Синтез эластического волокна in vivo

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области косметологии и представляет собой способ восстановления эластической структуры кожи индивидуума, включающий следующие этапы: обеспечение присутствия индивидуума, нуждающегося в восстановлении эластической структуры; определение участка обработки на коже индивидуума, где участок обработки представляет собой участок кожи, в котором необходимо восстановить эластическую структуру; инъекции тропоэластиновой композиции в ткань кожи в пределах участка обработки, чтобы создать количество тропоэластина в пределах участка обработки, которое увеличено по сравнению с кожей, находящейся за пределами участка обработки; где тропоэластиновую композицию инъецируют в ткань кожи в пределах участка обработки в соответствии с предварительно установленным графиком обработки, определяющим заданное количество обработок, при котором каждую обработку в виде инъекции осуществляют в заданный момент времени; и где, по меньшей мере, одна обработка из графика обработки включает многократные инъекции, причем каждую инъекцию в обработке осуществляют в месте инъекции, отстоящем от других мест инъекции на предварительно установленное расстояние, тем самым поддерживая количество тропоэластина в участке обработки в течение предварительно установленного периода времени в соответствии с графиком обработки для восстановления эластической структуры кожи индивидуума. Изобретение обеспечивает сохранение тропоэластина в месте обработки с тем, чтобы обеспечить возможность клеткам утилизировать эту молекулу в качестве субстрата в эластогенезе и активацию фибробластов, и продуцирование ими заново эластических волокон. 13 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл., 2 пр.

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к восстановлению или воссозданию эластичности ткани, тем самым улучшая внешний вид и/или функции старой или поврежденной ткани.

Предпосылки изобретения

Ссылка на какой-либо документ известного уровня техники в настоящем описании не принимается и не должна приниматься как признание или какая-либо форма предположения, что этот документ известного уровня техники входит в состав общедоступных сведений в Австралии или какой-нибудь другой стране и территории, или, что можно ожидать, на законных основаниях, что этот документ известного уровня техники специалистом в данной области устанавливает, понимает и рассматривает как релевантный.

Старение и повреждение ткани связаны с дегенерацией внеклеточного матрикса, приводящей к нарушению структуры и/или функции ткани. Дряблая кожа, вялая подкожная ткань, снижение плотности внеклеточного матрикса, образование морщин, растяжки и фиброз являются физическими проявлениями дегенерации. В зависимости от соответствующей ткани нарушение эластической функции может проявляться как снижение жизненной емкости легких или снижение способности сердца к увеличению минутного объема или снижение растяжимости и/или упругости различных клапанов и сфинктеров.

Приблизительно 20 лет программы научно-исследовательских работ пытались использовать различные молекулы внеклеточного матрикса в серии клинических и косметических вмешательств для коррекции нарушения структуры и функции ткани. Ключевыми молекулами, представляющими интерес, были молекулы, которые являются субстратом соответствующих волокон внеклеточного матрикса, а именно коллаген и эластин. Как правило, подход заключался в использовании этих биоматериалов, либо в качестве имплантатов, либо наполнителей для увеличения внешнего вида ткани путем заполнения пустот ткани или путем накачивания или заполнения ткани, или в использовании этих волокон в качестве имплантатов или наполнителей для нормализации нарушенной функции.

Некоторые исследователи считали эластин предпочтительным для этой задачи, поскольку, в отличие от коллагена, его можно использовать для образования эластических имплантатов и наполнителей. Ранние работы были сосредоточены на синтезе рекомбинантных форм тропоэластина, из которых затем формировались коацерваты и образовывались поперечные связи химическим или ферментативным путем либо до, либо после введения индивидууму, чтобы эластический имплантат или наполнитель формировался либо ex vivo, либо in vivo для заполнения пустот в тканях или для увеличения или восстановления первоначальной формы ткани. См., например, WO 1994/14958; WO 1999/03886; WO 2000/04043. В WO 2010/102337 упоминается важность концентрации твердых веществ для формирования инъекционного поперечно-сшитого биоматериала.

Если использовался in vivo ферментативный путь образования поперечных сшивок, использовали рекомбинантную или другую экзогенную лизилоксидазу. В USSN 09/498305 описывается один подход для ферментативного пути образования поперечных сшивок в мономерах тропоэластина in vivo путем введения композиции, содержащей экзогенную лизилоксидазу и мономеры тропоэластина.

Другой подход к образованию материала, напоминающего по определенным характеристикам поперечно-сшитый тропоэластин, раскрыт в WO 2008/058323, согласно которому эластический материал, содержащий тропоэластин без поперечных сшивок, образуется в щелочных условиях.

В каждом из вышеприведенных примеров для запуска образования имплантата или наполнителя используют экзогенный тропоэластин и средство, вызывающее образование поперечных сшивок, или щелочные условия. Время образования эластического конечного продукта зависит от концентрации тропоэластина, средства, вызывающего образование поперечных сшивок, и соответствующих условий, так что конечный продукт образуется в результате процесса, который происходит за пределами клеток.

Также рассматривается ряд других применений тропоэластина, включающих применение: (i) в качестве покрытия для ран (WO 94/14958); (ii) в качестве средства доставки активных ингредиентов с получением биоразлагаемых или биодиссоциируемых составов с медленным высвобождением (WO 94/14958); (iii) в качестве связывающего вещества для GAG (WO 99/03886); (iv) для противодействия отложению эластина (WO 99/03886); и (v) в местах ранения, локализациях повреждения тканей и ремоделирования, где обычно обнаруживают сериновые протеазы (WO 00/04043).

В ранних работах предполагалось, что для любого из вышеприведенных применений можно использовать множественные формы тропоэластина. См., например, WO 94/14958, где описана синтетическая форма человеческого тропоэластина, содержащая домен 26А. В WO 94/14958 описываются формы от млекопитающих и птиц для использования в фармацевтических композициях; в WO 99/03886, где описан целый ряд синтетических форм человеческого тропоэластина, в том числе формы с отсутствием домена 26А, C-концевого домена и другие. В WO 99/03886 описаны человеческие формы и формы, полученные не от человека, для использования в фармацевтических применениях. Конкретная форма, SHELδ26A, обсуждается со ссылкой на отсутствие GAG-связывающей активности; и в WO 00/04043, где описаны формы тропоэластина, имеющие пониженную чувствительность к сериновым протеазам, а именно к тромбину, плазмину, калликреину, желатиназам А и В и матриксным металлоэластазам. В WO 00/04043 описаны соответствующие формы тропоэластина, имеющие пониженную чувствительность (называемые ″производное тропоэластина с пониженной чувствительностью″), пригодные для этих применений, которые включают формы частичной и полной длины и ксеногенные формы.

В каждом примере из этой ранних работ, несмотря на то, что в ткани можно было получить имплантат с эластическими свойствами, природа имплантата и его эластические свойства не позволяли говорить о таковых, присущих ткани в норме. Например, эластические свойства, которые наполнитель или имплантат, описываемые в этих ранних работах, придают дерме или подкожной ткани, как можно видеть, явно отличаются от нормальной эластичности данной ткани. Другими словами, несмотря на то, что с помощью имплантации материала со свойствами, которые включают эластичность, ткани можно было придать эластичность, вернуть ее внешний вид или функцию, аналогичные нормальным, было нельзя.

В ретроспективе этот результат, пожалуй, неудивителен, поскольку в более поздних работах за последние 5-10 лет было выявлено, что эластическая структура данной ткани возникает в результате сложного процесса, известного как ′эластогенез′, в который вовлечены множественные факторы, кроме лизилоксидазы и тропоэластина. Эластогенез обычно понимают как физиологический процесс, который происходит от позднего эмбрионального периода жизни до раннего постнатального периода жизни, во время которого клетки, в том числе фибробласты, гладкомышечные клетки и подобные, de novo образуют эластическое волокно из мономеров тропоэластина и других соответствующих факторов. Начиная с общего набора факторов, соответствующая ткань обеспечивает тканеспецифическое взаимодействие этих факторов, что приводит к синтезу, организации и распределению эластического волокна, естественным для соответствующей ткани образом, в результате чего возникает эластическая структура ткани (Cleary E.G and Gibson М.А. Elastic Tissue, Elastin and Elastin Associated Microfibrils in Extracellular Matrix Vol 2 Molecular Components and Interactions (Ed Comper W.D.) Harwood Academic Publishers 1996 p95). Стало очевидным, что такую организацию и сопутствующую структуру нельзя воссоздать просто путем образования поперечных сшивок в экзогенном тропоэластине с помощью экзогенной лизилоксидазы как ex vivo, так и in vivo, как предлагалось в ранних работах.

Инициация процесса, напоминающего эластогенез (т.е. процесса, при котором в ткани синтезируется de novo эластическое волокно из общего набора факторов), в ткани взрослого организма является желательной целью, потому что полагают, что такой процесс будет восстанавливать эластическую структуру ткани. Например, таким образом можно восстановить эластическую структуру старой ткани, чтобы структура данной ткани напоминала структуру более молодой ткани. К сожалению, данная цель остается труднодостижимой, в первую очередь, поскольку образование de novo эластического волокна у взрослых людей крайне невелико. Хотя при некоторых сердечнососудистых заболеваниях и заболеваниях легких может происходить восстановление эластического волокна, целостность и организация эластического волокна, возникающего в результате механизмов восстановления, отличаются для волокон, возникающих в результате эластогенеза. (Akhtar et al. 2010 J. Biol. Chem. 285: 37396-37404).

В последнее десятилетие эту проблему интенсивно исследовал целый ряд исследовательских групп (Huang R et al., Inhibition of versican synthesis by antisense alters smooth muscle cell phenotype and induces elastic fiber formation in vitro and in neointima after vessel injury. Circ Res. 2006 Feb 17; 98(3): 370-7; Hwang JY et al., Retrovirally mediated overexpression of glycosaminoglycan-deficient biglycan in arterial smooth muscle cells induces tropoelastin synthesis and elastic fiber formation in vitro and in neointimae after vascular injury. Am J Pathol. 2008 Dec; 173(6): 1919-28.; Albertine KH et al., Chronic lung disease in preterm lambs: effect of daily vitamin A treatment on alveolarization. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010 Jul 299(1): L59-72: Mitts TF et al., Aldosterone and mineralocorticoid receptor antagonists modulate elastin and collagen deposition in human skin. J Invest Dermatol. 2010 Oct; 130(10); 2396-406: Sohm В et al., Evaluation of the efficacy of a dill extract in vitro and in vivo. Int J Cosmet Sci. 2011 Apr; 33(2): 157-63; Cenizo Vet al., LOXL as a target to increase the elastin content in adult skin: a dill extract induces the LOXL gene expression. Exp Dermatol. 2006 Aug; 15(8): 574-81). Широко обсуждаемая гипотеза для объяснения отсутствия образования de novo эластических волокон у взрослых людей заключается в том, что клеткам взрослого организма или соответствующей ткани, в которой они содержатся, не хватает одного или нескольких необходимых факторов и процессов, необходимых для эластогенеза (Shifren А & Mecham R.P. The stumbling block in lung repair of emphysema: elastic fiber assembly. Proc Am Thorac Soc Vol 3 p 428-433 2006). Согласно этой гипотезе: обеспечение ткани взрослого организма синтетическим тропоэластином не дает возможность клетке взрослого организма синтезировать эластическое волокно из синтетического тропоэластина.

Исследования, проводимые в настоящее время, сосредоточены на понимании механизмов и факторов, лежащих в основе эластогенеза в ранний период жизни, и на определении того, присутствуют ли они во взрослый период жизни (Wagenseil JE & Mecham RP. New insights into elastic fiber assembly. Birth Defects Res С Embryo Today. 2007 Dec: 81(4): 229-40.).

Обычно считается, что вскоре после экспрессии белка-тропоэластина он образует коацерваты в виде агрегата из сфер размером приблизительно 200-300 нм, которые затем дополнительно объединяются в частицы размером приблизительно один микрон. Эти частицы затем собираются вдоль микрофибрилл во внеклеточном матриксе, тем самым образуя эластическое волокно (Kozel BA et al., Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J Cell Phvsiol. 2006 Apr: 207(1): 87-96). Вовлечение ряда дополнительных факторов в этот процесс продолжают исследовать.

In vitro исследования различных этапов на молекулярном уровне занимались исследованием субстратов человеческого тропоэластина и тропоэластина, слученного не от человека, и ряда разных изоформ тропоэластина (Davidson JM et al., Regulation of elastin synthesis in pathological states. Ciba Found Symp. 1995; 192:81-94; discussion 94-9). В ходе этой работы было выявлено, что по меньшей мере 34 разные молекулы ассоциированы с эластическими волокнами, хотя, как было показано, только некоторые из них были структурно вовлечены в образование волокон. Они включают тропоэластин, фибриллин-1, фибриллин-2, лизилоксидазу, лизилоксидазоподобный белок-1 (LOXL1), эмилин, фибулин-4 и фибулин-5 (Chen et al. 2009 J. Biochem 423: 79-89). Одна группа рассматривает LOXL1, представителя семейства LOX, как ключевую недостающую молекулу в определенной ткани взрослого организма (см. US 2004/0258676, US 2004/0253220 и US 20100040710). Другие группы указывают на фибулин 4 и другие молекулы как через взаимодействие с лизилоксидазой, так и с другими молекулами (Yanagisawa Н & Davis EC. Unraveling the mechanism of elastic fiber assembly: The roles of short fibulins. Int J Biochem Cell Biol. 2010 Jul: 42(7): 1084-93).

В заключение, несмотря на то, что все еще отсутствует полная картина, касающаяся взаимодействия факторов при эластогенезе, исследования, проводящиеся в настоящее время, указывают на то, что в клетках и тканях взрослого организма процесс, напоминающий эластогенез, не проходит полностью, поскольку у них отсутствует один или несколько факторов. Из этого следует, что самого по себе обеспечение ткани взрослого организма только тропоэластином само по себе не достаточно для восстановления эластической структуры ткани, потому что без соответствующих факторов, необходимых для эластогенеза, ткань не может использовать тропоэластин для образования эластического волокна.

Остается потребность в восстановлении или воссоздании эластической структуры ткани, или в минимизации нарушения эластической структуры ткани.

Существует потребность в улучшении эластической структуры старой ткани, чтобы она больше напоминала структуру данной ткани на более ранней стадии жизни.

Существует потребность в улучшении внешнего вида старой ткани, в том числе ткани, подвергнутой фотостарению, например, к сведению к минимуму дряблой кожи, вялой подкожной ткани, потери плотности внеклеточного матрикса, образования морщин и растяжек.

Также существует потребность в улучшении эластической структуры рубцовой или фиброзной ткани, чтобы данная структура больше напоминала структуру соответствующей ткани, содержащей рубцовую или фиброзную ткань, до повреждения ткани.

Также существует потребность в обеспечении улучшения эластической функции старой или поврежденной ткани, чтобы она больше напоминала эластическую функцию соответствующей ткани на более ранней стадии жизни или до повреждения.

Вышеупомянутые потребности отличаются от потребностей, которые удовлетворяются имплантатами или наполнителями и их применением для заполнения ткани поперечно-сшитым тропоэластином, как в соответствующем известном уровне техники supra.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение пытается удовлетворить одну или несколько вышеупомянутых потребностей, и в одном варианте осуществления предлагает способ восстановления эластической структуры ткани индивидуума, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего ткань, в которой необходимо восстановить эластическую структуру;

- введение тропоэластина индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;

- тем самым восстанавливая или воссоздавая эластическую структуру ткани индивидуума.

В другом варианте осуществления предложен способ минимизации нарушения эластической структуры ткани индивидуума, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего ткань, в которой необходимо минимизировать ухудшение эластической структуры;

- введение тропоэластина индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;

- тем самым минимизируя нарушение эластической структуры ткани индивидуума.

В другом варианте осуществления предложен способ улучшения эластической структуры старой ткани, чтобы она больше напоминал структуру данной ткани на более ранней стадии жизни, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего ткань, в которой необходимо улучшить эластическую структуру;

- введение тропоэластина индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;

- тем самым улучшая эластическую структуру старой ткани, чтобы она больше напоминала структуру данной ткани на более ранней стадии жизни.

В другом варианте осуществления предложен способ улучшения внешнего вида старой ткани, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего ткань, у которой необходимо улучшить внешний вид;

- введение тропоэластин индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;

- тем самым улучшая внешний вид старой ткани.

В другом варианте осуществления предложен способ улучшения эластической структуры рубцовой или фиброзной ткани, чтобы структура больше напоминала структуру соответствующей ткани, содержащей рубцовую или фиброзную ткань, до повреждения ткани, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего рубцовую или фиброзную ткань;

- введение тропоэластина индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;

- тем самым улучшая эластическую структуру рубцовой или фиброзной ткани.

В другом варианте осуществления предложен способ улучшения эластической функции старой или поврежденной ткани, чтобы она больше напоминала эластическую функцию соответствующей ткани на более ранней стадии жизни или до повреждения, включающий:

- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего старую или поврежденную ткань;

- введение тропоэластина индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;

- тем самым улучшая эластическую функцию старой или поврежденной ткани.

В другом варианте осуществления предложен способ придания эластичности коже индивидуума, предпочтительно, придания толщины коже индивидуума, одновременно с поддержанием или улучшением эластичности кожи индивидуума, причем способ включает следующие этапы:

- обеспечения присутствия индивидуума;

- определения участка обработки на коже индивидуума, где участок обработки представляет собой участок кожи, которому необходимо придать эластичность;

- инъекции тропоэластиновой композиции в пределах участка обработки, чтобы создать количество тропоэластина в пределах участка обработки, которое увеличено по сравнению с кожей, находящейся за пределами участка обработки;

- поддержания количества тропоэластина в участке обработки в течение предварительно установленного периода времени, тем самым придавая эластичность коже индивидуума.

В другом варианте осуществления предложена тропоэластиновая композиция, описываемая в данном документе для использования в одном или нескольких из следующих применений:

- восстановлении эластической структуры ткани индивидуума;

- минимизации нарушения эластической структуры ткани индивидуума;

- улучшении эластической структуры старой ткани, чтобы она больше напоминала структуру данной ткани на более ранней стадии жизни;

- улучшении внешнего вида старой ткани;

- улучшении эластической структуры рубцовой или фиброзной ткани, чтобы данная структура больше напоминала структуру соответствующей ткани, содержащей рубцовую или фиброзную ткань, до повреждения ткани;

- улучшении эластической функции старой или поврежденной ткани, чтобы она больше напоминала эластическую функцию соответствующей ткани на более ранней стадии жизни или до повреждения.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показаны эластиновые сети, образовавшиеся через 7 дней после добавления 250 мкг/мл тропоэластина к культивируемым человеческим фибробластам, полученным от людей разных возрастных групп. А. Первичная культура фибробластов новорожденного мужского пола (NHF 8-9-09); В. 10-летнего мальчика (GM3348); С. 31-летнего пациента мужского пола с ожогами (230209А); D. 51-летнего мужчины (142BR); Е. 92-летнего мужчины (AG04064). Отложение эластиновых сетей выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.

Фигура 2. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показано отложение эластина через 7 дней после добавления тропоэластина к культивируемым фибробластам кролика и свиньи. А. Первичная культура фибробластов кожи свиньи возрастом 10 недель; В. Фибробласты кожи взрослого кролика. Отложение эластина выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.

Фигура 3. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показано образование эластиновых волокон в первичной культуре гладкомышечных клеток дыхательных путей через 7 дней после добавления тропоэластина. А. Гладкомышечные клетки дыхательных путей (3785). В. Гладкомышечных клетки дыхательных путей, полученные от другого индивидуума (3791). Отложение эластина выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.

Фигура 4. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показано образование эластиновых волокон в первичной культуре фибробластов новорожденного через 7 дней после добавления тропоэластина или производных. А. Тропоэластин отсутствует; В. Тропоэластин полной длины; С. Пептиды эластина человеческой кожи; D. С делецией RKRK; Е. С заменой RGDS; F. Тропоэластин от Advanced Biomatrix. Отложение эластина выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.

Фигура 5. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показано образование эластиновых волокон в первичной культуре фибробластов новорожденного через 7 дней после добавления 125 мкг/мл тропоэластина в отсутствие (А) и в присутствии (В) 50 мкМ блеббистатина. Отложение эластина выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.

Фигура 6. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показана степень образования эластиновых сетей в первичной культуре фибробластов новорожденного после повторных добавлений тропоэластина. А. Клетки; В. Клетки + добавление тропоэластина в день 10; С. Клетки + добавления тропоэластина в день 10 и день 17; D. Клетки + добавления тропоэластина в день 10, день 17 и день 24. Все образцы фиксировали для визуализации в день 31. Отложение эластина выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.

Фигура 7. Автофлуоресцирующие зрелые эластиновые волокна. (А) фибробласты без добавления тропоэластина, (В) фибробласты с добавлением тропоэластина.

Фигура 8. AFM-анализ культур человеческих дермальных фибробластов. На фотографиях представлены топография культуры с наложением канала модуля упругости. (A) фибробласты без добавления тропоэластина, (В) фибробласты с добавлением тропоэластина.

Фигура 9. Образование эластических волокон дермальными фибробластами новорожденного. Тропоэластин добавляли через 12 дней после посева и образцы окрашивали с помощью DAPI, мышиного антитела к эластину и конъюгированного с FITC антитела к мышиному антителу.

Фигура 10. Ингибирование лизилоксидазы препятствует образованию эластических волокон. Образование эластиновых волокон в присутствии ингибитора лизилоксидазы BAPN. Образцы окрашены с помощью DAPI, мышиного антитела к эластину и конъюгированного с FITC антитела к мышиному антителу.

Фигура 11. Фотографии сферул тропоэластина, полученные с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения, в культуре человеческих дермальных фибробластов. (А) Масштабная шкала 1 микрон. (В) Масштабная шкала 2 микрона.

Фигура 12. Фотографии культуры человеческих дермальных фибробластов, полученные с помощью ТЕМ, через 3 дня после добавления тропоэластина.

Фигура 13. Срезы биоптатов недели 2, окрашенные по Вергеффу-Ван-Гизону (VVG). VVG-окрашивание на эластин поперечных срезов дермы кожи свиньи через 2 недели после обработки раны во всю толщину кожи с помощью конструктов, содержащих Тропоэластин. В тесте А представлена поперечно-сшитая коллагеновая матрица, поперечные сшивки которой образованы в присутствии 10% тропоэластина. В тесте В представлена поперечно-сшитая коллагеновая матрица, наложенная сверху тропоэластиновой матрицы, с поперечными сшивками с модифицированной НА. Фотографии сопоставлены с нормальной кожей свиньи и контролем, который представляет собой поперечно-сшитую коллагеновую матрицу.

Фигура 14. Срезы биоптатов кожи из дермы верхней части руки, взятых у субъектов, которых обрабатывали либо RVL, либо составами на основе эластина. (А) В коже, обработанной RVL, видно, что коллагеновые волокна дермы растянуты в разные стороны неокрашенным RVL-материалом, что делает кожу более жесткой и бугристой.

(B) В коже, обработанной составами на основе тропоэластина, имеются коллагеновые волокна дермы, разделенные имплантированным материалом, который окрашивается по VVG от синего цвета до пурпурного и черного, что указывает на то, что имплантированный материал ремоделирован в зрелые эластиновые волокна.

Подробное описание вариантов осуществления

Полагают, что ключевые результаты настоящего изобретения явились результатом новой системы для анализа, разработанной авторами настоящего изобретения и приведенной в примерах в данном документе. Для образования эластического волокна in vitro в системе для анализа используются клетки взрослого человека. Системой можно управлять, чтобы обеспечить возможность анализа каждого этапа образования эластиновых волокон и идентифицировать компоненты и процессы, необходимые для образования эластиновых волокон.

С помощью этой системы для анализа был выявлен путь синтеза эластического волокна, отличающийся от пути, как его понимали ранее, до настоящего изобретения. Ключевой результат заключается в том, что образование волокон намного больше зависит от взаимодействия клеток, чем считалось ранее.

Ключевой результат заключается в том, что система не приводит к существенному или в других отношениях значительному синтезу эластического волокна, пока в систему не добавлен экзогенный мономер тропоэластина. Это указывает на важность тропоэластина в синтезе эластического волокна in vivo.

Кроме этого, для системы показано, что образование эластического волокна не происходит эффективно, если в системе используются мономеры человеческого тропоэластина с клетками, полученными не от человека.

Кроме того, как правило, требуются мономеры, чтобы принять форму одной или нескольких встречающихся в природе изоформ. Несмотря на то, что мономеры можно синтезировать рекомбинантным путем, было обнаружено, что рекомбинантные формы, имеющие последовательность или структуру, которая не присуща физиологии человека, не обеспечивают эффективное образование эластического волокна, хотя образование волокна остается в некоторой степени возможным при условии, что отличие последовательностей эндогенного и экзогенного тропоэластина является не меньшим, чем приблизительно 65% гомология.

Кроме этого, при повторном введении тропоэластина в систему показана постоянная способность к образованию эластического волокна, что указывает на то, что лимитирующим фактором для образования эластического волокна является тропоэластин.

Полагают, что использование клеток взрослого человека и изоформ человеческого тропоэластина, встречающихся в природе, отличает данную систему для анализа от других (см., например, Sato F et al., Distinct steps of cross-linking, self-association, and maturation of tropoelastin are necessary for elastic fiber formation. J Mol Biol. 2007 Jun 8; 369(3): 841-51), и это, вероятно, является причиной того, почему указанные исследовательские группы не поняли, что человеческие клетки взрослого организма все же обладают потенциалом для синтеза эластического волокна в процессе, напоминающем эластогенез, при условии, что клетки подвергают воздействию тропоэластина.

В дополнительных исследованиях в ходе клинического испытания, приведенного в данном документе в качестве примера, доказана важность поддержания тропоэластина в ткани в течение достаточного количества времени, чтобы клетки вступили в контакт с тропоэластином. Этого можно достичь путем создания и поддержания уровня тропоэластина в участке ткани, подлежащей обработке, в течение выбранного периода времени, чтобы уровень тропоэластина в обработанном участок был выше, чем в необработанном участке. Полагают, что при условии, что тропоэластин сохраняется в ткани в течение достаточно продолжительного периода времени, необходимого для вступления клеток в контакт или, если в ткани клеток немного, для пополнения и вступления клеток в контакт, в ткани взрослого организма может происходить процесс, подобный эластогенезу, приводящий к образованию волокна и восстановлению эластической структуры ткани. Приведенные для примера периоды времени в отношении сохранения или поддержания тропоэластина в ткани дополнительно обсуждаются ниже.

Будет понятно, что эластическое волокно, образованное в соответствии с настоящим изобретением, может иметь такую же молекулярную структуру, как и эластическое волокно, наблюдаемое в природе, хотя в некоторых вариантах осуществления молекулярная и/или физическая структура волокна может отличаться. В определенных вариантах осуществления эластическое волокно может иметь физическую структуру, отличающуюся от таковой в обрабатываемой ткани, при этом цели настоящего изобретения все же достигаются.

В конкретных вариантах осуществления эластин, который синтезируется в соответствии со способами настоящего изобретения, объединяется с тканями, клетками и/или внеклеточным матриксом, тем самым восстанавливая или воссоздавая эластическую структуру, улучшая внешний вид или достигая других клинических эффектов. В этих вариантах осуществления синтезированный эластин может иметь отличающуюся физическую или молекулярную структуру по сравнению с эластическим волокном, наблюдаемым в ткани в норме, и получение конечного результата может происходить в результате взаимодействия или вступления в контакт эластина и других компонентов соответствующей ткани. Взаимодействие или вступление в контакт, очевидно, могут моделировать такие процессы, которые обычно обнаруживают у эластического волокна и тканевых элементов в соответствующей ткани.

В одном варианте осуществления эластическое волокно, образованное в соответствии с настоящим изобретением, имеет гидратированную форму, тем самым придавая волокну упругий потенциал.

Исследования, лежащие в основе настоящего изобретения, демонстрируют, что восстановление или воссоздание эластической структуры в ткани взрослого организма является возможным, потому что клетки взрослого организма, такие как фибробласты, гладкомышечные клетки и им подобные, обладают эластогенным потенциалом; это потенциал вступления в процесс, который похож на эластогенез и который, следовательно, возвращает ткани соответствующую эластическую структуру. Кроме того, потенциал реализуется при условии, что клетки взрослого организма обеспечены разновидностями и потенциально тканеспецифическими изоформами мономера тропоэластина. В дополнение, авторами настоящего изобретения было показано, что рекомбинантный человеческий тропоэластин, который содержит значительное количество примесей, не приводит к эффективному образованию эластинового волокна. В определенных вариантах осуществления тропоэластин имеет установленную степень чистоты, что касается количества тропоэластина в композиции для введения, по сравнению с количествами других белков или молекул в композиции. В одном варианте осуществления тропоэластин содержится в композиции, которая характеризуется по меньшей мере 75% чистотой, предпочтительно 85% чистотой, более предпочтительно очищен более чем 90 или 95% чистотой. Будет понятно, что в определенных вариантах осуществления тропоэластин может обеспечиваться в форме композиции, которая состоит из тропоэластина или практически состоит из тропоэластина, предпочтительно из изоформы тропоэластина полной длины. Наконец, клетки не способны использовать тропоэластин для образования эластического волокна, если тропоэластин уже содержит значительное количество внутримолекулярных поперечных сшивок.

В соответствии с настоящим изобретением схема обработки представляет собой схему, при которой тропоэластин поддерживают в пределах определенного участка обработки в ткани в течение достаточного периода времени, в течение которого клетки могут вступать в контакт и использовать вводимый тропоэластин для образования эластического волокна. Подходящая схема может включать не просто однократное введение мономеров тропоэластина, или не просто введение чистого мономера, потому что полагают, что мономеры тропоэластина характеризуются временем полужизни в пределах определенного участка обработки в ткани, которое обычно меньше времени, которое требуется соответствующим клеткам для образования эластического волокна. Более подробно, полагают, что мономеры тропоэластина, которые не вступают в контакт клетками, либо метаболизируются в участке обработки, либо исчезают из участка обработки. Из этого следует, что без выбора подходящей схемы обработки введенный тропоэластин, предположительно, может исчерпаться в определенном участке обработки до того, как его использует клетка для образования эластического волокна.

Один этап в схемах обработки, описанных дополнительно ниже, может включать однократное введение тропоэластина, при этом известно, что место, в который вводят тропоэластин, содержит значительное количество клеток. Данные о количестве или плотности клеток можно получить на основании предварительных гистологических данных ткани. Альтернативно, место введения может быть обработано заранее для индукции пролиферации клеток или пополнения в месте обработки.

Для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение требуемого времени в участке обработки можно принять целый ряд схем обработки. В общих чертах они заключаются в следующем:

(i) введение тропоэластина в виде состава с медленным высвобождением, который постепенно высвобождает тропоэластин в течение некоторого периода времени.

Медленного высвобождения тропоэластина в требуемом месте ткани можно достинать путем включения тропоэластина в неразлагаемые или разлагаемые средства доставки. Специалист в данной области техники может применять целый ряд таких подходов с медленным высвобождением. Предпочтительно, разлагаемый состав с замедленным высвобождением используют для того, чтобы избежать необходимости удаления средства, как только тропоэластин будет доставлен. Такие средства доставки могут состоять из полимеров, таких как полилактид (PLA) и сополимер лактида с гликолидом (PLGA). Другие средства для медленной доставки могут включать полимеры, образованные из полисахаридов, таких как гиалуроновая кислота, ксантановая камедь или хитозан. В дополнение, в определенных вариантах осуществления средство доставки можно химически модифицировать для того, чтобы связать тропоэластин посредством ионных или ковалентных связей с имплантатом так, чтобы только тропоэластин высвобождался по мере разрушения имплантата.

В определенных вариантах осуществления тропоэластин высвобождается в требуемом месте обработки в течение периода от 1 до 90 дней. В определенных вариантах осуществления тропоэластин может высвобождаться в требуемом месте обработки течение от 1 до 180 дней. В определенных вариантах осуществления тропоэластин можно составить таким образом, чтобы он высвобождался только после времени выдержки, следующим