Гибридные белки npp1

Гибридные белки npp1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет на основании международной заявки PCT/US 2011/028233, поданной 11 марта 2011 года, которая испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/340066, поданной 12 марта 2010 года. Содержание упомянутых выше заявок включено в данный документ при помощи ссылки во всей их полноте.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Эктонуклеотидная пирофосфатаза/фосфодиэстераза 1 (NPP1/ENPP1/PC-1) представляет собой трансмембранный гликопротеин II типа, который образует гомодимер. Белок расщепляет ряд субстратов, включая фосфодиэфирные связи нуклеотидов и нуклеотидных сахаров и пирофосфатные связи нуклеотидов и нуклеотидных сахаров. Белок NPP1 функционирует с осуществлением гидролиза нуклеозид-5′-трифосфата до одного из соответствующих монофосфатов и также гидролизирует диаденозинполифосфаты. Мутации в гене NPP1 ассоциированы с идиопатической инфантильной артериальной кальцификацией (IIAC), инсулинорезистентностью, гипофосфатемическим рахитом и оссификацией задней продольной связки позвоночника.

IIAC - редкое аутосомно рецессивное нарушение, которое почти всегда приводит к смертельному исходу, характеризуется кальцификацией внутренней эластической мембраны мышечных артерий и стенозом вследствие миоинтимальной пролиферации. Во всем мире описано более 160 случаев IIAC. Симптомы заболевания наиболее часто проявляются в раннем младенчестве, и заболевание приводит к летальному исходу в возрасте до 6 месяцев, как правило, вследствие ишемической кардиомиопатии и других осложнений обструктивной артериопатии, в том числе стеноза почечной артерии. В более десяти описанных случаев IIAC периартикулярная кальцификация крупных суставов также развилась в младенчестве. Rutsch et al. (2003) сообщили, что мутации в ENPP1 ассоциированы с IIAC, которая характеризуется спонтанной периартикулярной и аортальной кальцификацией на раннем этапе жизни и системным снижением активности нуклеотидной пирофосфатазы/фосфодиэстеразы у пораженных индивидов.

Хотя дефекты в белке NPP1 связаны с таким серьезным заболеванием как IIAC, не существует лечения, доступного в данной области техники, для тех, кто поражен этим заболеванием. Таким образом, существует крайняя необходимость в эффективной и безопасной композиции, составе и лекарственном препарате для лечения IIAC, инсулинорезистентности, гипофосфатемического рахита и оссификации задней продольной связки позвоночника.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает гибридные белки из усеченных доменов NPP1 (т.е. NPP1-компонент), слитых с нацеливающим фрагментом. Нацеливающий фрагмент функционирует с увеличением эффективности при нацеливании гибридного белка NPP1 на участок, имеющий клиническое или биологическое значение (например, участок кальцификации у субъекта, который нуждается в снижении кальцификации). Без ограничения настоящего изобретения любой конкретной теорией или механизмом действия предполагается, что NPP1-компонент функционирует с ингибированием кальцификации путем увеличения образования пирофосфата (PPi), и/или путем расщепления пирофосфата с продуцированием растворимого фосфата (Pi), и/или путем повышения доступности аденозинмонофосфата (AMP) и/или аденозина. Предполагается, что нацеливающий фрагмент можно присоединить к N-концу и/или С-концу NPP1-компонента по любому подходящему положению. Кроме того, гибридный белок NPP1, раскрытый в данном документе, также может включать один или несколько Fc-фрагментов, PEG, полипептидный линкер или другие дополнительные полипептиды для увеличения ферментативной активности, стабильности или нацеливания.

Гибридные белки по настоящему изобретению можно применять для лечения широкого спектра состояний субъекта. Любое состояние, которое можно успешно лечить путем введения гибридного белка по настоящему изобретению, охвачено объемом настоящего изобретения. Например, лечение состояний, которые можно улучшить путем снижения и/или устранения одного или нескольких кальцификатов, и/или предупреждение образования кальцификатов у субъекта, такого как млекопитающее, например пациент-человек, охвачено объемом настоящего изобретения. Предполагается лечение состояний, таких как закупорка артерий, с использованием гибридных белков по настоящему изобретению. В одном особенно подходящем варианте осуществления состояние, которое подлежит лечению, представляет собой генерализованную артериальную кальцификацию у новорожденных, также называемую идиопатической артериальной кальцификацией у новорожденных и кальцификацией средней оболочки артерий у новорожденных. Также предполагается лечение таких состояний, как инсулинорезистентность, гипофосфатемический рахит и оссификация задней продольной связки позвоночника.

Гибридные белки по настоящему изобретению могут продуцироваться в любой пригодной системе экспрессии белков, в том числе без ограничения клеточной культуре (например, клетки СНО, клетки COS, HEK203), бактериях, таких как Escherichia coli (Е.coli), и трансгенных животных, в том числе без ограничения млекопитающих и птицах (например, куры, перепел, утка и индейка).

Получение фармацевтических композиций (или фармацевтических составов) хорошо известно из уровня техники, и предполагается применение таких фармацевтических композиций в соответствии с гибридными белками по настоящему изобретению.

Как правило, дозировка гибридного белка, который вводится субъекту, будет варьировать в зависимости от известных факторов, таких как возраст, состояние здоровья и вес того, кто его получает, тип сопутствующего лечения, частота лечения и т.п. Как правило, дозировка активного ингредиента (например, гибридного белка) может составлять от приблизительно 0,0001 миллиграмма до приблизительно 50 миллиграмм на килограмм веса тела. Точная дозировка, частота введения и продолжительность лечения может определяться врачом, являющимся специалистом в данной области техники, связанной с введением терапевтических белков.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 иллюстрирует аминокислотную последовательность белка NPP1 дикого типа. Цитоплазматический и трансмембранный участки подчеркнуты. Потенциальные сайты N-гликозилирования выделены жирным шрифтом. PSCAKE, выделенный курсивом, представляет собой начало растворимого NPP1, который включает богатый цистеином участок.

Фиг.2 иллюстрирует аминокислотную последовательность каталитического домена(ов) белка NPP1 без присоединенного нацеливающего фрагмента ("sssNPP1").

Фиг.3 иллюстрирует аминокислотную последовательность TAGsssNPP1. Нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты слит с N-концом sssNPP1. Сигнальный пептид подчеркнут, а нацеливающий фрагмент обозначен жирным шрифтом.

Фиг.4 иллюстрирует аминокислотную последовательность TAGsssNPP1, которая содержит нацеливающий фрагмент из десяти последовательных остатков аспарагиновой кислоты, слитый с С-концом sssNPP1. Сигнальный пептид подчеркнут, а нацеливающий фрагмент обозначен жирным шрифтом.

Фиг.5 иллюстрирует последовательность нуклеиновой кислоты гибридного белка TAGssNPP1. Нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты слит с N-концом sssNPP1.

Фиг.6 иллюстрирует аминокислотную последовательность гибридного белка TAGssNPP1. Нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты слит с N-концом sssNPP1. Сигнальный пептид подчеркнут, а нацеливающий фрагмент обозначен жирным шрифтом.

Фиг.7 иллюстрирует последовательность нуклеиновой кислоты ssNPP1.

Фиг.8 иллюстрирует аминокислотную последовательность ssNPP1. Сигнальный пептид подчеркнут.

Фиг.9 иллюстрирует последовательность нуклеиновой кислоты sNPP1.

Фиг.10 иллюстрирует аминокислотную последовательность sNPP1. Сигнальный пептид подчеркнут.

Фиг.11 иллюстрирует последовательность нуклеиновой кислоты TAGsNPP1. Нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты слит с N-концом sNPP1.

Фиг.12 иллюстрирует аминокислотную последовательность TAGsNPP1. Нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты слит с N-концом ssNPP1. Сигнальный пептид подчеркнут, а нацеливающий фрагмент обозначен жирным шрифтом.

Фиг.13 иллюстрирует последовательность нуклеиновой кислоты TAGsNPP1. Нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты слит с С-концом sNPP1.

Фиг.14 иллюстрирует аминокислотную последовательность TAGsNPP1. Нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты слит c N-концом sNPP1. Сигнальный пептид подчеркнут, а нацеливающий фрагмент обозначен жирным шрифтом.

Фиг.15 иллюстрирует аминокислотную последовательность линкерного пептида.

Фиг.16 иллюстрирует аминокислотную последовательность Fc-сегмента иммуноглобулина.

Фиг.17 иллюстрирует аминокислотную последовательность TAGsssNPP1, который содержит нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты, слитый с N-концом sssNPP1 посредством пептидного линкера. Fc-сегмент слит с N-концом нацеливающего фрагмента. Сигнальный пептид подчеркнут, а нацеливающий фрагмент обозначен жирным шрифтом. Пептидный линкер выделен курсивом.

Фиг.18 иллюстрирует аминокислотную последовательность TAGsssNPP1, который содержит нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты, слитый с С-концом sssNPP1 посредством пептидного линкера. Fc-сегмент слит с N-концом sssNPP1. Сигнальный пептид подчеркнут, а нацеливающий фрагмент обозначен жирным шрифтом. Пептидный линкер выделен курсивом.

Фиг.19 представляет собой схематическое изображение вектора экспрессии (т.е. рТТ22), содержащего конструкт TAGsNPP1. Нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты слит с С-концом sNPP1.

Фиг.20 иллюстрирует вестерн-блоттинг TAGsNPP1. Восстанавливающие условия; NR, невосстанавливающие условия.

На фиг.21 показана ферментативная активность TAGsNPP1, продуцированного и выделенного из клеток НЕК293.

Фиг.22А-22С иллюстрируют схему конструктов для гибридного белка TAGNPP1, описанных в данном документе.

На фиг.23 показаны уровни кальцификации гладких мышечных клеток аорты человека, обработанных растворимым sNPP1 (WT), TAGsNPP1 (D8, слитый с С-концом sNPP1) и sNPP1-Fc.

На фиг.24 представлено схематическое изображение вектора экспрессии (т.е. рТТ22), содержащего конструкт TAGsNPP1. Нацеливающий фрагмент из восьми последовательных остатков аспарагиновой кислоты (D8) слит с С-концом sNPP1.

На фиг.25 представлена последовательность нуклеиновой кислоты гибридного белка TAGsNPP1.

На фиг.26 представлена аминокислотная последовательность гибридного белка TAGsNPP1.

На фиг.27 представлено схематическое изображение вектора экспрессии (т.е. рТТ22), содержащего гибридный конструкт sNPP1-Fc.

На фиг.28 представлена последовательность нуклеиновой кислоты гибридного белка sNPP1-Fc.

На фиг.29 представлена аминокислотная последовательность гибридного белка sNPP1-Fc.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает новые человеческие гибридные белки NPP1, которые являются растворимыми и содержат усеченный(ые) и биологически активный(ые) домен(ы) NPP1 (т.е. NPP1-компоненты, которые содержат по меньшей мере один внеклеточный каталитический домен встречающегося в природе NPP1 для пирофосфатазной и/или фосфодиэстеразной активности) и один или несколько нацеливающих фрагментов (т.е. "TAG"). Гибридные белки NPP1 по настоящему изобретению содержат по меньшей мере домен NPP1, необходимый для осуществления пирофосфатазной и/или фосфодиэстеразной активности. Соответственно, настоящее изобретение описывает выделенные гибридные белки, которые содержат аминокислотные остатки A205-L591 из SEQ ID NO: 1, слитые с одним или несколькими нацеливающими фрагментами. Нацеливающий фрагмент может быть рекомбинантно слитым или химически связанным (например, ковалентная связь, ионная связь, гидрофобная связь и сила Ван-дер-Ваальса) с NPP1-компонентом при помощи способов, хорошо известных в данной области техники, и он направляет NPP1-компонент на определенный сайт-мишень, где присоединенный NPP1-компонент окажет желаемый эффект (например, катализ реакции, такой как растворение субстрата, такого как PPi, или предотвращение образования субстрата, такого как PPi) у субъекта, которому вводится гибридный белок по настоящему изобретению.

TAGNPP1s

Во всех гибридных белках NPP1 ("TAGNPP1s") по настоящему изобретению удалены N-концевые цитоплазматические и трансмембранные домены встречающегося в природе человеческого NPP1. Необязательно, гибридные белки TAGNPP1s по настоящему изобретению также могут содержать С-концевое усечение NPP1 дикого типа на различную длину. Аминокислотная последовательность NPP1 дикого типа полной длины приведена в SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления гибридный белок содержит полипептид, содержащий аминокислотные остатки A205-L591 из SEQ ID NO: 1 ("sssNPP1"), слитый с TAG либо по N-, либо по С-концу ("TAGsssNPP1"). В одном варианте осуществления гибридный белок содержит полипептид, содержащий аминокислотные остатки A205-D925 SEQ ID NO: 1 ("ssNPP1"), слитые с TAG либо по N-, либо по С-концу ("TAGssNPP1"). В одном варианте осуществления гибридный белок содержит полипептид, содержащий аминокислотные остатки P99-D925 из SEQ ID NO: 1 ("sNPP1"), слитые с TAG либо по N-, либо по С-концу полипептида ("TAGsNPP1"). Также предполагается любой непрерывный фрагмент sNPP1, который содержит по меньшей мере аминокислотные остатки A205-L591 из SEQ ID NO: 1, и полипептидный фрагмент слит с TAG либо по N-, либо по С-концу.

При экспрессии в клеточной культуре или трансгенном животном гибридные белки TAGNPP1 могут дополнительно содержать сигнальный пептид (или лидерную последовательность) на своем N-конце. Сигнальный пептид котрансляционно или посттрансляционно направляет транспорт гибридных белков TAGNPP1 через внутриклеточные органеллы клетки, экспрессирующей гибридные белки TAGNPP1, и, таким образом, определяет посттрансляционную модификацию гибридных белков TAGNPP1. Следует понимать, что по причине того, что сигнальный пептид отщепляется от гибридного белка на котрансляционном или посттрансляционном этапе, гибридные белки TAGNNP1, в случае если они секретированы и выделены, как правило, лишены сигнального пептида. Соответственно, в вариантах осуществления, которые направлены на последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие описанные гибридные белки TAGNPP1, также предполагаются лидерные последовательности, применяемые по настоящему изобретению. Например, нуклеотидная последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 2, содержит пример лидерной последовательности для TAGNNP1 на ее 5′-конце.

Каждый из гибридных белков, раскрытых в данном документе, предусматривается с одним или несколькими нацеливающими фрагментом ("TAG"). TAG-компонент согласно настоящему изобретению содержит четыре или более отрицательно заряженных аминокислот, таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. TAG-компонент может представлять собой фрагмент из отрицательно заряженных аминокислотных остатков, например, аспарагиновых кислот и/или глутаминовых кислот, длина которого составляет от приблизительно 4 до приблизительно 20 аминокислотных остатков. TAG может быть слит либо с N-, либо с С-концом NPP1-компонента. Также TAG может быть слит как с N-, так и с С-концом NPP1-компонента. Соответственно, аминокислотная последовательность гибридного белка TAGsNPP1, например, включает NPP1-компонент от PSCAKE до С-концевой области и один или несколько нацеливающих фрагментов (например, метка на основе полиглутаминовой кислоты или метка на основе полиаспарагиновой кислоты) в N- и/или С-концевой области NPP1-компонента. Гибридный белок, содержащий NPP1-компонент с TAG, слитым с С-концом, представляет собой особенно подходящий вариант осуществления. В одном очень специфическом варианте осуществления используется TAG с фрагментом из восьми аспарагиновых кислот, как можно видеть в иллюстративных последовательностях для TAGsNPP1 и TAGssNPP1 на фигурах, хотя может применяться любое подходящее количество отрицательно заряженных аминокислотных остатков (например, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18) в соответствии с настоящим изобретением. На фигурах TAG-компонент обозначен как "А".

Настоящее изобретение также охватывает полинуклеотиды, которые кодируют различные гибридные белки TAGNPP1, описанные в данном документе. Соответственно, любую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность любого гибридного белка TAGNPP1, можно применять для создания рекомбинантных молекул, которые экспрессируют соответствующий гибридный белок TAGNPP1. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 2., как показано на ФИГ.2.

В определенных специфических вариантах осуществления гибридный белок содержит несколько полипептидов, описанных в данном документе, или он содержит по меньшей мере один полипептид, описанный в данном документе, и неродственную последовательность. Определенный предпочтительный полипептид, например, может способствовать димеризации и стабильности или снижать до минимума агрегацию гибридных белков. Например, дополнительный полипептид может представлять собой Fc-участок иммуноглобулина G1 для повышения стабильности в сыворотке. Применение Fc-сегмента хорошо известно в данной области техники и описано в патенте США №7902151 и патенте США №7858297, содержание которых включено в данный документ при помощи ссылки во всей их полноте. Богатый цистеином участок NPP1 дикого типа (например, от PSCAKE до NEPQCP; аминокислотная последовательность от Р99 до Р204 из SEQ ID NO: 1) можно использовать для обеспечения димеризации гибридных белков TAGNPP1.

В другом варианте осуществления полиэтиленгликоль (PEG) можно конъюгировать с гибридными белками TAGNPP1. Другие полипептиды можно выбрать с тем, чтобы снизить до минимума агрегацию и иммуногенность, увеличить растворимость белка, или чтобы обеспечить нацеливание белка на необходимые участки, имеющие клиническое или биологическое значение.

Также TAGNPP1 можно слить или конъюгировать с соответствующим полипептидным линкером или другой последовательностью для облегчения идентификации, синтеза или очистки гибридного белка, или для лучшего сохранения нативной структуры NPP1-компонента, что может повышать активность и нацеливание TAGNPP1. В частности, последовательность пептидного линкера можно использовать для разделения первого и второго полипептидного компонентов на расстоянии, достаточном для того, чтобы обеспечить укладку каждого полипептида во вторичную и третичную структуры. Такую последовательность пептидного линкера встраивают в гибридный белок между NPP1-компонентом и TAG-компонентом с использованием стандартных методик, хорошо известных в данной области техники. Подходящие последовательности пептидного линкера можно выбрать исходя из их способности принимать гибкую растянутую конформацию и их неспособности принимать вторичную структуру, которая могла бы взаимодействовать с функциональной частью NPP1, TAG или других вторичных полипептидов, описанных в данном документе (например, Fc). Предпочтительные последовательности пептидного линкера содержат остатки Gly, His, Asn и Ser. Пригодные пептидные линкеры без ограничения включают поли-Gly, поли-His, поли-Asn или поли-Ser. Другие почти нейтральные аминокислоты, такие как Thr и Ala, также можно использовать в линкерной последовательности. Аминокислотные последовательности, которые можно успешно использовать в качестве линкеров, включают последовательности, раскрытые в Maratea et al., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; патенте США №4935233 и патенте США №4751180. Линкерная последовательность может иметь длину от 1 до приблизительно 20 аминокислотных остатков. Предпочтительно полипептидный линкер имеет длину от приблизительно 8 до приблизительно 12 аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления пептидный линкер, который применяется в настоящем изобретении, представляет собой GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 15), однако, можно использовать любую функциональную комбинацию Gly, Ser, His или Asn.

Гибридные белки также могут содержать TAGNPP1 по настоящему изобретению вместе с неродственным полипептидом. Предпочтительно неродственный полипептид способен улучшить нацеливание гибридного белка на участок, имеющий клиническое или биологическое значение (например, участок кальцификации). Например, пептиды, которые имеют высокое сродство к кости, описаны в патенте США №7323542, содержание которого включено в данный документ при помощи ссылки во всей полноте.

TAGNPP1 можно получить с использованием стандартных способов, включая рекомбинантные методики или химическое конъюгирование, хорошо известные в данной области техники. Методики, пригодные для выделения и характеристики нуклеиновых кислот и белков по настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области техники, и для того, чтобы выбрать подходящие протоколы для применения без ненужного экспериментирования, можно обращаться за информацией к стандартным руководствам по молекулярной биологии и биохимии. См., например, Sambrook et al, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd ed., Cold Spring Harbor, содержание которого включено в данный документ при помощи ссылки во всей его полноте. Вкратце, последовательности ДНК, кодирующие полипептидные компоненты, можно собрать отдельно и лигировать в соответствующий вектор экспрессии. Например, 3′-конец последовательности ДНК, кодирующей NPP1-компонент, лигирован, с пептидным линкером или без него, с 5′-концом последовательности ДНК, кодирующей второй полипептидный компонент, такой как TAG PEG или Fc, так чтобы рамки считывания последовательностей были в фазе. Это дает возможность трансляции с образованием одного гибридного белка, который сохраняет биологическую активность полипептидов обоих компонентов. Лигированные последовательности ДНК функционально связаны с подходящими регуляторными элементами транскрипции или трансляции, в том числе промотором. Регуляторные элементы, которые отвечают за экспрессию ДНК, расположены только 5′ по отношению к последовательности ДНК, кодирующей первый полипептид, такой как лидерная последовательность, кодирующая сигнальный пептид. Аналогично, стоп-кодоны, необходимые для завершения трансляции, и сигналы терминации транскрипции присутствуют только 3′ по отношению к последовательности ДНК, кодирующей второй полипептид.

Настоящее изобретение также охватывает варианты TAGNPP1. Предпочтительным вариантом TAGNPP1 является вариант, характеризующийся 80%, 85%, 90%, 95% и более предпочтительно 96% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A205-L591 из SEQ ID NO: 1. Наиболее предпочтительным вариантом TAGNPP1 является вариант, характеризующийся по меньшей мере 97% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью A205-L591 из SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидной последовательности, содержащей комплементарную цепь SEQ ID NO: 2 или ее варианты. Кроме того, настоящее изобретение также описывает полинуклеотидные последовательности, которые гибридизируются в жестких условиях с SEQ ID NO: 2 и антисмысловая последовательность которых является на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичной SEQ ID NO: 2. Условия гибридизации основаны на температуре плавления (Tm) связывающего нуклеиновые кислоты комплекса или зонда, как указано в Wahl, G.M. and S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152: 399-407) и Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152: 507-511), и их можно использовать при определенной жесткости.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, олигонуклеотиды, пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), их фрагменты, части или антисмысловые молекулы.

Хотя нуклеотидные последовательности, которые кодируют TAGNPP1 и его варианты, предпочтительно способны гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью TAGNPP1 при соответствующим образом выбранной жесткости условий, может быть преимущественным получить нуклеотидные последовательности, кодирующие TAGNPP1 или его производные, имеющие существенно отличающуюся частоту использования кодонов. Кодоны можно выбрать так, чтобы увеличить скорость, с которой осуществляется экспрессия пептида в определенном прокариотическом или эукариотическом хозяине, в соответствии с частотой, с которой определенные кодоны используются хозяином. Другие причины для существенного изменения нуклеотидной последовательности, кодирующей TAGNPP1 и его производные, без изменения кодируемых аминокислотных последовательностей включают получение РНК-транскриптов, характеризующихся более желательными свойствами, такими как более продолжительное время полужизни.

Измененные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие TAGNPP1, которые охвачены настоящим изобретением, включают делеции, вставки или замены различных нуклеотидов, что приводит к полинуклеотиду, который кодирует такой же TAGNPP1 или его функциональный эквивалент. Кодируемый белок также может содержать делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, что производит "молчащее" изменение и приводит к функциональному эквиваленту TAGNPP1. Преднамеренные замены аминокислот можно осуществлять на основе сходства по полярности, заряду, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природе остатков при условии, что биологическая активность TAGNPP1 сохраняется. Например, положительно заряженные аминокислотные остатки включают Lys и Arg; отрицательно заряженные аминокислотные остатки включают Asp и Glu; и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, характеризующиеся сходной гидрофильностью, могут включать Leu, Ile и Val; Gly и Ala; Asp и Gln; Ser и Thr; Phe и Tyr.

Вектор экспрессии

Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники, можно применять для конструирования векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие TAGNPP1 и соответствующие регуляторные элементы транскрипции и трансляции. Эти способы включают in vitro методики рекомбинантной ДНК, синтетические методики и генетическую рекомбинацию in vivo. Такие методики описаны, например, в Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel, F.M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., содержание которых включено в данный документ при помощи ссылки во всей их полноте.

Ряд систем вектор экспрессии/хозяин можно использовать для того, чтобы вмещать и экспрессировать последовательности, кодирующие TAGNPP1. Они без ограничения включают микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными векторами экспрессии ДНК; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; система на основе клеток насекомых, инфицированных вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирус) или бактериальным вектором экспрессии (например, плазмиды Ti или pBR322); или системы на основе клеток животных (например, вектор рТТ22).

Регуляторные элементы или регуляторные последовательности могут содержать такие нетранслируемые участки вектора - энхансеры, промоторы, 5′- и 3′-нетранслируемые участки, которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Такие элементы могут варьировать по своей силе и специфичности. В зависимости от используемых векторной системы и хозяина можно использовать любое количество подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая тканеспецифические, конститутивные и индуцируемые промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах можно использовать индуцируемые промоторы, такие как гибридный промотор lacZ фагмиды Bluescript™ (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния) или плазмиды pSport1™ (Gibco BRL) и т.п. В системах на основе клеток млекопитающих промоторы из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих являются предпочтительными. Если необходимо создать клеточную линию, которая содержит множество копий последовательности, кодирующей TAGNPP1, можно использовать векторы на основе SV40 или EBV с соответствующим селектируемым маркером. При использовании системы экспрессии на основе клеток птиц подходящие векторы для экспрессии множества конструктов TAGNPP1 описаны в патенте США №6730822; патенте США №6825396; патенте США №6875588; патенте США №7294507; патенте США №7521591; патенте США №7534929 и заявке на патент США сер. №11/376023, содержание которых включено в данный документ при помощи ссылки во всей их полноте. Вкратце, при использовании системы экспрессии на основе клеток птиц для экспрессии TAGNPP1 предусматриваются подходящие яйцевод-специфические промоторы, например и без ограничения, промоторы овомукоида, промоторы овальбумина, промоторы лизоцима, промоторы кональбумина, промоторы овомуцина, промоторы овотрансферрина и функциональные части каждого из этих промоторов. Подходящие неспецифические промоторы могут включать, например и без ограничения, промоторы цитомегаловируса (CMV), промоторы MDOT и промоторы вируса саркомы Рауса (RSV), промоторы вируса лейкемии мышей (MLV), промоторы вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), и промоторы SV40, и функциональные части каждого из этих промоторов. Неограничивающие примеры других промоторов, которые могут быть пригодными по настоящему изобретению, без ограничения включают промоторы Pol III (например, тип 1, тип 2 и тип 3 промоторов Pol III), такие как промоторы H1, промоторы U6, промоторы тРНК, промоторы РНКазы MPR и функциональные части каждого из этих промоторов. Как правило, функциональные терминаторные последовательности выбираются для применения по настоящему изобретению в соответствии с промотором, который используется.

Клетки-хозяева

Настоящее изобретение предусматривает продуцирование растворимого TAGNPP1 в системе на основе клеток трансгенных птиц (например, трансгенных кур), хорошо известной в данной области техники, например, в патенте США №7534929, раскрытие которого включено в данный документ при помощи ссылки во всей его полноте. Продуцирование в системе на основе клеток птиц (например, в яйцеводе птиц) NPP1-компонента с нацеливающим фрагментом или без него (например, ssNPP1, sNPP1, TAGsNPP1 и TAGssNPP1) охвачено объемом настоящего изобретения. Кроме того, TAGNPP1, продуцируемый в любой подходящей системе экспрессии белка, без ограничения включая трансгенных птиц, трансгенное млекопитающее, клеточные культуры (например, клетки СНО, клетки НЕК293 и клетки COS), бактерии, такие как Е.coli, трансгенных животных, таких как млекопитающие и птицы (например, куры, перепел, утка и индейка), и в растительной системе, включая ряску, предусмотрен в данном документе.

Линию клеток-хозяев можно выбрать, основываясь на ее способности необходимым образом регулировать экспрессию вставленных последовательностей или процессировать экспрессируемый TAGNPP1s. Такие модификации полипептида TAGNNP1 без ограничения включают ацетилирование, карбоксилирование, сиалирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. Различные клетки-хозяева, такие как СНО, COS, HeLa, MDCK, НЕК293 и W138, которые обладают специфическим клеточным аппаратом и характерными механизмами для таких посттрансляционных процессов, можно выбрать для обеспечения надлежащей модификации и процессинга гибридного белка по настоящему изобретению. Линия опухолевых клеток птиц также предусматривается в качестве клетки-хозяина для экспрессии полипептида по настоящему изобретению. Примеры подходящих линий клеток птиц (например, линия клеток опухоли яйцевода птиц), которые можно использовать по настоящему изобретению, описаны в публикации патентного документа США №2009/0253176, содержание которого включено в данный документ при помощи ссылки во всей полноте.

Получение TAGNPP1

TAGNPP1 можно получить с применением любой из множества хорошо известных методик. TAGNPP1, кодируемый последовательностями ДНК, описанными выше, можно легко получить исходя из последовательностей ДНК с применением любого из множества векторов экспрессии, описанных в данном документе или хорошо известных специалистам в данной области техники. Экспрессию можно осуществлять в любой подходящей клетке-хозяине, которую трансформировали или трансфицировали вектором экспрессии, содержащим молекулу ДНК, которая кодирует рекомбинантный полипептид по настоящему изобретению. Супернатанты из подходящих систем хозяин/вектор, которые секретируют рекомбинантный гибридный белок или полипептид в культуральную среду, можно сначала концентрировать с использованием коммерчески доступного фильтра. После концентрирования концентрат можно перенести на подходящую матрицу для очистки, такую как афинную матрицу или ионообменную смолу. Можно использовать один или несколько этапов обращенно-фазовой HPLC для дополнительной очистки рекомбинантного полипептида.

Для получения рекомбинантных белков с большим выходом стабильная экспрессия является предпочтительной. Клеточные линии, стабильно экспрессирующие TAGNPP1, можно трансформировать с применением векторов экспрессии, которые содержат вирусные точки начала репликации, и/или эндогенные элементы регуляции экспрессии, и/или селектируемый маркерный ген на одном и том же или на отдельном векторе. После введения вектора можно обеспечить рост клеток в течение 1-2 дней в обогащенной среде перед тем, как перенести их на селективную среду. Назначение селектируемого маркера состоит в том, чтобы придать устойчивость к отбору, и его наличие делает возможным рост и выделение клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности. Можно обеспечивать пролиферацию устойчивых клонов стабильно трансформированных клеток с применением методик тканевых культур, соответствующих типу клеток. Способы продуцирования экзогенного белка в линиях клеток млекопитающих хорошо известны в данной области техники. Иллюстративные примеры этого и других аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения применительно к продуцированию гетерологичных полипептидов, таких как гибридные белки TAGNPP1, в клетках птиц полностью раскрыты в заявке на патент США, серийный №09/877374, поданной 8 июня 2001 года, опубликованной как патентный документ США 2002/0108132 - А1 8 августа 2002 года, и заявке на патент США, серийный №10/251364, поданной 18 сентября 2002 года, каждая из которых включена в данный документ при помощи ссылки во всей ее полноте. Примеры продуцирования экзогенных белков в линиях опухолевых клеток птиц также описаны в публикации патентного документа США №2009/0253176, содержание которого включено в данный документ при помощи ссылки во всей его полноте.

Настоящее изобретение, в частности, предусматривает продуцирование белков TAGNPP1, раскрытых в данном документе, в трансгенной системе на основе клеток птиц. В одном особенно подходящем варианте осуществления настоящее изобретение сводится к продуцированию TAGNPP1, который может продуцироваться в яйцеводе трансгенных птиц, таких как курица, в соответствии с настоящем изобретением. Примеры продуцирования экзогенных белков в системе экспрессии на основе клеток трансгенных птиц также описаны в патенте США №6730822, содержание которого включено в данный документ при помощи ссылки во всей полноте. Вкратце, подходящий вектор для птиц, описанный выше, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок TAGNPP1, функционально связанную с тканеспецифическим или конститутивным промотором, который управляет экспрессией кодирующей последовательности в яйцеводе курицы, вводят в эмбриональные клетки курицы стадии X. Трансформированные эмбриональные клетки инкубируют при условиях, благоприятных для выведения живых цыплят. Живых цыплят выращивают до зрелых химерных кур, которых скрещивают с нетрансгенными курами естественным путем или посредством искусственного оплодотворения. Трансгенных кур выявляют посредством скрининга потомства на предмет включения кодирующей белок последовательности в зародышевую линию. Трансгенное потомство можно скрещивать с другими трансгенными или нетрансгенными курами с получением яиц, содержащих гибридный белок TAGNPP1. Затем TAGNPP1 выделяют и очищают при помощи способов, хорошо известных в данной области техники. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает рекомбинант