Биологически активный радиоактивно-меченый cry1fa и способы проведения экспериментов связывания с рецептором

Биологически активный радиоактивно-меченый cry1fa и способы проведения экспериментов связывания с рецептором

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет у предварительной заявки на патент США №61/423844, поданной 16 декабря 2010 года, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте, включая все фигуры, таблицы и аминокислотные или нуклеотидные последовательности.

Предшествующий уровень техники

Общая область настоящего изобретения относится к области естественных наук, в особенности к сельскохозяйственным наукам и аналитическим способам. В частности, областью настоящего изобретения является биохимия и характер действия кристаллизованных (Cry) эндотоксинов Bacillus thuringiensis, а также их взаимодействие с рецепторами Cry-токсинов у насекомых.

Инсектицидные Cry-белки представляют собой эндотоксины, синтезируемые Bacillus thuringiensis (Bt), грамположительной бактерией, распространенной в мире в различных видах почв. Разные классы Cry-белков избирательно токсичны в отношении конкретных сельскохозяйственных насекомых-вредителей. Данный эндотоксин представлен, как правило, в форме кристаллизованного белка, сконцентрированного в больших тельцах включения бактерии. Последовательности Cry-токсинов в значительной степени отличаются друг от друга (Crickmore и др., 1998; de Maagd и др., 2003), однако большинство токсинов, обладающих действием против чешуекрылых насекомых-вредителей, являются протоксинами с массой 130 кДа и структурой активного основного токсина, состоящей из трех доменов (de Maagd и др., см. ранее).

Объект настоящего изобретения относится к токсину Cry1Fa, состоящему из трех доменов Cry-белку. Данный токсин демонстрировал инсектицидную активность в отношении различных чешуекрылых насекомых, включая Spodoptera frugiperda (J.E.Smith) (травяная совка) и Ostrinia nubilalis (Hűbner) (европейский кукурузный мотылек), двух экономически наиболее важных насекомых-вредителей кукурузы. Cry1Fa является токсиновым компонентом двух нерегулируемых Министерством сельского хозяйства США генно-инженерных растений со встроенными пестицидами, известными как событие ТС1507 для кукурузы (HERCULEX®) и событие 281-24-236 для хлопка (WIDESTRIKE®).

Для полноразмерного белка голотоксина Cry1Fa, как и для других состоящих из трех доменов Cry-белков, необходимо протеолитическое расщепление как c N-, так и c С-конца для активации его инсектицидной активности. Средний отдел кишечника чешуекрылых насекомых содержит множество трипсин- и химотрипсин-подобных протеаз, которые процессируют полноразмерный голотоксин до структуры основного токсина размером приблизительно 68 кДа (Christeller и др., 1992; Gatehouse и др., 1997; Bernardi и др., 1996). Процесссинг включает в себя удаление приблизительно 28 аминокислот с N-конца и приблизительно 530 аминокислот с С-конца (сегмент протоксина), и полученный сегмент основного токсина высвобождается и связывается со специфическими рецепторами, расположенными в кишечнике насекомого.

Насекомые могут приобретать устойчивость к действию Cry-белковых токсинов через изменения в рецепторах, расположенных в среднем отделе кишечника, которые связывают основной Cry-белковый токсин (Heckel и др., 2007; Van Rie и др., 1990b). Более того, описаны другие механизмы развития устойчивости, включающие: сниженную активацию протоксина, изменение числа Cry-рецепторов в среднем отделе кишечника насекомого, а также потерю способности отвечать на токсин вследствие образования мембранных пор, приводящих к гибели насекомого (см. Griffitts & Aroian, 2005; Van Rie и др., 1990b).

До настоящего изобретения опыты, характеризующие связывание белка основного токсина Cry1Fa с различными рецепторами насекомых, не были описаны. Причиной тому явились традиционные способы радиоактивного мечения с использованием окисленных изотопов йода, взаимодействующих с остатками тирозина в составе токсина Cry1Fa с образованием радиоактивно-меченого белка основного токсина, утратившего способность связываться с рецепторами везикул мембраны щеточной каймы (ВМЩК), полученных из среднего отдела кишечника Spodoptera exigua и Spodoptera frugiperda (Luo и др., 1999). Более того, было показано, что меченный традиционным способом белок основного токсина Cry1Fa терял свое инсектицидное действие и в биоэкспериментах выкармливания не проявлял активности против данных видов Spodoptera. Применялись и другие способы мечения белков, такие как флуоресцентное мечение, и другие способы оценки связывания рецептора с лигандом, такие как изотермальная калориметрия, однако они оказались либо недостаточно чувствительными, либо оптические способы были слишком сложными для использования вследствие особенностей ВМЩК насекомых.

Palmer и др. (1997) описал способ непрямого радиоактивного специфичного мечения белков по остаткам цистеина. В этом способе флуоресцин-5-малеимид в качестве промежуточного компонента вначале взаимодействует с радиоактивным йодом, а затем радиоактивно-меченый флуоресцин-5-малеимид применяется для химической модификации белка по доступным остаткам цистеина. Настоящее изобретение описывает использование высокоспецифичного способа, описанного Palmer и др., для радиоактивного мечения белка Cry1Fa по одному остатку цистеина (С205), расположенному в первом домене основного токсина Cry1Fa.

Наиболее удивительным было наблюдение, что присоединение этого стерически громоздкого радиоактивно-меченого 5-малеимида к белку основного токсина Cry1Fa описанным способом не приводило к потере его способности к связыванию с рецептором или к инактивации токсина. В результате, этот меченный нетрадиционным способом основной токсин Cry1Fa сохранял третичную структуру белка, обеспечивающую как инсектицидное действие, так и способность белка специфически связываться с рецепторами в препаратах ВМЩК различных насекомых.

Было показано, что радиоактивно-меченный нетрадиционным способом белок Cry1Fa связывался с рецептором до полного насыщения и был использован в эксперименте конкурентного связывания для оценки способности других Cry-токсинов конкурировать с ним за связывание с данным рецептором. Применение данного исследования показало, что причиной развившейся полевой устойчивости к токсину Cry1Fa в популяции S. frugiperda, собранной в Пуэрто Рико, стала потеря рецепторами ВМЩК этих насекомых способности связываться с белком основного токсина Cry1Fa.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1 представлен биоэксперимент с применением транкированного трипсином Cry1Fa и флуоресцин-5-малеимид-меченого транкированного трипсином Cry1Fa против личинок S. frugiperda. Данная Фигура обобщает результаты биоэкспериментов выкармливания насекомых с новорожденными личинками Spodoptera frugiperda и применением йодированного (не радиоактивного) белка основного токсина Cry1Fa, полученного описанным в настоящем изобретении способом.

На Фигуре 2 представлены кривые насыщения связывания меченного радиоактивным йодом белка основного токсина Cry1Fa с ВМЩК европейского кукурузного мотылька (ЕКМ). На Фигуре изображено насыщение связывания меченного радиоактивным йодом белка основного токсина Cry1Fa, полученного способом настоящего изобретения, с ВМЩК среднего отдела кишечника личинок Ostrinia nubilalis.

Краткое описание обозначений последовательностей

Последовательность №1: синтетическая последовательность ДНК, кодирующая голотоксин Cry1Fa.

Последовательность №2: голотоксин Cry1Fa.

Детальное описание настоящего изобретения

Структурные домены белка Cry1Fa расположены в трипсиновом «ядре», устойчивом к дальнейшему расщеплению трипсином. Домен I состоит из семи альфа-спиралей, которые предположительно пронизывают мембрану среднего отдела кишечника насекомого и формируют структуру, напоминающую пору (Ballester и др., 1999). Домен II состоит из трех антипараллельных бета-складок, и Домен III образует структуру бета-сендвича (Pigott & Ellar, 2007). Существует предположение, что экспонированные регионы Доменов II и III взаимодействуют со специфическими рецепторами, расположенными со стороны просвета среднего отдела кишечника насекомого, и эффективно связываются с ними (Bravo и др., 2007; de Maagd и др., 1996; Gomez и др., 2006; Herrero и др., 2004; Lee и др., 1999). Связывание токсина с рецептором является необходимым условием для инсектицидного действия и осуществляет специфичность и избирательность токсинов (Pigott & Ellar, 2007; Rausell и др., 2004). Было показано, что специфичное действие разных Cry-белков против различных видов насекомых может отчасти зависеть и от различий рецепторов у разных насекомых (Gomez и др., 2003; Gomez и др., 2007; Van Rie и др., 1990a).

Количественные биохимические эксперименты дают возможность измерить взаимодействие Cry-токсинов с белками рецепторов в среднем отделе кишечника насекомых. В экспериментах насыщения связывания меченый белок Cry-токсина (лиганд) инкубируется в буферных растворах, которые обеспечивают связывание белка Cry-токсина с белком рецептора насекомого. В одном воплощении эксперимента насыщения связывания фиксированное количество белка рецептора насекомого (как правило, везикулы мембраны щеточной каймы, полученные из среднего отдела кишечника насекомого) смешивается (в отдельных пробирках) с увеличивающимся количеством йодированного белка Cry-токсина и реакция проводится в течение фиксированного отрезка времени. Несвязавшийся Cry-белок (подразумевается, что не связавшийся с белком рецептора насекомого) очищается от связавшегося белка одним из множества методов, и по уровню радиоактивности в связавшейся фракции белка определяется количество Cry-белка, связавшегося с рецептором насекомого. Специалист в области биохимии поймет, что наблюдение слабой радиоактивности или ее отсутствия после связывания означает отсутствие рецептора для конкретного изучаемого Cry-токсина в препаратах исследуемого вида насекомого.

Вторым воплощением эксперимента связывания является эксперимент конкурентного связывания. В эксперименте конкурентного связывания радиоактивный белок Cry-токсина смешивается с избытком второго, нерадиоактивного Cry-белка, и эти Cry-белки связываются в стандартных условиях с белками рецепторов насекомых. Если второй нерадиоактивный белок Cry-токсина способен конкурировать с радиоактивным белком Cry-токсина за связывание с рецептором насекомого, тогда радиоактивный белок будет вытесняться из сайта связывания рецептора, и детектируемый уровень радиоактивности связавшихся молекул будет очень мал. Если нерадиоактивный и радиоактивный белки Cry-токсина связываются с разными рецепторными белками насекомых, то они не будут конкурировать друг с другом за связывание с одним рецепторным белком насекомого. К примеру, уровень радиоактивности, детектируемый во фракции связавшегося белка, будет таким же, или приблизительно таким же, как и в случае отсутствия второго нерадиоактивного белка Cry-токсина в реакции связывания. Применимы различные способы определения уровня радиоактивности во фракции связавшегося белка.

Эксперименты конкурентного связывания с применением белка основного токсина ¹²⁵I- Cry1Fa и либо нерадиоактивного белка основного токсина Cry1Fa (контрольная реакция), либо белка основного токсина Cry1Ab показали, что оба нерадиоактивных белка основного Cry-токсина были способны вытеснять меченый основной токсин Cry1Fa из сайта связывания рецептора в ВМЩК S. frugiperda. Эксперимент конкурентного связывания, напротив, показал, что белок основного токсина Cry1Ca не конкурировал за связывание с основным токсином Cry1Fa. Результаты описанных экспериментов связывания показали, что устойчивость насекомых к токсину Cry1Fa, наблюдаемая в полевых исследованиях у популяции S. frugiperda, собранной в Пуэрто Рико, может объясняться неспособностью рецепторов, расположенных в везикулах мембраны щеточной каймы данных насекомых, связывать основной токсин Cry1Fa.

Все патенты, патентные заявки, предварительные заявки и публикации, на которые ссылается или которые цитирует настоящее описание, включены в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки до тех пор, пока они в явном виде не противоречат настоящему описанию.

Нуклеотидные последовательности представлены в стандартной ориентации 5'-3', и белковые последовательности представлены в стандартной ориентации с N'-конца до C'-конца.

Пока не обозначено иначе, формы единственного числа принимают значение «не менее одного» в контексте настоящего описания.

Далее следуют примеры, иллюстрирующие практическое применение настоящего изобретения. Данные примеры не должны ограничивать воплощения настоящего изобретения. Все процентные доли рассчитаны как массовые, все пропорции смесей растворов - как объемные, если не указано иначе. Все показатели температур выражены в градусах Цельсия.

Пример 1. Конструирование экспрессионных плазмид, кодирующих белок токсина Cry1Fa, и экспрессия в бактериальных клетках

Стандартные способы клонирования (представленные, к примеру, у Sambrook и др. (1989) и Ausubel и др. (1997), а также их обновленные версии) применялись для сборки конструкта pDAB1817, экспрессионной плазмиды Pseudomonas fluorescence (Pf), созданной для синтезирования химерного белка токсина (в этом описании относится к токсину Cry1Fa, Последовательность №2), содержащего сегмент основного токсина Cry1Fa (аминокислоты с 1 по 603) и сегмент протоксина Cry1Ab (аминокислоты с 604 по 1148), с оптимизированной для растений кодирующей последовательностью (кодирующий сет данных; Последовательность №1).

pDAB1817 получен из pMYC1803 (Патент США №7338794). Основная стратегия клонирования включала в себя лигирование фрагмента ДНК, фланкированного сайтами узнавания рестриктаз SpeI и KpnI и содержащего кодирующий сет данных токсина Cry1Fa, в большой фрагмент pMYC1803, полученный после расщепления ДНК pMYC1803 рестриктазами SpeI и KpnI. Плазмида pMYC1803 представляет собой плазмиду средней копийности, полученную из плазмиды pTJS260 на основе RSF1010 (см. патент США №5169760), и несет в себе регулируемый маркер устойчивости к тетрациклину, а также локусы репликации и мобилизации из плазмиды RSF1010. Таким образом, кодирующий сет данных токсина Cry1Fa был помещен под экспрессионный контроль промотера Ptac и терминатора rrnBT1T2 из плазмиды pKK223-3 (PL Pharmacia, Милоуки, Висконсин). Экспрессионная плазмида была трансформирована с помощью электропорации в клетки P. fluorescens, штамм MB217 (получен из штамма MB101; P. fluorescens биовар I), с отбором по устойчивости к тетрациклину. Рекомбинантные колонии идентифицировались рестрикционным анализом выделенной плазмидной ДНК.

Анализ роста и экспрессии в биореакторах: производство белка токсина Cry1Fa для биохимических манипуляций и биоэкспериментов на насекомых осуществлялось путем выращивания в биореакторе изолята DR1649 экспрессионного штамма P. fluorescens. Засеянная культура выращивалась в течение 20 часов (финальная плотность при 600 нм равнялась 14) при 32°С в колбе Эрленмейера, содержащей 600 мл среды Ps20 с тетрациклином в концентрации 15 мкг/мл, и использовалась для инокуляции 6,6 литров среды DGMp2.2 в 20-литровом биореакторе (New Brunswick Scientific BioFlo 4500, Эдисон, Нью-Джерси). Ферментацию проводили при температуре 32°С и орбитальном вращении 200-1000 об/мин. Детали микробиологических манипуляций с P. fluorescens доступны в публикации Squires и др. (2004), патентной заявке США № 20060008877, патенте США № 7681799, патентной заявке США №20080058262 и в публикации Huang и др. (2007), включенных в настоящую заявку посредством ссылки. Порции глицерина добавлялись периодически в количестве 10 мг/л в соответствии с концентрацией растворенного кислорода. Экспрессия кодирующего сета данных токсина Cry1Fa с промотера Ptac индуцировалась добавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Культуры отслеживались на протяжении всего времени ферментации после индукции для определения плотности культуры, уровня экспрессии целевого гена и других параметров. Для ДСН-ПААГ электрофореза (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и иммуноблот-анализа были заморожены аликвоты по 1 мл цельного ферментативного бульона для дальнейшего анализа. На финальной временной отметке через 48 часов после индукции (оптическая плотность при 600 нм равна 222; финальный объем культуры равен 13,5 л) клетки из 4 л культуры осаждались центрифугированием при 10000 g в течение 90 минут. Клеточный осадок замораживался при -20°С или при -80°С для дальнейшей обработки.

ДСН-ПААГ анализ ферментативных проб: замороженные пробы клеток ферментативного бульона (0,1 мл) разбавлялись охлажденной водой в пять раз и 200 мкл обрабатывались ультразвуком на льду в течение 10 минут с помощью ультразвукового дезинтегратора Branson 250 Sonifier (Branson Ultrasonics, Данбери, Коннектикут), используя микронаконечник с диаметром 1/8 дюйма при постоянной интенсивности 20 единиц. Лизаты центрифугировались при 14000 об/мин в течение 20 минут (4°С) и супернатанты удалялись (растворимая фракция). Осадки ресуспендировались в 200 мкл фосфатного буфера (PBS; 11,9 мМ Na₂HPO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, pH7,4; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Дальнейшие разведения как растворимой, так и нерастворимой фракции проводились в фосфатном буфере в соотношении от эквивалента до 20 раз от объема исходного ферментативного бульона. Далее эти фракции смешивались в соотношении 1:1 с буфером Лэммли (Bio-Rad Inc., Геркулес, Калифорния), содержащим 5% ß-меркаптоэтанола, и кипятились 5 минут перед нанесением от 10 до 20 мкл на 10% Бис-Трис гель Criterion с буфером MOPS (Bio-Rad Inc.). Гели окрашивались с применением набора Simply Blue SafeStain™ (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) согласно протоколу производителя.

Иммуноблот-анализ: стандартные биохимические способы (представленные, к примеру, у Sambrook и др. (1989) и Ausubel и др. (1997), а также их обновленные версии) использовались для очистки белков и иммуноблот-анализа. Пробы обрабатывались, и белки выделялись с помощью электрофореза в 4-12% Бис-Трис геле NuPAGE с буфером MES для прогона согласно предложенному производителем протоколу для денатурирующего электрофореза (Invitrogen). Белки переносились на нитроцеллюлозную мембрану в течение 80 минут при 30V в буфере для переноса nuPAGE. Блоты блокировались в течение 1 часа при комнатной температуре в 5% молоке/PBST (фосфатный буфер с добавлением 0,05% Tween-20) и далее конъюгировались с первичными антителами (специфичными к сегменту основного токсина Cry1Fa), и затем с вторичными антителами в течение 1 часа каждый при комнатной температуре в блокирующем растворе, с отмывкой между нанесением каждых антител в течение 15 минут в PBST. Проявка блотов проводилась с помощью субстрата для вестерн-блоттинга усиленной хемилюминесценции Pierce согласно протоколу производителя (Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс).

Пример 2. Очистка белка основного токсина Cry1Fa из образованных в Pseudomonas телец включения

Получение телец включения: Белковые тельца включения (ТВ) были получены из клеток DR1649 P.fluorescens, содержащих нерастворимый белок токсина Cry1Fa, как было показано в ДСН-ПААГ анализе и MALDI масс-спектрометрии (масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной ионизацией и десорбцией). Масс-спектрометр MALDI-R (Reflectron) фирмы Micromass (Майлфорд, Массачусетс) применялся для измерения масс пептидов в соответствии со способами и рекомендациями, описанными производителем. Замороженный клеточный осадок размораживался на водяной бане комнатной температуры. Клетки ресуспендировались до 10% содержания (масса/объем) в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5; 200 мМ NaCl, 5% глицерин, 2 мМ натриевая соль ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты); 0,5% Тритон Х-100 и 1 мМ ДТТ (дитиотреитол - добавлялся непосредственно перед использованием)). 25 мкл смеси ингибиторов протеаз (Sigma-Aldrich) добавлялись к каждым 100 мг обрабатываемой клеточной пасты. Полученная жидкая масса дважды пропускалась через микрофлюидайзер Microfluidics с давлением 12000+ psi (Microfluidics Intern. Corp., Ньютон, Массачусетс). Лизат центрифугировался при 18000 g при 4°С в течение 30 минут, и супернатант отбирался. Осадок включений промывался в лизирующем буфере, не содержащем смеси ингибиторов протеаз, до исчезновения бактериального запаха (как правило, 2 или 3 промывки), с легким перемешиванием шпателем или с помощью механической мешалки (до приблизительного содержания твердого вещества 10% (масса/объем)) и центрифугировался, как описано выше. Полученные супернатанты и финальный осадок отбирались и хранились при -20°С. Небольшие аликвоты каждого образца отбирались и хранились в микроцентрифужной пробирке для НДС-ПААГ анализа. Осадки полученных телец включения лиофилизировались с помощью лиофилизатора Virtis Advantage (Viopharma Process Systems LTD, Винчестер, Великобритания) при рабочей температуре полки и максимальном вакууме в течение 2 дней. Полученные порошки хранились при -20°С до проведения анализа.

Анализ в НДС-ПААГ и количественная оценка полученных телец включения: 25 мг осадка ТВ ресуспендировались в 1 мл буфера HTS (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5; 50 мМ NaCl, 5% объем/объем глицерин, 10 мМ натриевая соль ЭДТА; 0,5% объем/объем Тритон Х-100) и обрабатывались ультразвуком, как описано выше, 1 минуту на льду. Ресуспендированные пробы далее разбавлялись в соотношении 1:1 в буфере Лэммли, содержащем 0,2 М ДТТ. Далее пробы разбавлялись в 10 и в 20 раз буфером Лэммли без ДТТ, и 10 мкл наносились на 10% Бис-Трис гель Criterion с 18 лунками (BioRad Inc.) для прогона в 1Х буфере NuPAGE MES (Invitrogen). Гели прогонялись в течение 5 минут при 100V и затем 45 минут при 200V. Гели споласкивались и промывались водой в течение 20 минут и окрашивались краской Simply Blue SafeStain™. Количественная оценка целевых полос проводилась посредством сравнения значений плотности целевых полос со значениями стандартных проб серии разведений БСА (бычьего сывороточного альбумина), нанесенных на тот же гель и сканированных для получения стандартной кривой плотности.

Расщепление и очистка белка основного токсина Cry1Fa: Очищенные тельца включения промывались стерилизованной водой, далее растворялись в 20 мМ ЦАПС рН11 (3-циклогексамино)1-пропансульфоновой кислоте), содержащей 10 мМ ДТТ, перемешивая раствор белка орбитальным вращением в течение 1 часа при комнатной температуре. После удаления нерастворенного содержимого центрифугированием (30000g 30 минут при 4°С), обработанный 0,5% (масса/объем) тозилфенилаланилхлорметилкетоном (ТФХК) (Sigma-Aldich) трипсин добавлялся к супернатанту. Данный раствор инкубировался с перемешиванием 1 час при комнатной температуре, фильтровался и концентрировался в 5 раз с применением колонки для центрифугирования с восстанавливаемым целлюлозным фильтром Amicon Ultra-15 (с пределом молекулярной массы 30000; Millipore), затем наносился на колонку Pharmacia Mono Q 1010, уравновешенную 20 мМ ЦАПС со значением рН 10,5. После промывки данной колонки 2 объемами буфера, транкированный белок токсина элюировался раствором с линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,5М в 20 мМ ЦАПС со значением рН 10,5 пятнадцатью объемами колонки со скоростью потока 1 мл/мин. Очищенный транкированный трипсином основной токсин Cry1Fa элюировался при приблизительно 0,2-0,3 М NaCl. Чистота белков оценивалась в НДС-ПААГ с визуализацией краской Кумасси бриллиантовый голубой (ниже). В некоторых случаях смешанные фракции очищенного токсина концентрировались и наносились на колонку Superose 6 (диаметр 1,6 см, длина 60 см; GE Healthcare Life Sciences), и далее очищались с помощью гель-хроматографии. Фракции с единственным пиком, характерным для мономерного транкированного основного токсина (приблизительно 68 кДа), смешивались и концентрировались, что давало в результате образец с гомогенностью более 95% по белку с молекулярной массой приблизительно 68 кДа, в соответствии с результатами НДС-ПААГ электрофореза.

Анализ в НДС-ПААГ очищенного основного токсина Cry1Fa: Анализ транкированного трипсином белка токсина Cry1Fa в НДС-ПААГ проводился в восстанавливающих и денатурирующих условиях по способу Лэммли (согласно Sambrook и др., как описано выше). Восстановление белков осуществлялось с помощью 5% β-меркаптоэтанола, тепловая денатурация проводилась при 90°С в течение 5 минут с концентрацией НДС 2%. Белки наносились в лунки 4-20% Трис-глицин полиакриламидного геля (Invitrogen) и разделялись при 200V в течение 60 минут. Полоски белка окрашивались Кумасси бриллиантовым голубым R-250 (Bio-Rad) в течение 1 часа, а затем обесцвечивались раствором 5% метанола в 7% уксусной кислоте в присутствии целлюлозных губок. Гели проявлялись и анализировались на приборе Bio-Rad Fluro-S Multi Imager™ с программным обеспечением Quantity One™. Относительные молекулярные массы полос белка оценивались с помощью маркера молекулярного веса белков BenchMark™ Protein Ladder (Life Technologies, Роквилл, Мэриленд) или окрашенного маркера молекулярного веса See Blue™ (Invitrogen), нанесенного в одну из лунок геля.

Пример 3. Получение специфично меченного радиоактивным йодом белка основного токсина Cry1Fa

Йодирование белка основного токсина Cry1Fa: Предыдущая работа продемонстрировала, что йодирование белка токсина Cry1Fa уничтожало способность йодированного белка связываться с рецептором(ами) в везикулах мембраны щеточковой каймы (ВМЩК), так же как и токсичность белка в отношении насекомых (Luo и др., 1999). В этом исследовании белок токсина Cry1Fa был помечен радиоактивным йодом стандартным способом йодирования на шариках (Pierce Iodation Beads; Thermo Fisher Scientific), и эксперименты связывания показали, что белок терял всю свою способность к специфическому связыванию с рецептором(ами) в ВМЩК S.exigua и S.frugiperda. Далее, когда для мечения белка токсина Cry1Fa использовался нерадиоактивный NaI с применением способа йодирования на шариках, йодированный Cry1Fa терял свою инсектицидную активность в отношении личинок Spodoptera в биоэкспериментах выкармливания.

Йодирование белков с помощью протоколов йодирования на шариках происходит в орто-положениях относительно гидроксильной группы тирозина; могут происходить одиночные и двойные замещения. Таким образом, позиции йодирования зависят от расположения тирозиновых остатков внутри целевого белка, и множественное йодирование может быть причиной нарушения структуры белка и/или функции. Замечено, что сегмент основного токсина Cry1Fa содержит 20 тирозиновых остатков, которые могут служить мишенями для йодирования.

Настоящий пример показывает альтернативный способ мечения белка основного токсина Cry1Fa радиоактивным йодом. Следующие Примеры показывают, что радиоактивно меченый белок основного токсина связывается с ВМЩК насекомых, и что йодированный белок основного токсина Cry1Fa проявляет свою активность в биоэкспериментах выкармливания. Далее эти Примеры показывают, что транкированный трипсином белок основного токсина Cry1Fa может быть специфично флуоресцентно-мечен по цистеину, относящемуся к С205 остатку белка основного токсина Cry1Fa с помощью флуоресцин-5-малеимида, и что флуоресцентно-меченый белок проявляет биологическую активность, вызывая гибель насекомых в дозировках, равных дозировкам немеченого, транкированного трипсином основного токсина Cry1Fa.

Сегмент основного токсина Cry1Fa содержит три аминокислотных остатка цистеина в положениях 9, 14 и 205. Расщепление белка с помощью обработки трипсином удаляет остатки С9 и С14 с образованием сегмента основного токсина, в котором остается только цистеин, относящийся к остатку С205. Palmer и др. (1997) продемонстрировали, что фенильные кольца флуоресцин-5-малеимида могут метиться радиоактивным йодом и затем реагировать с белком, содержащим сульфгидрильные группы (которые, к примеру, представлены в свободных остатках цистеина), что приводит к алкилированию трех цистеинов в белке и получению радиоактивно меченого белка. Транкированный трипсином основной токсин Cry1Fa содержит единственный остаток цистеина в положении, относящемся к С205, который таким образом является субстратом для алкилирования и радиоактивного мечения белка по единственному (специфичному) положению.

Флуоресцин-5-малеимид (Ф5-М) растворялся до 10 мМ в ДМСО (диметилсульфоксид), затем разводился до 1 мМ в фосфатном буфере (PBS; 20 мМ фосфат натрия, 0,15М NaCl, рН 7,5), в соответствии с коэффициентом молярной экстинкции Ф5-М (68000 М^-1 см^-1). К 70 мкл раствора PBS, содержащего две аликвоты шариков для йодирования Pierce (Thermo Fisher Scientific), 0,5 мКи Na¹²⁵I добавлялось за защитным экраном (аналогичная процедура проводилась с использованием нерадиоактивного NaI для получения (йодированного, нерадиоактивного) флуоресцентно-меченого белка основного токсина Cry1Fa). Раствор смешивался при комнатной температуре в течение 5 минут, далее добавлялось 10 мкл 1 мМ раствора Ф5-М. После 10 минут взаимодействия раствор удалялся из реакции йодирования пипетированием, и 2 мкл высокоочищенного транкированного трипсином белка основного токсина Cry1Fa в фосфатном буфере добавлялись в раствор. Белок инкубировался при 4°С в растворе йодированного Ф5-М в течение 48 часов, когда реакция останавливалась добавлением β-меркаптоэтанола до финальной концентрации 14 мМ. Реакционная смесь наносилась на центрифужную колонку Zebra™ (Invitrogen), уравновешенную 20 мМ ЦАПС, 150 мМ KCl, рН9, и центрифугировалась при 1500 g 2 минуты для удаления от белка не принявшего участия в реакции йода. Меченный радиоактивным ¹²⁵I и флуоресцином белок основного токсина Cry1Fa оценивался счетчиком гамма-излучения для определения его специфичной радиоактивности, предполагая 80% выход от изначального количества белка токсина.

Специфичная активность радиоактивно меченого белка основного токсина Cry1Fa была приблизительно 1,1 мкКи/мкг белка. Эта специфичная активность была низкой по сравнению с обычно предполагаемым уровнем мечения близких по массе белков с применением процесса йодирования на шариках. Предположительной причиной можно считать наличие единственного положения мечения (относящегося к С205), и (возможную) относительную недоступность позиции, которая по предположениям должна находиться глубоко в Домене I сегмента основного токсина (на основании расположения по сравнению с кристаллической структурой белка Cry1Aa).

Радиоактивно меченый белок также характеризовался с помощью анализа в НДС-ПААГ и визуализации проявкой фосфором для подтверждения того, что измеренная радиоактивная метка ковалентно связана с белком основного токсина Cry1Fa. Радиоактивная чистота меченного радиоактивным йодом белка основного токсина Cry1Fa (и дальнейшая детекция Cry1Fa, связанного со своим рецептором на ВМЩК) определялась НДС-ПААГ анализом с проявкой фосфором и измерением гамма-излучения. Окрашенные Кумасси НДС-ПААГ гели проявлялись упакованными в пленку Mylar™ (12 мкм толщиной) и экспонировались под экраном (35 см × 43 см) накопления фосфора Molecular Dynamics (Саннивейл, Калифорния) в течение 1 часа. Считывание гелей проводилось на фосфорном сканере Molecular Dynamics Storm 820, полученное изображение анализировалось с помощью программного обеспечения ImageQuant™. Только радиоактивная полоска с участками непосредственно над и под ней вырезалась из геля бритвой и оценивалась на счетчике гамма-излучения. В полоске белка основного токсина Cry1Fa и участках непосредственно над и под ней детектировалась радиоактивность. Радиоактивность не была детектирована в участках геля выше полоски белка основного токсина Cry1Fa. Некоторая радиоактивность была детектирована в регионе геля под полоской белка основного токсина Cry1Fa (т.е. в фрагментах меньше белка основного токсина Cry1Fa). Эти радиоактивные примеси скорее всего являются продуктами деградации белка основного токсина Cry1Fa.

Полученный таким способом флуоресцентно меченый (нерадиоактивный, йодированный) белок основного токсина Cry1Fa использовался в биоэкспериментах выкармливания насекомых для подтверждения того, что токсичность по отношению к насекомым не была нарушена, и меченный радиоактивным йодом (флуоресцентно-меченый) белок основного токсина Cry1Fa использовался в экспериментах связывания на пробах ВМЩК для подтверждения того, что его способность к связыванию не была нарушена.

Пример 4. Биоэксперименты выкармливания насекомых

Транкированные трипсином белки основного токсина Cry1Fa, либо меченные нерадиоактивным йодом с флуоресцин-5-малеимидом, либо немеченые, анализировались по отдельности в отношении их инсектицидного действия против Spodoptera frugiperda (травяная совка) в биоэкспериментах выкармливания с поверхностным нанесением. Личинки травяной совки разводились в яйцах колонии, полученной в коммерческом инсектарии (Benzon Research Inc, Карлайл, Пенсильвания).

Биоэксперименты проводились в пластиковых планшетах на 128 лунок, предназначенных специально для биоэкспериментов с насекомыми (C-D International, Питман, Нью-Джерси). В каждой лунке находилось по 0,5 мл корма для чешуекрылых Multispecies Lepidoptera (Southland Products, Лейк-Вилидж, Арканзас). Аликвота объемом 40 мкл очищенного белка основного токсина Cry1Fa, растворенного в разных концентрациях в 10 мМ ЦАПС рН 10,5, или 40 мкл контрольного раствора наносились пипеткой на поверхность корма каждой лунки (26,7 мкл/см²). Для одной пробы использовалось 16 лунок. Отрицательным контролем служил раствор буфера ЦАПС без содержания белка. Положительные контроли включали пробы полноразмерного токсина Cry1Fa. Обработанные плашки инкубировались в вытяжном шкафу до полного испарения жидкости с поверхности корма или ее впитывания в корм. Концентрация белков токсина Cry1Fa в корме подсчитывалась как количество (нг) белка токсина Cry1Fa на квадратный сантиметр поверхности лунки (1,5 см²).

В течение нескольких часов после вылупления отдельные личинки подбирались влажной щеткой из верблюжьего волоса и помещались на обработанный корм, одна личинка в лунку. Зараженные лунки заклеивались липкой прозрачной пленкой с отверстиями для газообмена (C-D International, Питман, Нью-Джерси). Участвующие в биоэксперименте плашки инкубировались в постоянных условиях среды (28°С, приблизительно 40% относительной влажности, 16:8 (освещение : затемнение)) в течение 5 дней, после чего записывалось общее количество помещенных на корм насекомых, количество мертвых насекомых и вес живых насекомых. Подсчитывался процент смертности и процент замедления роста для каждого нанесения. Замедление роста (ЗР) подсчитывалось по следующей формуле:

ЗР=[1-(ОВНН/ОЧНН)/(ОВНОК/ОЧНОК)],

где ОВНН - это общий вес насекомых в нанесении,

ОЧНН - это общее число насекомых в нанесении,

ОВНОК - это общий вес насекомых в отрицательном контроле (контроль с буфером),

ОЧНОК - это общее число насекомых в отрицательном контроле (контроль с буфером).

ЗР₅₀ определялась как концентрация белка токсина Cry1Fa в корме, при котором значение ЗР равно 50%, к примеру, рост насекомых на содержащем Cry1Fa корме составлял только половину от того же значения у насекомых на корме без белка Cry1Fa, как подсчитано выше. ЛК₅₀ (50% летальная концентрация; рассчитывается как концентрация белка токсина Cry1Fa в корме, при которой гибнут 50% исследуемых насекомых) не была определена, так как наблюдалась низкая смертность в течение пяти дней эксперимента. Статистический анализ (One-Way ANOVA) проводился с использованием программного обеспечения JMP (SAS, Кэри, Северная Каролина).

Меченый и немеченый белки основного токсина Cry1Fa замедляли рост личинок S.frugiperda приблизительно одинаково, вызывая 50% замедление роста при концентрации между 33 нг/см² и 100 нг/см² (Фигура 1). Этот результат показал, что мечение транкированного трипсином белка основного токсина Cry1Fa йодированным флуоресцин-5-малеимидом не вызывает потерю инсектицидного действия.

Пример 5. Получение везикул мембраны щеточной каймы (ВМЩК)

Получение растворенных ВМЩК: S.frugiperda и Ostrinia nubilalis (европейский кукурузный мотылек) на последней стадии личинки выдерживались ночь без питания и затем вскрывались после охлаждения на льду в течение 15 минут. Ткань среднего отдела кишечника удалялась из полости тела, оставляя задний отдел кишечника прикрепленным к наружной оболочке. Средний отдел кишечника помещался в превышающий в 9 раз объем образца ледяной буфер для гомогенизации (17 мМ основной Трис, рН 7,5, 300 мМ маннитол и 5 мМ ЭГТА (этиленгликольтетрауксусная кислота)) с добавлением смеси ингибиторов протеаз (Sigma Aldrich P-2714), разбавленном в соответствии с рекомендациями поставщика. Финальная концентрация компонентов смеси (мкМ) была для ингибитора AEBSF (500), ЭДТА (250), бестатина (32), Е-64 (0,35), леупептина (0,25) и апротинина (0,075). Ткань гомогенизировалась за 15 встряхиваний стеклянного гомогенизатора тканей. ВМЩК выделялись осаждением c MgCl₂, описанным в публикации Wolfersberger (1993). Вкратце, равный объем 24 мМ MgCl₂ смешивался с гомогенатом среднего отдела кишечника, перемешивался в течение 5 минут и инкубировался на льду 20 минут. Раствор центрифугировался при 2500 g в течение 15 минут при 4°С. Супернатант отбирался на хранение, и осадок ресуспендировался в половине объема буфера для гомогенизации и снова центрифугировался. Два супернатанта сливались, центрифугировались при 27000g в течение 30 минут при 4°С для получения фракции ВМЩК. Осад