можно увеличивать, получая более высокий выход сигнала в результате внесения в реакцию большего количества люциферазы, например, используя более высокую концентрацию, или увеличивая активность фермента либо уровень экспрессии. Сбор данных также можно улучшить, используя более чувствительные детекторы. Более чувствительные детекторы часто требуют охлаждающих аппаратов для получения достаточного уровня сигнала и для минимизации шума. Время, в течение которого собирают данные, также служит для увеличения уровня сигнала.

Модельным организмом по настоящему изобретению может быть трансгенное животное, содержащее ген люциферазы, который находится под контролем МВР-промотора. Животным может быть млекопитающее, например, любое млекопитающее, используемое в качестве животной модели. Крысы и мыши являются общепринятыми животными моделями. Ген люциферазы под контролем МВР-промотора экспрессируется в определенных тканях-мишенях модели, когда промотор активируется или запускается

МВР-промотор может содержать М1-М3 или может содержать М1-М4.

Сигнал можно усилить с помощью простых манипуляций, таких как выбор модели, чей волосяной покров меньше ослабляет сигнал. Например, модель, чей волосяной покров меньше ослабляет сигнал по сравнению с мышами С57/В6, будет давать сигнал, превосходящий сигнал, получаемый от мышей С57/В6.

Настоящее изобретение также относится к способу разработки модельного организма для биовизуализации. Разработку можно осуществить, начиная, например, со штамма мышей и получая трансгенных животных, затем отбирая одну или несколько линий, у которых визуализация всей мыши in vivo на пике постнатальной миелинизации показывает, например, ЦНС-специфичную визуализацию; затем отбирая одну или несколько линий, у которых визуализация ex vivo подтверждает экспрессию люциферазного трансгена в желаемой области, например, главным образом - в областях уплотненного белого вещества мозга. Затем можно отобрать одну или несколько линий, в которых интенсивность визуализации люциферазы четко коррелирует с изменениями в демиелинизации и ремиелинизации. Для улучшения данных можно отобрать одну или несколько линий, которые показывают ясную гистологическую демиелинизацию в ходе соответствующих манипуляций.

Купризоновая модель демиелинизации подходит для использования с настоящим изобретением. Время проведения биовизуализации зависит от характеристик развития модельного организма, например, можно выбрать время, принимая во внимание то, что пик постнатальной миелинизации обычно приходится приблизительно на 3-5-ю неделю жизни мышей G1.

Настоящее изобретение полезно для скрининга химических соединений, биологических соединений и других терапевтических элементов, которые могут влиять на миелиновые события в организме. Для влияния на миелиновые события соединение может модулировать экспрессию генов, или внутриклеточные либо межклеточные сигнальные события. Эти примеры являются только некоторыми конкретными примерами и не должны рассматриваться в качестве полного объема изобретения, который описан в формуле.

Хотя МВР-промотор хорошо охарактеризован с использованием репортерного гена lac Z, как описано, например, Farhadi (см. выше), использование моделей MBP-lac Z ограничено вследствие требований к забору тканей и их фиксации для детекции β-галактозидазы (продукта репортерного гена lacZ). Этот процесс требует гистохимических методик, несовместимых с детекцией в живых животных. Для того чтобы обойти эту проблему было предложено использование биолюминесцентных или флуоресцентных систем для создания трансгенной модели биовизуализации, в которой люциферазный или GFP-репортер избирательно контролируется крупными участками МВР-промотора.

Эта новая модель биовизуализации была разработана для визуализации и количественной оценки событий демиелинизации и/или ремиелинизации у живых животных, например, мышей, в режиме реального времени. Такой мониторинг можно использовать совместно с автоматизированными способами биовизуализации. Модель является полезным инструментом, например, для валидации мишени (например, когда модельных мышей для биовизуализации скрещивают с нокаутными и трансгенными мышами, имеющими желаемые признаки), а также для валидации соединений (например, для измерения эффективности соединения в модели, такой как купризоновый или экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит [EAE]) на сравнительной или количественной основе для принятия критических ключевых решений относительно выбора мишени и разработки соединений.

Настоящая модель биовизуализации (MBP-luci TG) была создана и использована для количественной оценки событий демиелинизации/ремиелинизации in vivo. Преимуществом модели биовизуализации является возможность проведения долгосрочных исследований, так что каждый организм может служить в качестве своего собственного контроля. Таким образом, избегают умерщвления животных в определенных точках времени. Можно постоянно отслеживать отдельных мышей на протяжении процесса демиелинизации и ремиелинизации.

Способ биовизуализации требует меньше времени и ресурсов для отслеживания биологического ответа в живых мышах.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 показана общая схема МВР-люциферазной трансгенной модели, которую используют для отслеживания изменений в экспрессии миелина в режиме реального времени.

На фигуре 2 показано, что эндогенный МВР-промотор имеет четыре элемента, которые дифференциально регулируют экспрессию МВР в олигодендроцитах в ходе развития животного и во взрослом состоянии. (HF Farhadi: J.Neurosc. 2003, 23 (32), 10214-10223). M1/M2, оба регулируют транскрипты ранних постнатальных стадий. М3 вовлечен в транскрипционную регуляции экспрессии у зрелого животного. М4 участвует в экспрессии транскриптов МВР в Шванновских клетках. Структура трансгена MBP-luci имеет две формы МВР-промотора. Линия 121 содержит элемент М4 и, как полагают, имеет экспрессию люциферазы в мозге, спинном мозге и периферической нервной системе. Линия 171 состоит из более короткого МВР-промотора (например, лишена элемента М4), и люцифераза в ней экспрессируется главным образом в мозге, что подтверждено анализом биовизуализации.

На фигуре 3 показана кассета для экспрессии трансгена MBP-luci, включающая МВР-промотор с 5 т.п.о. 5'-ДНК в векторе для экспрессии люциферазы.

На фигуре 4 показана кассета для экспрессии трансгена MBP-luci, включающая МВР-промотор с 10 т.п.о. 5'-ДНК в векторе для экспрессии люциферазы.

На фигуре 5 показан пример древа скрининга линии с трансгеном MBP-luci.

На фигуре 6 показаны изображения сигнала люциферазы in vivo из скрининга первого уровня исходных животных с MBP-luci. Интенсивность люциферазы колеблется от 10⁵ (+++) до 10³ (+) (фотонов/см²/с).

На фигуре 7 показан модельный организм, биовизуализацию которого проводили в семь недель (А) и в 10 месяцев (В), который иллюстрирует снижение интенсивности изображения сигнала люциферазы в мозге с возрастом, что коррелирует со снижением миелинизации, наблюдаемой после раннего постнатального развития.

На фигуре 8 показана in vivo биовизуализация мышей MBP-luci. Отрицательный трансген, мышь дикого типа (WT) находится слева с фоновой биолюминесценцией, измеренной в черепе (ROI: целевая область), которая равняется 2,7×10³ фотонов/с. Справа представлена гетерозиготная мышь MBP-luci, и биолюминесценция в ROI равняется 1,327×10⁵ фотонов/с. Гомозиготная мышь MBP-luci представлена в центре с величиной биолюминесценции в ROI, составляющей 3,2924×10⁵ фотонов/с, которая приблизительно превышает (как ожидалось) гетерозиготную величину в два раза.

На фигуре 9 показана ЦНС-специфичная экспрессия люциферазы во времени. Черепная биолюминесценция от MBP-luci-трансгенных мышей, как показано, снижается начиная с недели 4 (А и *) до недели 8 (В и **) и совпадает с уровнем транскриптов эндогенного МВР, определенных с помощью анализа Taqman (C).

На фигуре 10 показана специфичная и субрегиональная экспрессия люциферазы в мыши MBP-luci. Два сагиттальных среза (А и В) мозга трансгенной мыши MBP-luci с последующей биовизуализацией срезов выявили, что область мозолистого тела в мозге содержит наиболее интенсивный сигнал биолюминесценции и коррелирует с максимальной демиелинизацией и ремиелинизацией в модели поражения мозга, вызванного купризоном.

На фигуре 11 показана биовизуализация в модели MBP-luci и другие биологические ответы, которые, как известно, возникают при купризоновой диете. В данном случае купризоновую диету поддерживали в течение четырех недель, и результаты биовизуализации и клеточных изменений показаны слева на графике. Предполагается, что результаты еженедельной биовизуализации (указана стрелкой) изменяются параллельно уровню экспрессии эндогенного МВР (Matsushima GK and Morell P, Brain Pathology 11, 1-10, 2001).

На фигуре 12 показаны изменения мРНК эндогенного МВР в ответ на непрерывное воздействие купризоновой диеты у мышей C57 BL/6J дикого типа. 8-недельные мыши получали купризон в питании в течение интервала до 12 недель (закрашенные треугольники). Во второй группе (незакрашенные треугольники) купризон из питания был убран через 6 недель, и мышам давали восстановиться в течение интервала до 6 дополнительных недель. Данные по уровню мРНК представляют собой однократное определение с помощью Нозерн-блоттинга и представлены относительно среднего из трех контролей (Jurevics H, et al., Journal of Neurochemistry, 2002, 82, 126-136).

На фигуре 13 показано продемонстрированное влияние купризоновой диеты на модель биовизуализации, MBP-luci. Сигнал визуализации может ясно имитировать профиль экспрессии эндогенного гена МВР. Наблюдается двух-трехкратное снижение сигнала визуализации на протяжении кормления пищей, содержащей купризон (от недели 0 до недели 4), а также трех-четырехкратное увеличение сигнала визуализации после отмены питания с купризоном (от недели 4 до недели 7).

На фигуре 14 показано окрашивание люксолом быстрым синим (LFB) мозолистого тела в модели MBP-luci. Мыши получали либо купризон, либо нормальную пищу, в течение четырех недель, затем обе мыши были возвращены на обычную диету. Через 6 недель явную демиелинизацию в мозолистом теле (В) модели MBP-luci на купризоне можно было детектировать гистохимически с использованием окрашивания LFB по сравнению с группой на нормальной диете (А). Гистохимический анализ структурных изменений в миелинизации коррелировал с измерениями в сигнале биовизуализации у модели MBP-luci, получавшей воздействие.

На фигуре 15 показано, что действующее соединение - агонист рецептора дельта, активированного пролифератором пероксисом (PPARδ) (далее '517) - усиливает сигнал визуализации от люциферазы в линии 171 гетерозиготных мышей в течение периода спонтанной ремиелинизации. Восьминедельных мышей MBP-luci (линия 171 гетерозиготная, штамм B6C3H) помещали на диету, содержащую 0,2% купризона, в течение 4 недель, затем переводили на нормальную твердую диету, позволяя ремиелинизацию. Мышам затем перорально вводили дважды в день либо носитель (0,6%-ную натриевую соль карбоксиметилцеллюллозы и 0,5%-ный Tween 80) или 30 мг/мг действующего соединения агониста PPARδ '517, в течение 8 дней в указанных временных точках. Данные нормализовали по фоновым сигналам в нулевой неделе. Действующее соединение '517 (n=12) вызывало 30-100%-ное относительное повышение сигнала люциферазы по сравнению с группой носителя (n=12), которое объясняли эффектом соединения на стимуляцию дифференцировки клеток-предшественников олигодендроцитов (например, в соответствии с данными in vitro).

Фигура 16: действующее соединение агонист PPARδ, '517, усиливает окрашивание миелина люксолом быстрым синим (LFB) в течение фазы ремиелинизации (линия 171 гетерозиготная, штамм B6C3H). Парасагиттальные среды ткани фиксированного в формалине и заключенного в парафин мозга окрашивали LFB для качественной оценки миелина в мозолистом теле. Окрашенные среды для каждой временной точки оценивали и выставляли баллы по шкале от 0 (полная миелинизация) до 5 (полная демиелинизация). Система оценки была следующая: 0 = нормальный миелин, демиелинизация отсутствует, 1 = минимальная, локальная демиелинизация, 2 = слабая до средней, локальная демиелинизация, 3 = средняя, местами интенсивная демиелинизация, 4 = тяжелая, местами интенсивная демиелинизация, 5 = тяжелая, диффузная демиелинизация. Гистологическая оценка срезов LFB-окрашенного мозга мышей после 4 недель на купризоне подтвердила средне-тяжелую демиелинизацию мозолистого тела гетерозиготных мышей линии 171 (n=5). Обработка действующим соединением '517 (n=5) по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель (n=3), с 4 по 5 неделю в течение фазы ремиелинизации привела к заметному увеличению количества миелина, определенному с помощью окрашивания LFB на 7-й неделе. Несмотря на небольшое число животных в группах гистологические данные подтверждают in vivo данные биовизуализации люциферазы, указывая на увеличение ремиелинизации у мышей, обработанных соединением '517, по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель.

Фигура 17: агонист эстрогенового бета-рецептора (ERβ) (далее '5a) в количестве 30 мг/кг и положительный контроль Кветиапин в количестве 10 мг/кг обладают защитным действием в ходе фазы демиелинизации в купризоновой модели. Гетерозиготные мыши B6C3H линии 171 MBP-luc получали купризоновую диету в течение 4 недель, и им перорально вводили '5a (10 мг/кг или 30 мг/кг) или положительный контроль Кветиапин (QTP). Визуализацию мышей проводили в 0-ю неделю (базовая лини), данные 3-й недели и 4-й недели нормализовали на базовую линию 0-й недели. Группа QTP показывала значительное увеличение сигнала при визуализации относительно контроля носителя для двух временных точек 3-й и 4-й недели в концентрации 10 мг/кг. Результаты для группы, получавшей воздействие QTP, соответствовали данным, опубликованным Yanbo Zhang et al. под названием «Quetiapine alleviates the cuprizone-induced white matter pathology in brain of C57BL/6 mouse» (Schizophrenia Research, 2008, Dec 106, 182-91). Соединение '5a в количестве 30 мг/кг показывало усиленный сигнал по сравнению с носителем на 3-ю (тенденция) и 4-ю (достоверно) недели на купризоновой диете. '5a в количестве 10 мг/кг не давало значительного эффекта ни на 3-й, ни на 4-й неделе. Результаты позволяют предположить, что модель визуализации MBP-luci достаточно чувствительна для детекции дозозависимых изменений в купризоновой модели.

Фигура 18: группы, получавшие '5a (30 мг/кг) и QTP (10 мг/кг), имеют значительно более высокую активность трансгена по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, на 3-й и 4-й неделе. Данные модели визуализации подтверждают, что как QTP, так и '5a, ослабляют индуцированную купризоном демиелинизацию мозга и разрушение миелина.

На фигуре 19 показано сравнение сигнала визуализации купризоновой модели между гомозиготными и гетерозиготными мышами (B6C3H, линия 171). Поколение гетерозиготных мышей N3 скрещивали между собой для получения гомозиготных мышей по аллелю MBP-luci. Гомозиготные мыши показывали более чем двукратное окно сигнала биовизуализации относительно гомозиготных мышей в течение воздействия купризона. Две копии репортерного гена у гомозигот показывали более чем двукратное снижение сигнала в течение фазы демиелинизации (например, после 4 недель на купризоновой диете) и двукратное увеличение сигнала в течение фазы ремиелинизации (например, через 1 неделю после отмены купризоновой диеты и возврата на нормальный твердый корм).

Хотя данные демонстрируют, что гетерозиготная линия 171 (штамм B6C3H) работает в купризоновой модели и может детектировать эффекты соединений, модель можно дополнительно улучшить скрещиванием до гомозиготности для усиления интенсивности сигнала биовизуализации. Это также упрощает получение модели и снижает расходы на генотипирование, поскольку колонии мышей можно содержать как гомозиготные. В общем, большее окно визуализации может расширить детекции эффектов соединений в исследованиях характеристик фармакологических соединений.

Фигура 20: микрофотография мозолистого тела (темная продольная структура в квадратных скобках - 201) в парасагиттальном срезе ткани из фиксированного в формалине и заключенного в парафин мозга мыши, окрашенном LFB, демонстрирует оценку миелинового статуса области белого вещес