Вращающаяся платформа для проведения секвенирования нуклеиновых кислот

Вращающаяся платформа для проведения секвенирования нуклеиновых кислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу и устройству для проведения анализа. В частности, настоящее изобретение относится к вращающейся платформе, которая может применяться для проведения анализа, в частности многоэтапных видов анализа. Тогда как настоящее изобретение было разработано прежде всего для секвенирования нуклеиновых кислот путем пиросеквенирования, и будет описываться далее в настоящем документе со ссылкой на данную заявку, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается данной конкретной областью применения.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Нижеследующее обсуждение известного уровня техники приведено для того, чтобы разместить настоящее изобретение в надлежащем техническом контексте и обеспечить лучшее понимание его преимуществ. Следует понимать, однако, что любое обсуждение известного уровня техники в тексте всего описания изобретения не следует рассматривать в качестве явного или подразумеваемого признания того, что такой известный уровень техники является широко известным или составляет часть общего знания в данной области техники.

В последнее время возможность определять нуклеотидные последовательности ДНК приобретает все большее значение. Ранее двумя наиболее часто применяемыми способами ДНК-секвенирования являлись способ ферментативного обрыва цепи и способ химического расщепления, которые оба основываются на гель-электрофорезе для растворения, в соответствии с их размером, фрагментов ДНК, полученных из более крупного сегмента ДНК. Этап электрофореза и детектирование разделенных фрагментов ДНК представляют собой трудоемкие процедуры. Однако, хотя автоматизированные установки для электрофореза имеются в продаже, электрофорез не очень хорошо подходит для крупномасштабных геномных проектов или клинического секвенирования, где необходимы относительно экономически эффективные установки с высокой производительностью. Таким образом, имеется высокая потребность в разработке способов секвенирования, отличных от электрофореза.

Способы секвенирования, основывающиеся на концепции обнаружения неорганического пирофосфата (PPi), который выделяется при полимеразной цепной реакции, были описаны ранее (см. международные публикации PCT №№ WO 93/23564 и WO 89/09283) и обычно называются пиросеквенированием. По мере того как каждый нуклеотид присоединяется к растущей цепи нуклеиновой кислоты в ходе полимеразной цепной реакции, высвобождается молекула пирофосфата. Было обнаружено, что пирофосфат, который высвобождается в этих условиях, может детектироваться ферментативно, например, по генерации света в реакции люциферазы-люциферина. Такие способы позволяют идентифицировать основание в целевом положении и легко и быстро секвенировать ДНК, избегая необходимости применения электрофореза и использования вредных радиоактивных меток

В ранних из известных в данной области техники способов проведения пиросеквенирования использовали микроцентрифужную пробирку объемом 0,2 мл (или аналогичную), в которую последовательно вносились реагенты чтобы детектировать последовательность ДНК, присутствующей в пробирке. Хотя этот способ является относительно простым, его недостатком являются короткие длины результатов считывания, поскольку реакционная смесь разбавляется при каждом добавлении реагента-нуклеотида и/или накапливаются побочные продукты реакции и условия реакции достигают точки, в которой реакция больше не идет. Например, обычно только приблизительно 80 оснований могут быть гарантировано секвенированы с применением этого способа.

Также было разработано коммерческое оборудование, которое использует пиросеквенирование. Эти системы используют проточные ячейки для проведения гибридизации целевой молекулы ДНК/РНК. Вкратце, одноцепочечную ДНК иммобилизуют на стационарной грануле, которая расположена в проточной ячейке, обычно путем иммобилизации двухцепочечной ДНК и денатурации комплементарной цепи. Реагенты, в том числе нуклеотиды (A, G, С или Т), текут мимо гранулы, и световой луч детектирует встраивание нуклеотида в цепь ДНК. Сила светового сигнала пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в течение одной реакции. Между этапами воздействия на гранулу различных нуклеотидов, выполняют также этап отмывания, и процесс повторяют чтобы детектировать встраивание следующего нуклеотида.

Также известны другие способы секвенирования путем синтеза, например, с помощью флуоресцентно-меченых нуклеотидов. При таком способе образцы ДНК сначала фрагментируют, а двойную спираль ДНК расплавляют на отдельные нити. Отдельные молекулы ДНК захватываются на поверхности в пределах проточной ячейки и служат матрицами для процесса секвенирования посредством синтеза. Флуоресцентно меченные нуклеотиды добавляют по одному и они встраиваются в растущую комплементарную цепь с помощью фермента ДНК-полимеразы. Неиспользованные нуклеотиды вымывают. При облучении лазером, встроившиеся нуклеотиды излучают свет, который детектируют. Флуоресцентную метку удаляют до добавления следующего нуклеотида для продолжения цикла. Отслеживание встраивания нуклеотидов позволяет определить точную последовательность каждой отдельной молекулы ДНК.

Также известно секвенирование лигированием. При таком способе ДНК-секвенирования применяют фермент ДНК-лигазу для идентификации нуклеотидов, присутствующих в данном положении в последовательности ДНК. Чувствительность фермента ДНК-лигазы к нарушению комплементарности используют для того, чтобы определить основную последовательность целевой молекулы ДНК. См., например, патенты США №№5750341 и 4883750.

Существует необходимость в устройстве для проведения различных видов количественного и качественного анализа, которое может применяться для различных химических веществ и способов детектирования, и, в частности, для проведения тех видов анализа, которые включают несколько этапов реакции и отмывания, такие как используемые в секвенировании нуклеиновых кислот. Дополнительно, необходимо устройство, которое может использоваться в качестве удобной замены для тех видов анализа, которые требуют использования проточный среды, или замены видов анализа, использующих фиксированный реакционный сосуд, где, в случае секвенирования нуклеиновых кислот, накопление побочных продуктов может ограничить максимальную длину результата считывания при секвенировании.

Целью настоящего изобретения является преодоление или улучшение по меньшей мере одного из указанных выше недостатков известного уровня техники или обеспечение подходящей альтернативы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу применения вращающейся платформы, имеющей по меньшей мере одну ячейку, предназначенную для содержания несущей поверхности, и в каждую ячейку можно помещать по меньшей мере одну несущую поверхность. Несущая поверхность приспособлена для связывания или иммобилизации первого или второго партнера по связыванию в первой и второй паре партнеров по связыванию. Первая и вторая пары партнеров по связыванию являются частью анализа, где анализ предпочтительно представляет собой секвенирование нуклеиновой кислоты, и более предпочтительно пиросеквенирование. Реагенты для анализа количественно вносят в ячейку и приводят в контакт с несущей поверхностью из точки, расположенной за пределами платформы. Использованные или израсходованные реагенты могут быть удалены центрифугированием при достаточном вращении платформы, а несущие поверхности удерживаются в ячейке во время центрифугирования. Любой способ удержания несущих поверхностей попадает в сферу настоящего изобретения, и только в качестве примера, несущие поверхности предпочтительно представляют собой магнитные гранулы, а для удержания магнитных гранул в ячейках во время центрифугирования применяют магнит. В контексте пиросеквенирования, предпочтительно одноцепочечную ДНК (оцДНК) выделяют с применением подхода отмывания центрифугированием. Реагенты можно удалять после каждого нового добавления реагента или после нескольких добавлений. На этапе отмывания центрифугированием несущую поверхность высушивают и готовят к следующему реагенту, а также удаляют нежелательные побочные продукты анализа. Настоящее изобретение также относится к устройству для вращения платформы и удержания несущей поверхности внутри соответствующей ячейки, и к наборам, содержащим платформу и несущую поверхность.

В соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение обеспечивает способ для проведения секвенирования нуклеиновых кислот, при этом указанный способ включает этапы:

обеспечения платформы, имеющей по меньшей мере одну ячейку, предназначенную для содержания по меньшей мере одной несущей поверхности;

обеспечения по меньшей мере одной указанной несущей поверхности внутри каждой указанной ячейки, где указанная несущая поверхность приспособлена для иммобилизации первого партнера по связыванию; связывания или иммобилизации указанного первого партнера по связыванию с указанной несущей поверхностью; и

количественного внесения реагента в каждую указанную ячейку из точки, расположенной за пределами платформы, где после указанного этапа количественного внесения указанную платформу вращают со скоростью, достаточной для того, чтобы любой остаточный или непрореагировавший указанный реагент был практически удален центрифугированием из каждой указанной ячейки и/или с каждой указанной несущей поверхности,

при этом во время вращения каждую указанную несущую поверхность удерживают в каждой указанной ячейке.

Предпочтительно секвенирование нуклеиновых кислот представляет собой пиросеквенирование.

Предпочтительно несущая поверхность представлена в форме магнитной частицы, и указанная магнитная частица удерживается в указанной ячейке за счет сил магнитного взаимодействия путем размещения магнита достаточно близко к указанной платформе для удержания за счет сил магнитного взаимодействия указанной магнитной частицы (частиц) в указанной ячейке во время вращения указанной платформы. Предпочтительно магнит представлен в форме пластины или кольца и располагается под платформой. В предпочтительных вариантах осуществления магнитная пластина или магнитное кольцо дополнительно может нагревать указанную ячейку (ячейки) до температуры приблизительно 150°C с нагреванием, таким образом, указанной несущей поверхности. Однако в альтернативном варианте осуществления для удержания за счет сил магнитного взаимодействия указанной магнитной частицы (частиц) в указанной ячейке во время вращения указанной платформы используют электромагнит.

В предпочтительных вариантах осуществления платформа является практически круглой, и указанные ячейки расположены по периферии указанной круглой платформы. Предпочтительно приблизительно от 2 до 500 ячеек расположены по периферии указанной платформы, и диаметр указанной платформы составляет приблизительно от 50 до 500 мм, а толщина указанной платформы составляет приблизительно от 1 до 6 мм. Предпочтительно ячейки содержат объем, составляющий приблизительно от 0,5 до 100 мкл или глубина ячейки составляет приблизительно от 0,5 до 5 мм. Предпочтительно размеры ячеек таковы, что ячейки могут содержать приблизительно от 1 до приблизительно 50 дискретных несущих поверхностей.

В альтернативном варианте осуществления ячейка содержит углубление для размещения в ней указанной несущей поверхности на время вращения указанной платформы, где указанное углубление содержит фильтр, позволяющий удерживать указанную несущую поверхность, и в то же время позволяющий указанному реагенту проходить через него во время вращения указанной платформы, таким образом, чтобы любой остаточный или непрореагировавший реагент был практически удален центрифугированием из каждой указанной ячейки и/или с каждой указанной несущей поверхности.

Предпочтительно платформа изготовлена из пластикового материала, выбранного из группы, состоящей из поликарбоната, полистирола, ударопрочного полистирола, полиэтилена и полипропилена, или изготовлена из стекла или кварца. Предпочтительно на периферии указанной платформы расположен желоб для приема отработанных жидкостей, которые выносят или удаляют под действием центробежных сил с поверхности указанной платформы во время вращения.

Предпочтительно первый партнер по связыванию адсорбируется на указанной несущей поверхности за счет химических свойств или связывается с ней за счет ковалентных, или ионных, или водородных связей, или ван-дер-Ваальсовы силы иммобилизуют указанный первый партнер по связыванию на указанной несущей поверхности.

Предпочтительно серию реагентов количественно вносят в каждую указанную ячейку, и первый реагент из серии включает второй партнер по связыванию к первому партнеру по связыванию, а последующие реагенты выбирают из реагентов для отмывания и/или для промывки реагентов для создания детектируемого сигнала. Предпочтительно способ настоящего изобретения дополнительно включает этап анализа секвенирования нуклеиновых кислот во время и/или после каждого из указанных этапов количественного внесения.

Предпочтительно способ настоящего изобретения дополнительно включает этап вращения вращающейся платформы со скоростью приблизительно от 10 до 200 об./мин во время количественного внесения указанного реагента, и вращение вращающейся платформы со скоростью более 400 об./мин, чтобы практически удалить центрифугированием указанный реагент из указанных ячеек. Предпочтительно платформа вращается с достаточно низкой скоростью на этапах количественного внесения, чтобы избежать удаления реагента центрифугированием из ячеек, и вращается с достаточно высокой скоростью на этапах отмывания или сушки, чтобы удалить реагент центрифугированием из 10 ячеек. Предпочтительно достаточно высокие скорости представляют собой скорости более 400 об./мин и могут составлять 1000, 2000, 3000, 4000 об./мин или выше.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления платформа вибрирует в достаточной степени, чтобы тщательно смешать указанный реагент и указанную несущую поверхность (поверхности).

В соответствии со вторым аспектом настоящее изобретение представляет набор, включающий платформу, имеющую по меньшей мере одну ячейку, которая может содержать одну или несколько несущих поверхностей, и по меньшей мере одну несущую поверхность в составе набора, где указанная несущая поверхность приспособлена для иммобилизации первого партнера по связыванию. Предпочтительно несущая поверхность содержится в указанной ячейке, где съемную одноразовую накладку приклеивают к поверхности указанной платформы для удержания указанной несущей поверхности в указанной ячейке. Предпочтительно набор содержит один или несколько реагентов для проведения секвенирования нуклеиновых кислот, и в частности для пиросеквенирования.

В соответствии с третьим аспектом настоящее изобретение представляет устройство для проведения секвенирования нуклеиновых кислот, при этом указанное устройство включает:

устройство для вращения вращающейся платформы с заданной контролируемой скоростью вращения по выбору пользователя;

устройство для приведения магнита в действие по отношению к указанной вращающейся платформе для удерживания магнитной частицы в ячейке указанной платформы;

факультативное устройство для количественного внесения первого партнера по связыванию в указанную ячейку для иммобилизации указанного первого партнера по связыванию на указанной магнитной частице;

устройство для количественного внесения реагента в указанную ячейку; и

факультативное устройство для количественного внесения реагента для отмывания.

В соответствии с четвертым аспектом настоящее изобретение представляет способ для проведения секвенирования нуклеиновых кислот, при этом указанный способ включает этапы:

обеспечения платформы, имеющей по меньшей мере одну ячейку, предназначенную для содержания по меньшей мере одной несущей поверхности;

обеспечения по меньшей мере одной указанной несущей поверхности внутри каждой указанной ячейки, где указанная несущая поверхность приспособлена для иммобилизации второго партнера по связыванию;

избирательного связывания или избирательной иммобилизации указанного второго партнера по связыванию на указанной области-поверхности; и

количественного внесения реагента в каждую указанную ячейку из точки, расположенной за пределами платформы, где после указанного этапа количественного внесения указанную платформу вращают со скоростью, достаточной для того, чтобы любой остаточный или непрореагировавший указанный реагент был практически удален центрифугированием из каждой указанной ячейки и/или с каждой указанной несущей поверхности,

при этом во время вращения каждую указанную несущую поверхность удерживают в каждой указанной ячейке.

Предпочтительно первый партнер по связыванию уже адсорбировался на указанной несущей поверхности за счет химических свойств или связывается с ней за счет ковалентных, или ионных, или водородных связей, или силы Ван-дер-Ваальса иммобилизуют первого партнера по связыванию на указанной несущей поверхности, а указанный второй партнер по связыванию может связываться или вступать в реакцию с указанным первым партнером по связыванию, который уже связан с указанной несущей поверхностью.

Предпочтительно серию реагентов количественно вносят в каждую указанную ячейку, и первый реагент из серии включает второй партнер по связыванию к первому партнеру по связыванию, а последующие реагенты выбирают из реагентов для отмывания и/или для промывки.

В соответствии с пятым аспектом настоящее изобретение представляет набор, включающий платформу, имеющую по меньшей мере одну ячейку, которая может содержать одну или несколько несущих поверхностей, и по меньшей мере одну несущую поверхность, где указанная несущая поверхность приспособлена к избирательному связыванию или иммобилизации второго партнера по связыванию.

В соответствии с шестым аспектом настоящее изобретение представляет устройство для проведения секвенирования нуклеиновых кислот, такого как пиросеквенирование, при этом указанное устройство включает:

устройство для вращения вращающейся платформы с заданной контролируемой скоростью вращения по выбору пользователя;

устройство для приведения магнита в действие по отношению к указанной вращающейся платформе для удерживания магнитной частицы в ячейке указанной платформы;

факультативное устройство для количественного внесения указанного второго партнера по связыванию в указанную ячейку для избирательной иммобилизации указанного второго партнера по связыванию на указанной магнитной частице;

устройство для количественного внесения реагента в указанную ячейку; и

факультативное устройство для количественного внесения реагента для отмывания.

В соответствии с седьмым аспектом настоящее изобретение представляет способ для проведения секвенирования цепи нуклеиновой кислоты, при этом указанный способ включает этапы:

обеспечения платформы, имеющей по меньшей мере одну ячейку, предназначенную для содержания по меньшей мере одной несущей поверхности;

обеспечения по меньшей мере одной указанной несущей поверхности внутри каждой указанной ячейки, где указанная несущая поверхность приспособлена для иммобилизации партнера по связыванию цепи нуклеиновой кислоты;

связывания или иммобилизации указанного партнера по связыванию цепи нуклеиновой кислоты на указанной несущей поверхности, а затем избирательного связывания или избирательной иммобилизации цепи нуклеиновой кислоты на указанной несущей поверхности;

факультативных денатурации и удаления любой комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, отжига праймера для секвенирования с указанной несущей поверхностью; и

количественного внесения последовательно в каждую указанную ячейку из точки, расположенной за пределами платформы, серии реагентов, включающей нуклеотиды А, Т, G и/или С или соответствующие подходящие аналоги нуклеотидов, где после каждого или любого из указанных этапов количественного внесения указанную платформу вращают с достаточной скоростью, такой, чтобы практически любой остаточный или непрореагировавший указанный реагент был практически удален центрифугированием из каждой указанной ячейки и/или с каждой указанной несущей поверхности,

при этом во время вращения каждую указанную несущую поверхность удерживают в каждой указанной ячейке.

Предпочтительно цепь нуклеиновой кислоты является цепью ДНК или РНК или их модифицированной формой. Предпочтительно секвенирование цепи нуклеиновой кислоты представляет собой пиросеквенирование.

Предпочтительно цепь нуклеиновой кислоты является биотинилированной, а партнер по связыванию цепи нуклеиновой кислоты содержит авидин, или стрептавидин, или аналог для связывания с биотинилированной цепью нуклеиновой кислоты.

Предпочтительно каждую указанную несущую поверхность последовательно приводят в контакт с серией реагентов, включающей нуклеотиды А, Т, G и/или С.

Предпочтительно этап последовательного приведения в контакт/количественного внесения включает любое из следующего:

a.) каждый нуклеотид или его аналог добавляют отдельно и последовательно в любом необходимом или заранее заданном порядке,

b.) нуклеотиды A+T+G+C или любую заранее заданную или необходимую подгруппу этих нуклеотидов добавляют в виде смеси, и смесь добавляют снова и т.д.

Предпочтительно дополнительно включают этап анализа указанной цепи нуклеиновой кислоты во время и/или после каждого из указанных этапов количественного внесения. Предпочтительно анализ включает детектирование следующей пары оснований в указанной цепи нуклеиновой кислоты путем сопоставления исходящего светового сигнала с числом нуклеотидов, которые связались с цепью нуклеиновой кислоты.

Предпочтительно этап денатурации включает нагревание цепи нуклеиновой кислоты для осуществления денатурации, или воздействие на цепь нуклеиновой кислоты среды с повышенным pH.

Предпочтительно способ включает этап, на котором после того как указанную цепь нуклеиновой кислоты денатурируют комплементарную цепь удаляют с помощью этапа промывки реагентом для промывки.

Предпочтительно каждую указанную несущую поверхность готовят для каждого указанного последующего реагента путем достаточного высушивания указанной несущей поверхности вращением указанной платформы для того, чтобы практически удалить центрифугированием любые остаточные реагенты, таким образом, чтобы практически отсутствовало загрязнение указанной несущей поверхности реагентом.

В соответствии с восьмым аспектом настоящее изобретение представляет набор для проведения секвенирования цепи нуклеиновой кислоты; указанный набор включает вращающуюся платформу, имеющую по меньшей мере одну ячейку, предназначенную для содержания одной или нескольких несущих поверхностей, и по меньшей мере одну несущую поверхность, где указанная несущая поверхность приспособлена для иммобилизации партнера по связыванию цепи нуклеиновой кислоты.

В соответствии с девятым аспектом настоящее изобретение представляет применение набора в соответствии с восьмым аспектом для проведения секвенирования цепи нуклеиновой кислоты. Предпочтительно анализ представляет собой пиросеквенирование.

В соответствии с десятым аспектом настоящее изобретение представляет устройство для секвенирования цепи нуклеиновой кислоты, при этом указанное устройство включает:

устройство для вращения вращающейся платформы с заданной контролируемой скоростью вращения по выбору пользователя;

устройство для приведения магнита в действие по отношению к указанной вращающейся платформе для удерживания магнитной частицы в ячейке указанной вращающейся платформы;

факультативное устройство для количественного внесения партнера по связыванию цепи нуклеиновой кислоты в указанную ячейку для иммобилизации указанного партнера по связыванию цепи нуклеиновой кислоты на указанной магнитной частице;

факультативное устройство для количественного внесения цепи нуклеиновой кислоты в указанную ячейку для избирательной иммобилизации указанной цепи нуклеиновой кислоты на указанной магнитной частице;

факультативное устройство для денатурации и факультативного удаления любой комплементарной цепи нуклеиновой кислоты;

устройство для количественного внесения нуклеотидов А, Т, G и/или С или их соответствующих аналогов или их комбинаций в указанную ячейку;

устройство для количественного внесения реагента для отмывания; и

факультативное устройство для количественного внесения одного или нескольких ферментных растворов.

В соответствии с одиннадцатым аспектом настоящее изобретение представляет способ проведения секвенирования цепи нуклеиновой кислоты, при этом указанный способ включает этапы:

обеспечения платформы, имеющей по меньшей мере одну ячейку, предназначенную для содержания по меньшей мере одной несущей поверхности;

обеспечения по меньшей мере одной указанной несущей поверхности внутри каждой указанной ячейки, где указанная несущая поверхность приспособлена к избирательной иммобилизации цепи нуклеиновой кислоты;

избирательного связывания или избирательной иммобилизации цепи нуклеиновой кислоты на указанной несущей поверхности;

факультативных денатурации и удаления любой комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, отжига праймера для секвенирования с указанной несущей поверхностью; и

количественного внесения последовательно в каждую указанную ячейку из точки, расположенной за пределами указанной платформы, серии реагентов, включающей нуклеотиды А, Т, G и/или С или соответствующие подходящие аналоги нуклеотидов, при этом после каждого или любого из указанных этапов количественного внесения указанную платформу вращают со скоростью, достаточной для того, чтобы любой остаточный или непрореагировавший указанный реагент был практически удален центрифугированием из каждой указанной ячейки и/или с каждой указанной несущей поверхности,

при этом во время вращения каждую указанную несущую поверхность удерживают в каждой указанной ячейке.

Предпочтительно на несущей поверхности уже имеется иммобилизованный партнер по связыванию цепи нуклеиновой кислоты, и при этом указанная цепь нуклеиновой кислоты избирательно связывается с указанным партнером по связыванию цепи нуклеиновой кислоты. Предпочтительно цепь нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК или РНК или их модифицированную форму. Предпочтительно цепь нуклеиновой кислоты является биотинилированной, и первый партнер по связыванию содержит авидин, или стрептавидин, или аналог для связывания с биотинилированной цепью нуклеиновой кислоты.

В соответствии с двенадцатым аспектом настоящее изобретение представляет набор, включающий вращающуюся платформу, имеющую по меньшей мере одну ячейку, предназначенную для содержания одной или нескольких несущих поверхностей, и по меньшей мере одну несущую поверхность, где указанная несущая поверхность приспособлена для избирательной иммобилизации цепи нуклеиновой кислоты.

В соответствии с тринадцатым аспектом настоящее изобретение представляет применение набора в соответствии с двенадцатым аспектом для проведения секвенирования цепи нуклеиновой кислоты.

B соответствии с четырнадцатым аспектом настоящее изобретение представляет устройство для секвенирования цепи нуклеиновой кислоты, при этом указанное устройство включает:

устройство для вращения вращающейся платформы с заданной контролируемой, скоростью вращения по выбору пользователя;

устройство для приведения магнита в действие по отношению к указанной вращающейся платформе для удерживания магнитной частицы в ячейке указанной вращающейся платформы;

факультативное устройство для количественного внесения цепи нуклеиновой кислоты в указанную ячейку для иммобилизации указанной цепи нуклеиновой кислоты на указанной несущей поверхности;

факультативное устройство для денатурации и факультативного удаления любой комплементарной цепи нуклеиновой кислоты;

устройство для количественного внесения нуклеотидов А, Т, G и/или С или их соответствующих аналогов или их комбинаций для приведения их в контакт с указанной несущей поверхностью;

устройство для количественного внесения реагента для отмывания; и факультативное устройство для количественного внесения одного или нескольких ферментных растворов.

В некоторых вариантах осуществления вращающаяся платформа содержит множество относительно неглубоких ячеек, которые содержат объем, составляющий от приблизительно 0,5 до 100 мкл или имеют глубину ячейки приблизительно от 0,5 до 3 мм. В других вариантах осуществления, ячейки являются относительно глубокими, с глубиной приблизительно от 5 до 8 мм для того, чтобы содержать магнитные гранулы, которые сами приспособлены для иммобилизации первого партнера по связыванию или приспособлены для избирательной иммобилизации второго партнера по связыванию. В данном примере, гранулы считаются дискретными областями, и одна или несколько гранул могут содержаться в каждой ячейке.

Первый или второй партнеры по связыванию предпочтительно обладают способностью связываться с гранулами, которые предпочтительно представляют собой магнитные гранулы. Следует понимать, что если используют магнитные гранулы, то ячейка имеет достаточную глубину и объем для того, чтобы содержать гранулы таким образом, чтобы они не смещались под действием центробежных сил во время вращения диска/платформы. В предпочтительных вариантах осуществления система способна удерживать магнитные гранулы внутри каждой ячейки при поднятии магнитного кольцевидного диска к нижней стороне диска/платформы с образцами или при активировании электромагнита. В данном примере магнитные гранулы могут содержаться в ячейках, и можно применять достаточную центробежную силу при вращении платформы для того, чтобы практически высушить гранулы от любого окружающего их реагента. Также следует понимать, что платформа может содержать множество концентрически расположенных круглых рядов ячеек. В некоторых вариантах осуществления первый партнер по связыванию адсорбирован за счет химических свойств на поверхности гранулы или частицы. В других вариантах осуществления первый партнер по связыванию связан ковалентной, или ионной, или водородной связью с поверхностью гранулы или частицы, и в еще других вариантах осуществления силы Ван-дер-Ваальса удерживают первый партнер по связыванию на поверхности гранулы или частицы. Следует понимать, что второй партнер по связыванию может связываться или вступать в реакцию с первым партнером по связыванию, который уже связан с поверхностью гранулы или частицы.

Настоящее изобретение прежде всего касается способов и видов анализа, таких как способы секвенирования нуклеиновых кислот, например, пиросеквенирование. Например, первый и второй партнеры по связыванию представляют собой пары партнеров по связыванию (факультативно один из которых может быть меченным для детектирования), которые предпочтительно выбраны из авидина, или стрептавидина, или стрептацина, или аналогов и биотина, или аналогов.

Однако, и как дополнительно обсуждают ниже, преимущество настоящего изобретения заключается в обеспечении относительно быстрых и относительно простых этапов отмывания, и связанных с ними малых объемов отходов раствора для отмывания и реагентов для отмывания.

Настоящее изобретение будет далее поясняться в контексте пиросеквенирования, однако, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается этим анализом.

Следует понимать, что в первом варианте осуществления несущая поверхность, удерживаемая внутри ячейки, приспособлена для иммобилизации первого партнера по связыванию, которым может быть, например, авидин, или стрептавидин, или стрептацин, или аналоги, а затем авидин, или стрептавидин, или стрептацин, или аналоги могут быть впоследствии введены в реакцию с, например, биотинилированными молекулами ДНК, на последующем этапе обработки. Дополнительно следует понимать, что во втором варианте осуществления несущая поверхность уже содержит первый партнер по связыванию, и эта поверхность приспособлена для избирательной иммобилизации второго партнера по связыванию. Поэтому следует понимать, что несущая поверхность в соответствии с первым вариантом осуществления может считаться «нефункционализированной», а несущая поверхность в соответствии со вторым вариантом осуществления может считаться «функционализированной» или «префункционализированной».

Предпочтительно первый из серии реагентов включает второй, или комплементарный, партнер по связыванию к первому партнеру по связыванию, а затем последующие реагенты выбраны из, например, реагентов для отмывания или для промывки, которые дополнительно обсуждаются ниже.

Предпочтительно способ настоящего изобретения дополнительно включает этап анализа секвенирования нуклеиновых кислот во время и/или после каждого из указанных этапов приведения в контакт или количественного внесения. В предпочтительных вариантах осуществления, перед приведением в контакт несущей поверхности с последующим реагентом, каждая указанная несущая поверхность проходит этап отмывания или промывки реагентом для отмывания. Реагентом для отмывания может быть любой реагент, который может в достаточной мере вымыть любые остатки раствора после предыдущего этапа приведения в контакт или уменьшить количество остатков раствора и компонентов, присутствующих в указанном растворе (активные средства, как, например, апираза или другие подходящие ферменты, которые вызывают расщепление побочных продуктов или другим образом снижают концентрацию побочных продуктов).

Хотя реагентом для отмывания может быть любой реагент, который способен в достаточной мере вымыть любые остатки раствора от предыдущего этапа приведения в контакт/количественного внесения или уменьшить количество любого остаточного раствора и компонентов, присутствующих в указанном растворе, и может представлять собой активное средство, такое как апираза, в других вариантах осуществления предпочтительно этап отмывания для удаления излишков нуклеотида не содержит апиразы, как подробно описано в публикации Mashayekhi F., and Ronaghi M., Analysis of read-length limiting factors in pyrosequensing chemistry, Anal. Biochem. (2007), 363(2): 275-287, которая включена в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки. Как подробно 5 описано в публикации Mashayekhi et al, показано, что замена этапа отмывания на этап отмывания без апиразы, повышает длину результата считывания при пиросеквенировании.

Предпочтительно вращающаяся платформа вращается с низкой скоростью во время количественного внесения реагентов, например, со скоростью от приблизительно 10 до 200 об./мин, чтобы избежать удаления реагентов, добавленных в целевой участок; и платформа вращается с высокой скоростью во время количественного внесения реагентов, например, со скоростью от приблизительно 400 до 2000 об./мин. Однако следует понимать, что возможны и другие скорости вращения.

В предпочтительных вариантах осуществления, каждую указанную несущую поверхность готовят для каждого указанного последующего реагента путем достаточного «высушивания» указанной несущей поверхности за счет вращения указанной платформы для того, чтобы удалить центрифугированием любые остатки реагентов, таким образом, чтобы загрязнение указанной поверхности реагентом с предыдущего этапа была в достаточной мере снижено, предпочтительно практически отсутствовало.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение представляет применение комбинации платформы и несущей поверхности