Мыши, экспрессирующие гибридную легкую цепь иммуноглобулина

Мыши, экспрессирующие гибридную легкую цепь иммуноглобулина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Генетически модифицированные мыши, которые содержат последовательность лямбда-вариабельной (Vλ) легкой цепи мыши или человека, функционально связанную с константной областью легкой цепи (λ или каппа(κ)) человека или мыши. Генетически модифицированные мыши, которые экспрессируют связывающие эпитоп белки, которые содержат легкую цепь иммуноглобулина, содержащую вариабельный домен, полученный из сегмента гена лямбда-вариабельной цепи человека (hVλ), сегмента гена лямбда-J (hJλ) человека и константного домена легкой цепи (C_L) мыши. Генетически модифицированные мыши, содержащие неперегруппированную вариабельную последовательность нуклеиновых кислот лямбда(λ)-легкой цепи иммуноглобулина в эндогенном локусе легкой цепи мыши. Мыши, способные к перегруппирации и экспрессии химерной легкой цепи λ человека/C_L мыши из эндогенного локуса легкой цепи, который содержит замену всех эндогенных сегментов гена вариабельной области легкой цепи мыши на один или более сегментов гена hVλ и один или более сегментов гена hJλ. Подвергнутые соматической мутации антитела, содержащие домены hVλ и домены C_L мыши.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Из уровня технике известны мыши, которые экспрессируют антитела, являющиеся полностью человеческими, или частично человеческими и частично мышиными. Например, сообщалось о трансгенных мышах, которые экспрессировали полностью человеческие антитела из трансгенов, содержащих гены вариабельной области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина человека. Также известны генетически модифицированные мыши, в которых эндогенные сегменты гена вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) и вариабельной области каппа-(κ) легкой цепи (LCVR) мыши были заменены на сегменты генов HCVR и LCVR человека, и которые продуцируют химерные антитела с химерной человеческой/мышиной каппа-цепью.

Легкие цепи антител кодируются одним или двумя отдельными локусами: каппа (κ) и лямбда (λ). Легкие цепи антител мыши в основном имеют κ-тип. Соотношение использования легких цепей κ и λ у человека составляет около 60:40, тогда как у мышей она составляет около 95:5. Отклонение в использовании легких цепей κ у мышей по имеющимся данным сохраняется у генетически модифицированных мышей, способных экспрессировать полностью или частично человеческие антитела. Таким образом, оказывается, что мыши, которые экспрессируют полностью или частично человеческие антитела, ограничены в использовании вариабельной области лямбда-цепи.

В данной области существует потребность в получении лямбда-вариабельных областей, мыши или человека, для применения в создании эпитоп-связывающих белков. В данной области существует потребность в мышах, которые экспрессировали бы полностью или частично человеческие антитела, чтобы при этом мыши демонстрировали повышенное использование лямбда-вариабельных областей (Vλ).

В данной области существует потребность в мышах, которые экспрессировали бы полностью или частично антитела человека, чтобы при этом мыши демонстрировали повышенное использование λ-вариабельных областей (Vλ).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к генетически модифицированным мышам, эмбрионам, клеткам, тканям, а также к конструкциям нуклеиновой кислоты для модификации мышей, и к способам и композициям для их получения и применения. Изобретение относится к мышам и клеткам, которые создают лямбда (λ)-вариабельные области (человеческие или не являющиеся человеческими) в контексте каппа (κ)-легкой цепи. Также изобретение относися к мышам и клеткам, которые создают λ-вариабельные области человека в контексте κ- или λ-легкой цепи, например, из эндогенного локуса легкой цепи мыши. Также изобретение относится к способам получения антител, которые содержать лямбда-вариабельные области. Также изобретение относится к способам отбора тяжелых цепей, которые экспрессируются с родственными лямбда-вариабельными областями.

Изобретение относится к химерным и человеческим связывающим антиген белкам (например, антителам), и кодирующим их нуклеиновым кислотам, которые содержат подвергнутые соматическому видоизменению вариабельные области, включая антитела, которые имеют легкие цепи, содержащие вариабельный домен, полученный из сегмента генов Vλ или Jλ человека, слитого с константным доменом легкой цепи мыши.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая экспрессирует последовательность λ-вариабельной области человека в легкой цепи, которая содержит константную область мыши. В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая экспрессирует последовательность λ-вариабельной области человека в легкой цепи, которая содержит κ-константную область. В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая экспрессирует из эндогенного локуса легкой цепи мыши легкую цепь, которая содержит последовательность λ-вариабельной области человека. В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая содержит перегруппированный ген легкой цепи, содержащий λ-вариабельную последовательность человека, соединенную с последовательностью константной области мыши; в одном из вариантов осуществления последовательность константной области мыши представляет собой λ-константную последовательность; в одном из вариантов осуществления последовательность константной области мыши представляет собой κ-константную последовательность.

В одном из аспектов изобретение относится к генетически модифицированной мыши, при этом мышь содержит неперегруппированный сегмент гена вариабельной области λ-легкой цепи (hVλ) человека и соединительный сегмент гена λ (hJλ) человека. В одном из вариантов осуществления неперегруппированные hVλ и hJλ находятся в локусе легкой цепи мыши. В одном из вариантов осуществления неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ находятся в трансгене и функционально связаны с последовательностью константной области человека и мыши. В одном из вариантов осуществления неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ находятся в эписоме. В одном из вариантов осуществления мышь способна продуцировать иммуноглобулин, который содержит легкую цепь, полученную из неперегруппированной последовательности hVλ и последовательности hJλ и последовательности нуклеиновой кислоты константного домена легкой цепи (C_L) мыши. Также изобретение относится к способам и композициям для получения и применения генетически модифицированных мышей. Изобретение относится к антителам, которые содержат (a) вариабельный домен тяжелой цепи (hV_H) человека, слитый с константной областью тяжелой цепи мыши, и (b) Vλ человека, слитый с доменом C_L мыши; в том числе антитела, в которых один или более вариабельных доменов подвергались соматической мутации, например, в процессе отбора антител или иммунных клеток в мыши по изобретению. В одном из вариантов осуществления неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ функционально связаны с κ-константной областью (Cκ) человека или мыши. В одном из вариантов осуществления неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ функционально связаны с λ-константной областью (Cλ) человека или мыши.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая содержит в своей зародышевой линии, в эндогенном локусе легкой цепи мыши, где последовательность вариабельной области λ-легкой цепи человека, где последовательность лямбда-вариабельной области человека экспрессируется в легкой цепи, которая содержит последовательность гена константной области иммуноглобулина мыши.

В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой λ-локус. В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой κ-локус.

В одном из вариантов осуществления у мыши отсутствует эндогенная вариабельная последовательность легкой цепи в эндогенном локусе легкой цепи мыши.

В одном из вариантов осуществления все или по существу все эндогенные сегменты гена вариабельной области легкой цепи мыши заменены на один или более сегментов гена λ-вариабельной области человека.

В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельной области λ-легкой цепи человека содержит Jλ-последовательность человека. В одном из вариантов осуществления Jλ-последовательность человека выбрана из группы, состоящей из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7 и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельной области λ-легкой цепи человека содержит фрагмент кластера A локуса легкой цепи человека. В конкретном варианте осуществления фрагмент кластера A локуса λ-легкой цепи человека простирается от hVλ3-27 до hVλ3-1.

В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельной области λ-легкой цепи человека содержит фрагмент кластера B локуса легкой цепи человека. В конкретном варианте осуществления фрагмент кластера B локуса легкой цепи λ человека простирается от hVλ5-52 до hVλ1-40.

В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельной области λ-легкой цепи человека содержит геномный фрагмент кластера A и геномный фрагмент кластера B. В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельной области λ-легкой цепи человека содержит по меньшей мере один генный сегмент из кластера A и по меньшей мере один сегмент гена из кластера B.

В одном из вариантов осуществления более чем 10% интактного спектра легкой цепи мыши получается из по меньшей мере двух сегментов гена hVλ, выбранных из 2-8, 2-23, 1-40, 5-45 и 9-49. В одном из вариантов осуществления более чем 10% интактного спектра легкой цепи мыши получается из по меньшей мере трех сегментов гена hVλ, выбранных из 2-8, 2-23, 1-40, 5-45 и 9-49. В одном из вариантов осуществления более чем 30% интактного спектра легкой цепи мыши получается из по меньшей мере четырех сегментов гена hVλ, выбранных из 2-8, 2-23, 1-40, 5-45 и 9-49.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит λ-вариабельную последовательность человека, слитую с константной областью мыши, при этом мышь демонстрирует соотношение использования κ к использованию λ, составляющую около 1:1.

В одном из вариантов осуществления иммуноглобулин экспрессируется из эндогенного локуса легкой цепи мыши.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая содержит последовательность вариабельной области λ-легкой цепи (Vλ) и по меньшей мере одну J-последовательность (J), смежную с последовательностью константной области κ-легкой цепи мыши.

В одном из вариантов осуществления у мыши отсутствует функциональный сегмент гена мыши Vκ и/или сегмент гена мыши Jκ.

В одном из вариантов осуществления Vλ представляет собой Vλ человека (hVλ), и J представляет собой Jλ человека (hJλ). В одном из вариантов осуществления hVλ и hJλ являются неперегруппированными сегментами гена.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит множество неперегруппированных сегментов гена hVλ и по меньшей мере один сегмент гена hJλ. В конкретном варианте осуществления множество неперегруппированных сегментов гена hVλ составляет по меньшей мере 12 сегментов гена, по меньшей мере 28 сегментов гена или, по меньшей мере 40 сегментов гена.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один указанный сегмент гена hJλ выбирается из группы, состоящей из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7 и комбинации указанного.

В одном из вариантов осуществления эндогенный локус λ-легкой цепи мыши удален полностью или частично.

В одном из вариантов осуществления последовательность константной области κ-легкой цепи мыши представляет собой эндогенный локус κ-легкой цепи мыши.

В одном из вариантов осуществления от около 10% до около 45% B-клеток мыши экспрессирует антитело, которое содержит легкую цепь, содержащую вариабельный домен λ-легкой цепи человека (Vλ) и константный домен κ-легкой цепи мыши (Cκ).

В одном из вариантов осуществления λ-вариабельный домен человека получают из перегруппированной последовательности hVλ/hJλ, выбираемой из группы, состоящей из 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 и 1-51/1.

В одном из вариантов осуществления мышь дополнительно содержит межгенную область Vκ-Jκ человека из локуса κ-легкой цепи человека, при этом межгенная область Vκ-Jκ человека является смежной с последовательностью Vλ и последовательностью J. В конкретном варианте осуществления межгенную область Vκ-Jκ человека помещают между последовательностью Vλ и последовательностью J.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая содержит (a) от по меньшей мере 12 до по меньшей мере 40 неперегруппированных сегментов гена вариабельной области λ-легкой цепи человека и по меньшей мере один сегмент гена Jλ человека в эндогенном локусе легкой цепи мыши; (b) межгенную последовательность Vκ-Jκ человека, расположенную между, от по меньшей мере 12 до по меньшей мере 40 сегментами гена вариабельной области легкой цепи человека и по меньшей мере одной последовательностью Jλ человека; при этом мышь экспрессирует антитело, которое содержит легкую цепь, содержащую Vλ-домен человека и Cκ-домен мыши.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая экспрессирует антитело, которое содержит легкую цепь, содержащую λ-вариабельную последовательность и κ-константную последовательность.

В одном из вариантов осуществления мышь демонстрирует соотношение использования κ к использованию λ, составляющую около 1:1.

В одном из вариантов осуществления популяция незрелых B-клеток, полученная из костного мозга мыши, демонстрирует пропорцию использования κ к использованию λ, составляющую около 1:1.

В одном из аспектов изобретение относится к генетически модифицированной мыши, при этом мышь содержит неперегруппированные сегменты генов иммуноглобулина Vλ и Jλ, функционально связанные с локусом легкой цепи мыши, который содержит ген C_L мыши.

В одном из вариантов осуществления сегменты генов Vλ и/или Jλ представляют собой сегменты генов человека. В одном из вариантов осуществления сегменты генов Vλ и/или Jλ представляют собой сегменты генов мыши, и C_L представляет собой Cκ.

В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой локус κ-легкой цепи. В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой локус λ-легкой цепи.

В одном из вариантов осуществления неперегруппированные сегменты генов Vλ и Jλ находятся в эндогенном локусе легкой цепи мыши.

В одном из вариантов осуществления неперегруппированные сегменты генов иммуноглобулина Vλ и Jλ находятся в трансгене.

В одном из вариантов осуществления мышь дополнительно содержит замену одного или более сегментов генов тяжелой цепи V, D и/или J на один или более сегментов генов V, D и/или J человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит неперегруппированный сегмент генов иммуноглобулина Vλ и Jλ в эндогенном локусе κ-легкой цепи мыши, который содержит ген мыши Cκ.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит неперегруппированный сегмент вариабельного гена λ-легкой цепи иммуноглобулина (Vλ) человека и λ-соединительный сегмент гена (Jλ) в эндогенном локусе λ-легкой цепи мыши, который содержит ген мыши Cλ.

В одном из вариантов осуществления локус вариабельного гена легкой цепи ("локус V_L") содержит по меньшей мере один сегмент гена Vλ человека (hVλ). В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере один сегмент гена Jλ человека (hJλ). В другом варианте осуществления локус V_L содержит вплоть до четырех сегментов гена hJλ. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит смежную последовательность, содержащую геномную последовательность λ человека и последовательность κ человека.

В одном из вариантов осуществления локус вариабельного гена κ-легкой цепи ("локус κ") содержит по меньшей мере один сегмент гена Vλ человека (hVλ). В одном из вариантов осуществления локус κ содержит по меньшей мере один сегмент гена Jλ человека (hJλ). В одном из вариантов осуществления локус κ содержит вплоть до четырех сегментов гена hJλ. В одном из вариантов осуществления локус κ содержит по меньшей мере один hVλ и по меньшей мере один hJλ, и не содержит, или по существу не содержит, функциональный сегмент гена области Vκ, и не содержит, или по существу не содержит, функциональный сегмент гена области Jκ. В одном из вариантов осуществления мышь не содержит функционального сегмента гена области Vκ. В одном из вариантов осуществления мышь не содержит функционального сегмента гена области Jκ.

В одном из вариантов осуществления локус вариабельного гена λ-легкой цепи ("локус λ") содержит по меньшей мере один сегмент гена hVλ. В одном из вариантов осуществления локус λ содержит по меньшей мере один сегмент гена Jλ человека (hJλ). В другом варианте осуществления локус λ содержит вплоть до четырех сегментов гена hJλ.

В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит множество hVλ. В одном из вариантов осуществления множество hVλ выбрано таким образом, чтобы в результате экспрессировался спектр вариабельных областей λ-легкой цепи, который отражал бы около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80% или около 90% или более использования Vλ, наблюдаемого у человека. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит сегменты генов hVλ 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21 и их комбинацию.

В одном из вариантов осуществления hVλ включают 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 и 3-12. В конкретном варианте осуществления локус V_L содержит смежную последовательность локуса λ-легкой цепи человека, которая простирается от Vλ3-12 до Vλ3-1. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 hVλ. В конкретном варианте осуществления hVλ включают 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 и 3-12. В конкретном варианте осуществления локус V_L содержит смежную последовательность λ-локуса человека, которая простирается от Vλ3-12 до Vλ3-1. В одном из вариантов осуществления локус V_L находится в эндогенном κ-локусе. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном κ-локусе, и эндогенный локус λ-легкой цепи мыши удаляется полностью или частично. В одном из вариантов осуществления локус V_L находится в эндогенном λ-локусе. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном λ-локусе, и эндогенный κ-локус удаляется полностью или частично.

В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит от 13 до 28 или более hVλ. В конкретном варианте осуществления hVλ включают 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25 и 3-27. В конкретном варианте осуществления локус κ содержит смежную последовательность λ-локуса человека, которая простирается от Vλ3-27 до Vλ3-1. В одном из вариантов осуществления локус V_L находится в эндогенном κ-локусе. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном κ-локусе, и эндогенный локус λ-легкой цепи мыши удаляется полностью или частично. В другом варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном λ-локусе. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном λ-локусе, и эндогенный κ-локус удаляется полностью или частично.

В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит 29-40 hVλ. В конкретном варианте осуществления локус κ содержит прилегающую последовательность локуса λ человека, которая простирается от Vλ3-29 до Vλ3-1, и прилегающую последовательность локуса λ человека, которая простирается от Vλ5-52 до Vλ1-40. В конкретном варианте осуществления вся, или практически вся, последовательность между hVλ1-40 и hVλ3-29 в генетически модифицированной мыши состоит по существу из последовательности λ человека длиной приблизительно 959 п.о., встречающейся в природе (например, в человеческой популяции) в 5'-3' направлении генного сегмента hVλ1-40 (в прямом направлении 3'-нетранслируемой области), участок рестрикционного фермента (например, PI-SceI), за которым следует последовательность λ человека в 3'-5' направлении от генного сегмента hVλ3-29, длинной приблизительно 3431 п.о. встречающийся в природе. В одном из вариантов осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе κ мыши. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе κ мыши и эндогенный локус легкой цепи λ мыши делетирован частично или полностью. В другом варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе λ мыши. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе λ мыши и эндогенный локус κ мыши делетирован частично или полностью.

В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере один hVλ. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит множество hJλ. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 hJλ. В конкретном варианте осуществления локус V_L содержит четыре hJλ. В конкретном варианте осуществления четыре hJλ представляют собой hJλ1, hJλ2, hJλ3 и hJλ7. В одном из вариантов осуществления локус V_L представляет собой локус κ. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном κ-локусе, и эндогенный локус λ-легкой цепи мыши удаляется полностью или частично. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит один hJλ. В конкретном варианте осуществления один hJλ представляет собой hJλ1. В одном из вариантов осуществления локус V_L находится в эндогенном κ-локусе. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном κ-локусе, и эндогенный локус λ-легкой цепи мыши удаляется полностью или частично. В другом варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном λ-локусе. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном λ-локусе, и эндогенный κ-локус удаляется полностью или частично.

В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере один hVλ, по меньшей мере один hJλ и ген Cκ мыши. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере один hVλ, по меньшей мере один hJλ, и ген Cλ мыши. В конкретном варианте осуществления ген Cλ мыши представляет собой Cλ2. В конкретном варианте осуществления ген Cλ мыши по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99% идентичен Cλ2 мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит замену в эндогенном κ-локусе мыши эндогенных сегментов гена Vκ мыши на один или более сегментов генов hVλ, при этом сегменты генов hVλ функционально связаны с эндогенным геном Cκ-области мыши, в результате чего у мыши происходит перегруппировка сегментов генов Vλ человека и экспрессия обратной химерной легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит домен Vλ человека и Cκ мыши. В одном из вариантов осуществления 90-100% неперегруппированных сегментов генов Vκ мыши заменяются на по меньшей мере один неперегруппированный сегмент генов hVλ. В конкретном варианте осуществления все или по существу все эндогенные сегменты генов Vκ мыши заменяются на по меньшей мере один неперегруппированный сегмент генов hVλ. В одном из вариантов осуществления замена происходит на, по меньшей мере 12, по меньшей мере 28 или по меньшей мере 40 неперегруппированных сегментов генов hVλ. В одном из вариантов осуществления замена происходит на, по меньшей мере 7 функциональных неперегруппированных сегментов генов hVλ, по меньшей мере 16 функциональных неперегруппированных сегментов генов hVλ, или, по меньшей мере 27 функциональных неперегруппированных сегментов генов hVλ. В одном из вариантов осуществления мышь имеет замену всех сегментов генов Jκ мыши на по меньшей мере один неперегруппированный сегмент генов hJλ. В одном из вариантов осуществления данный по меньшей мере один неперегруппированный сегмент генов hJλ выбирается из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7 и комбинации указанного. В конкретном варианте осуществления указанные один или более сегментов генов hVλ выбираются из сегментов генов hVλ 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52 и комбинации указанного. В конкретном варианте осуществления данный по меньшей мере один неперегруппированный сегмент генов hJλ выбирается из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7 и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления мышь имеет замену эндогенных сегментов генов Vλ мыши в эндогенном λ-локусе мыши на один или более сегментов генов Vλ человека в эндогенном λ-локусе мыши, при этом сегменты генов hVλ функционально связаны с геном области Cλ мыши, в результате чего у мыши происходит перегруппировка сегментов генов hVλ и экспрессия обратной химерной легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит домен hVλ и Cλ мыши. В конкретном варианте осуществления ген Cλ мыши представляет собой Cλ2. В конкретном варианте осуществления ген Cλ мыши по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичен Cλ2 мыши. В одном из вариантов осуществления 90-100% неперегруппированных сегментов генов Vλ мыши заменяются на по меньшей мере один неперегруппированный сегмент генов hVλ. В конкретном варианте осуществления все или по существу все эндогенные сегменты генов Vλ мыши заменяются на по меньшей мере один неперегруппированный сегмент генов hVλ. В одном из вариантов осуществления замена происходит на по меньшей мере 12, по меньшей мере 28 или по меньшей мере 40 неперегруппированных сегментов генов hVλ. В одном из вариантов осуществления замена происходит на по меньшей мере 7 функциональных неперегруппированных сегментов генов hVλ, по меньшей мере 16 функциональных неперегруппированных сегментов генов hVλ, или по меньшей мере 27 функциональных неперегруппированных сегментов генов hVλ. В одном из вариантов осуществления мышь имеет замену всех сегментов генов Jλ мыши на по меньшей мере один неперегруппированный сегмент генов hJλ. В одном из вариантов осуществления данный по меньшей мере один неперегруппированный сегмент генов hJλ выбрана из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7 и их комбинации. В конкретном варианте осуществления один или более сегментов генов hVλ выбираются из сегментов генов hVλ 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52 и комбинации указанного. В конкретном варианте осуществления данный по меньшей мере один неперегруппированный сегмент генов hJλ выбирается из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7 и их комбинации.

В одном из аспектов изобретение относится к генетически модифицированной мыши, которая содержит последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека, расположенную в эндогенном локусе κ-легкой цепи мыши.

В одном из вариантов осуществления последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека находится в эндогенном локусе κ-легкой цепи мыши, которая содержит hVλ и сегмент генов hJλ, и последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека размещается между hVλ и сегментами генов hJλ. В конкретном варианте осуществления сегменты генов hVλ и hJλ способны к рекомбинации с образованием функционального вариабельного домена λ-легкой цепи человека у мыши.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к мыши, которая содержит совокупность генных сегментов hVλ и один или несколько hJλ, и последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека расположена, относительно транскрипции, в 5'-3' направлении от самой проксимальной или 3' последовательности hVλ, и в 3'-5' направлении или 5' от первой последовательности hJλ.

В одном из вариантов осуществления межгенная область Vκ-Jκ человека представляет собой область, расположенную приблизительно в 130 п.о. в 5'-3' направлении или 3' от генного сегмента Vκ4-1 человека, приблизительно в 130 п.о. в 5'-3' направлении от 3'-нетранслируемой области генного сегмента Vκ4-1 человека, и перекрывает приблизительно 600 п.о. в 3'-5' направлении или 5' от генного сегмента Jκ1 человека. В определенном варианте осуществления размер межгенной области Vκ-Jκ человека составляет приблизительно 22,8 т.п.о.. В одном из вариантов осуществления межгенная область Vκ-Jκ приблизительно на 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, или приблизительно на 95% или более, идентична межгенной области Vκ-Jκ человека, простирающейся от конца 3'-нетранслируемой области генного сегмента Vκ4-1 человека до приблизительно 600 п.о. в 3'-5' направлении генного сегмента Jκ1 человека. В одном из вариантов осуществления межгенная область Vκ-Jκ содержит последовательность SEQ ID NO:100. В определенном варианте осуществления межгенная область Vκ-Jκ содержит функциональный фрагмент последовательности SEQ ID NO:100. В определенонм варианте осуществления межгенная область Vκ-Jκ представляет собой последовательность SEQ ID NO:100.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, клеткам мыши (например, эмбриональная стволовая клетка мыши), эмбриону мыши и тканям мыши, которые содержат описанную последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека, где последовательность межгенной области является эктопической. В определенном варианте осуществления эктопическая последовательность расположена в гуманизированном эндогенном локусе иммуноглобулина мыши.

В одном из аспектов изобретение относится к выделенной конструкции нуклеиновой кислоты, которая содержит описанную последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека. В одном из вариантов осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит направляющие плечи для нацеливания последовательности межгенной области Vκ-Jκ человека на локус легкой цепи мыши. В определенном варианте осуществления локус легкой цепи мыши представляет собой локус κ. В определенном варианте осуществления данные направляющие плечи нацеливают данную последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека на модифицированный эндогенный локус κ мыши, где нацеливание относится к положению между последовательностью hVλ и последовательностью hJλ.

В одном из аспектов изобретение относится к генетически модифицированной мыши, при этом мышь содержит не более двух аллелей легкой цепи, при этом аллели легкой цепи содержат (a) неперегруппированный сегмент генов иммуноглобулина Vλ и Jλ человека в эндогенном локусе легкой цепи мыши, который содержит ген C_L мыши; и (b) неперегруппированный сегмент генов иммуноглобулина V_L и J_L в эндогенном локусе легкой цепи мыши, который содержит ген C_L мыши.

В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой локус κ. В другом варианте осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой локус λ.

В одном из вариантов осуществления не более чем два аллеля легкой цепи выбираются из аллеля κ, аллеля λ, двух аллелей κ и двух аллелей λ. В конкретном варианте осуществления одним из двух аллелей легкой цепи является аллель λ, который содержит ген Cλ2.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит один функциональный локус легкой цепи иммуноглобулина и один нефункциональный локус легкой цепи, при этом функциональный локус легкой цепи содержит неперегруппированный сегмент генов иммуноглобулина Vλ и Jλ человека в эндогенном локусе κ-легкой цепи мыши, который содержит ген Cκ мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит один функциональный локус легкой цепи иммуноглобулина и один нефункциональный локус легкой цепи, при этом функциональный локус легкой цепи содержит неперегруппированный сегмент генов иммуноглобулина Vλ и Jλ человека в эндогенном локусе λ-легкой цепи мыши, который содержит ген Cλ мыши. В одном из вариантов осуществления ген Cλ представляет собой Cλ2. В конкретном варианте осуществления ген Cλ мыши, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичен Cλ2 мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь дополнительно содержит по меньшей мере один аллель тяжелой цепи иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления этот по меньшей мере один аллель тяжелой цепи иммуноглобулина содержит сегмент генов V_H человека, сегмент генов D_H человека и сегмент генов J_H человека в эндогенном локусе тяжелой цепи мыши, который экспрессирует тяжелую цепь человека/мыши. В конкретном варианте осуществления мышь содержит два аллеля тяжелой цепи иммуноглобулина, и мышь экспрессирует тяжелую цепь человека/мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит первый аллель легкой цепи, который содержит неперегруппированный hVκ и неперегруппированный hJκ в эндогенном локусе κ мыши, который содержит эндогенный ген Cκ; и второй аллель легкой цепи, который содержит неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ в эндогенном локусе κ мыши, который содержит эндогенный ген Cκ. В конкретном варианте осуществления первый и второй аллели легкой цепи являются единственными функциональными аллелями легкой цепи у генетически модифицированной мыши. В конкретном варианте осуществления мышь содержит нефункциональный локус λ. В одном из вариантов осуществления генетически модифицированная мышь не экспрессирует легкую цепь, которая содержит λ-константную область.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит первый аллель легкой цепи, который содержит неперегруппированный hVκ и неперегруппированный hJκ, в эндогенном локусе κ мыши, который содержит эндогенный ген Cκ; и второй аллель легкой цепи, который содержит неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ, в эндогенном локусе λ мыши, который содержит эндогенный ген Cλ. В конкретном варианте осуществления первый и второй аллели легкой цепи являются единственными функциональными аллелями легкой цепи у генетически модифицированной мыши. В одном из вариантов осуществления эндогенный ген Cλ представляет собой Cλ2. В конкретном варианте осуществления ген Cλ мыши по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичен Cλ2 мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит шесть аллелей иммуноглобулина, при этом первый аллель содержит неперегруппированный сегмент генов иммуноглобулина Vλ и Jλ в эндогенном локусе κ-легкой цепи мыши, который содержит ген мыши Cκ, второй - содержит неперегруппированный сегмент генов иммуноглобулина Vκ и Jκ в эндогенном локусе κ-легкой цепи мыши, который содержит ген мыши Cκ, третий - содержит неперегруппированный сегмент генов иммуноглобулина Vλ и Jλ в эндогенном локусе λ-легкой цепи мыши, который содержит ген мыши Cλ, четвертый и пятый - независимо друг от друга содержат неперегруппированный сегмент генов VH и DH, и JH в эндогенном локусе тяжелой цепи мыши, который содержит ген тяжелой цепи мыши, и шестой - содержит (a) неперегруппированный сегмент генов иммуноглобулина Vλ и Jλ в эндогенном локусе λ-легкой цепи мыши, который содержит ген мыши Cλ, или (b) локус λ, который является нефункциональным, или (c) имеет полное или частичное удаление локуса λ.

В одном из вариантов осуществления первый аллель содержит неперегруппированный hVλ и hJλ. В одном из вариантов осуществления второй аллель содержит неперегруппированный hVκ и hJκ. В одном из вариантов осуществления третий аллель содержит неперегруппированный hVλ и hJλ. В одном из вариантов осуществления четвертый и пятый аллели содержат независимо друг от друга неперегруппированный hV_H и hD_H, и hJ_H. В одном из вариантов осуществления шестой аллель содержит эндогенный локус λ мыши, который удаляется полностью или частично.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит шесть аллелей иммуноглобулина, где первый аллель содержит неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ в эндогенном локусе легкой цепи κ мыши, который содержит ген Сκ мыши, второй аллель содержит неперегруппированный генный сегмент Vκ и Jκ иммуноглобулина в эндогенном локусе легкой цепи κ мыши, который содержит ген Сκ мыши, третий аллель содержит неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ иммуноглобулина в эндогенном локусе легкой цепи λ мыши, который содержит ген Сλ мыши, четвертый и пятый аллели, каждый независимо друг от друга, содержат неперегруппированный генный сегмент V_H и D_H и J