Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов а, о, азия-1

Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов а, о, азия-1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, касается вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О, Азия-1 с биштаммовым антигеном вируса ящура типа А, которая может быть использована для специфической профилактики парнокопытных животных против вируса ящура типов А, О, Азия-1.

Проблема профилактики ящура у животных и снижения экономического ущерба от его возникновения и распространения, способных вызывать чрезвычайные ситуации в животноводстве с тяжелыми социально-экономическими последствиями, актуальна для многих стран мира, в том числе и для Российской Федерации.

Ящур представляет собой мировую проблему, так как является высоко контагиозным и быстро распространяющимся заболеванием, к которому восприимчивы основные сельскохозяйственные животные: крупный рогатый скот (КРС), свиньи, мелкий рогатый скот (MPC), и многие дикие животные, всего более 100 видов. Существует 7 разных типов вируса, вакцинация против одного типа вируса ящура не защищает от вируса ящура другого типа [1].

Для профилактической вакцинации нашли практическое применение традиционные моно- и поливалентные сорбированные и эмульсионные вакцины, изготовленные из культурального вируса, выращенного в суспензии клеток ВНК-21, инактивированного аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) [2].

Несмотря на принимаемые меры, эпизоотическая ситуация по ящуру в мире, том числе и в странах Азии, в 2013-2014 гг. не улучшилась. С начала 2013 года и в последующее время в Китае в ряде провинций были отмечены вспышки ящура среди КРС и свиней, вызванные вирусом типов О и А. В 2013 году в 4 пограничных с Китаем районах Забайкальского края отмечены 9 вспышек ящура, они остаются неблагополучными до настоящего времени. По данным Всемирной референтной лаборатории МЭБ по ящуру, выделенные на территории Забайкальского края и Амурской области Российской Федерации, Казахстана и Монголии изоляты на 99% идентичны изолятам A/QHXN-CHA-2013-B и A/GDMM-CHA-2013S. В 2013 г. заболевание ящуром среди КРС отмечено на Северном Кавказе и в Краснодарском крае. Выделенные изоляты относились к генетической линии А/Иран/2005. Изоляты данной генетической линии в 2013 г. вызывали вспышки ящура на территории стран Ближнего Востока [3].

Следует отметить, что все выделенные изоляты отличаются в антигеном отношении от штаммов вируса ящура типа А, используемых до последнего времени для изготовления противоящурных вакцин [3].

Благодаря систематической вакцинации животных и контролю иммунного фона поголовья, подавляющее большинство субъектов РФ, в том числе Северного Кавказа, длительное время являются благополучными по ящуру. Однако, неблагоприятная эпизоотическая обстановка по ящуру в мире и реальная возможность заноса его возбудителя на территорию России диктует необходимость усиления противоящурных мероприятий, среди которых основным является осуществление профилактической поголовной вакцинации животных в зонах высокого риска возникновения и распространения ящура [4].

Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики используют соответствующие типы вируса ящура и подбирают штаммы с широким антигенным спектром внутри типа с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм с широким спектром иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона выбирают с помощью его испытания в реакции перекрестной защиты или чаще в реакции перекрестной нейтрализации. Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины.

Кроме того, производственному штамму предъявляются требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения вируса при инактивации и длительном его хранении [5].

Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов.

Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков. Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма приводят к тому, что вакцинация животных производственным вакцинным штаммом не гарантирует защиту поголовья от антигенно отличающихся эпизоотических штаммов вируса ящура [5, 6].

Зарубежные ученые показали, что смесь из двух вакцин, обусловила защиту у морских свинок против гетерологичного штамма, в то время как каждая из них в отдельности не обеспечивала иммунного ответа против гетерологичного штамма вируса ящура [7].

Отечественные ученые провели исследования по сравнению иммуногенной активности моно- и полиштаммовых вакцин. Из полученных результатов следует, что введение в состав вакцины антигенно отличающихся штаммов вируса данного типа приводит к расширению антигенного спектра действия, за счет чего повышается иммуногенная активность полиштаммовой вакцины в отношении гомо- и гетерологичных штаммов вируса данного типа и не снижается активность против производственного [8].

Разработка новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики ящура является актуальной задачей.

Известна вакцина трехвалентная инактивированная сорбированная против вируса ящура типов А, О и Азия-1 RAKSHA TRIVALENT производства INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED RAKSHAPURAM, GACHIBOWLI HYDEREBAD, Индия [9].

Известна вакцина инактивированная очищенная против ящура жвачных животных «Афтовакспур» (Aftovaxpur) типов А, О и Азия-1, производства компания «Merial Animal Health Ltd», Франция. Вакцина имеет протективную активность ≥6,00 PD₅₀ [10].

Известна вакцина против ящура сорбированная трехвалентная (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21) [11].

Основным недостатком известных вакцин является невысокая эффективность из-за существующих антигенных различий между штаммами одного типа вируса ящура, а также недостаточной очищенности антигенных материалов.

Задачей изобретения является получение вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О, Азия-1, обладающей высокой иммуногенной активностью, с широким спектром антигенности при вакцинации от различающихся эпизоотических штаммов вируса ящура.

Поставленная задача достигается тем, что для профилактики и борьбы с заболеваем получена вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов А, О, Азия-1 с биштаммовым антигеном вируса ящура типа А, создающая эффективную защиту восприимчивых животных от заражения вирусом ящура типов А, О, Азия-1 и имеющая расширенное антигенное действие к вирусу ящура типа А.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении иммуногенной активности вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О, Азия-1, за счет расширения антигенного спектра действия по валентности А.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О и Азия-1 с биштаммовым антигеном типа А, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина в 1 см³ препарата в качестве активного вещества содержит смесь авирулентных и очищенных материалов из штаммов вируса ящура, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты: биштаммовый антиген вируса ящура типа А в виде авирулентных и очищенных материалов из штаммов вируса ящура А №2187/Кути/2013 и А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, авирулентного и очищенного материала из штамма вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011 типа О и авирулентного и очищенного материала из штамма вируса ящура Азия-1 №1946/Шамир 3/89 типа Азия-1, полученных предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, в количествах не менее 3 мкг каждого штамма, обеспечивающих антигенную активность в организме животного при введении ему целевого препарата и целевые добавки: ГОА, сапонин и поддерживающую среду в количестве, обеспечивающем толерантную презентацию антигена в организме иммунизированного животного. Содержание целевых добавок в готовом препарате рассчитывают с учетом объема прививной дозы вакцины для каждого вида животных.

Исходный вирус для получения штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 выделен в 2013 году в селе Кути, Приаргунского района, Забайкальского края. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первично трипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IBRS-2 и ПСГК-30.

Исходный вирус для получения штамма

А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 выделен в 2013 году в селе Нижний Куркужин Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первичнотрипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IBRS-2 и ПСГК-30.

Штамм вируса ящура Азия-1 №1946/Шамир 3/89 получен из Всемирной справочной лаборатории Pirbright.

Штамм вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011, был выделен в 2011 году в селе Стырфас Дзауского района Республики Южная Осетия. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первичнотрипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IBRS-2 и ПСГК-30.

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды раствор Эрла без сыворотки с добавлением ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), гидролизатов белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН 7,4÷7,6.

Для инактивации вируса используют АЭЭИ, который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025÷0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [12].

Полученный антиген очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина гидрохлорида (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,005÷0,007% [13].

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штаммов вируса ящура: А №2187/Кути/2013, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 и О №2123/Южная Осетия/2011, представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура.

Количественное и качественное содержание вирусного сырья определяют методом турбидиметрии [14].

Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см³ не менее 0,5 мкг 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.

Необходимую концентрацию 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура каждого штамма в предлагаемой вакцине, составляющую не менее 3 мкг в 1 см³ готового препарата, получают путем добавления в авирулентный и очищенный антигенный материал расчетного количества адъюванта-сорбента ГОА. Оптимальным является содержание ГОД в 1 см³ готового препарата в диапазоне 24000,0÷36000,0 мкг.

К полученному концентрату добавляют дополнительно 10% водный раствор сапонина до его содержания в 1 см³ готового препарата в диапазоне от 500,0 мкг до 1500,0 мкг.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов А, О и Азия-1 с биштаммовым антигеном вируса ящура типа А.

2. Активное вещество в виде смеси авирулентных очищенных антигенных материалов из иммуногенных 146S и 75S компонентов вируса ящура штаммов А №2187/Кути/2013 типа А, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 типа А, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 типа Азия-1 и 0№2123/Южная Осетия/2011 типа О, полученных предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов вируса ящура А №2187/Кути/2013, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 и О №2123/Южная Осетия/2011.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура.

2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.

4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

5. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2123/Южная Осетия/2011, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа О.

6. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2123/Южная Осетия/2011, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа О, в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

7. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа Азия-1.

8. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа Азия-1, в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

9. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант-сорбент ГОА.

10. ГОА предпочтительно в количестве 24000,0÷36000,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

11. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант сапонин.

12. Сапонин предпочтительно в количестве 500,0÷1500,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

13. Из целевых добавок вакцина содержит поддерживающую среду.

14. Вакцина содержит поддерживающую среду в количестве до 1000000,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

15. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штаммов вируса ящура А №2187/Кути/2013 типа А, А №2171 /Кабардино-Балкарский/2013 типа А, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 типа Азия-1 и О №2123/Южная Осетия/2011 типа О, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющие собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура, ГОА, сапонин и поддерживающая среда в соотношении, мкг/см³ готового препарата:

Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура серотипов А, О и Азия-1, циркулирующих в странах Закавказья, Центральной Азии, Ближнего и Дальнего Востока.

Достижение технического результата от использования изобретения достигается тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного вещества антигенный материал вируса ящура из штаммов А №2187/Кути/2013 типа А, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 типа А, Азия-1 №194б/Шамир 3/89 типа Азия-1 и О №2123/Южная Осетия/2011 типа О, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипов А, О и Азия-1, вызывающих вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья, Центральной Азии, Ближнего и Дальнего Востока.

Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А депонирован 22 января 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 (производственный).

Дендрограмма отражает филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1 (Фиг. 1).

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А.

Штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:40.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 значительно отличается от производственных штаммов типа А. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2187/Кути/2013 со штаммами вируса ящура серологического типа А составило: А22№550 - 21,49%, А22/Ирак/64 - 21,73%, А/Иран/96 - 22,03%, А/Армения/98 - 22,39%, А/Турция/06 - 22,11%, А/Иран/05 - 22,32%.

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2187/Кути/2013 принадлежит к генетической линии Юго-Восточная Азия 97 (Sea-97) топотипа Азия.

Антигенное родство штамма ВЯ А №2187/Кути/2013 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2187/Кути/2013 антигенно отличается от производственных штаммов А22 №550, А №2179/Щелковский биокомбинат, А/Иран/97, А/Киргизия/07 (А/Иран/05). Штамм ВЯ А №2187/Кути/2013 имеется слабо выраженное антигенное родство со штаммом А/Турция/06 (А/Иран/05).

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r₁) составило для А₂₂ №550 - 0,13, А №2179/Щелковский биокомбинат - 0,11, А/Иран/97 - 0,004, А/Турция/06 - 0,37, А №2045/Киргизия/07 - 0,13. При значении r₁≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [15, 16].

Биотехнологические характеристики

Штамм А №2187/Кути/2013 репродуцируется в первично-трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2, и в течение 18÷24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,0 до 7,0 lg ТЦД₅₀/см³. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристика

Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеиновая оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм А №2187/Кути/2013 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А депонирован 28 января 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 (производственный).

Дендрограмма отражает филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1 (Фиг. 2).

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 3 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А;

SEQ ID NO: 4 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А.

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические признаки:

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23÷25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм

А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура относится к типу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:30.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 значительно отличается от производственных штаммов типа А. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 со штаммами вируса ящура серологического типа А составила: А22№550 - 22,65%, А22/Ирак/64 - 21,66%, А/Иран/96 - 21,43%, А/Армения/98 - 21,98%, А/Турция/06 - 8,23%, А/Иран/05 - 8,75%.

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 принадлежит к генетической линии «Иран-2005» топотипа «Азия» вируса ящура серологического типа А и антигенно отличается от имеющихся производственных штаммов ВЯ типа А.

Антигенное родство штамма ВЯ А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 антигенно отличается от производственных штаммов А₂₂ №550, А₂₂ Ирак/64, А/Иран/97, А/Турция/06 (А/Иран/05), А/Киргизия/07 (А/Иран/05).

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 2. Антигенное соответствие (r₁) составило для А22 №550 - 0,013, А₂₂ Ирак/64 - 0,02, А/Иран/97 - 0,03, А/Турция/06 - 0,19 и А/Киргизия/2007 - 0,03. При значении r₁≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [15, 16].

Биотехнологические характеристики

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 репродуцируется в монослойных культурах клеток: первично трипсинизированной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2. В течение 18÷24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах достигает значений от 6,00 до 7,50 lg ТЦД₅₀/см³. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вирус вызывает ЦПД через 5 часов. Вирус сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристика

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Штамм О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура типа О депонирован 25 апреля 2013 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011 (производственный).

Дендрограмма отражает филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1 (Фиг. 3).

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 5 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура типа О;

SEQ ID NO: 6 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура типа О.

Штамм вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура типа О характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011 типа О относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23÷25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа О №2123/Южная Осетия/2011 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:30.

Филогенетический анализ показал, что штамм О №2123/Южная Осетия/2011 принадлежит к генетической линии О PanAsia 2 топотипа Средний Восток - Южная Азия.

Антигенное родство штамма ВЯ О №2123/Южная Осетия/2011 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа О исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм О №2123/Южная Осетия/2011 антигенно родственен к производственным штаммам Ο₁ Маниса, О №1734/Приморский/2000 (ПанАзия), О ПанАзия-2.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 3. Антигенное соответствие (r₁) составило для Ο₁ Маниса - 0,74, О №1734/Приморский72000 (ПанАзия) - 1,0, О ПанАзия-2 - 1,0. При значении r₁≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [15, 16].

Биотехнологические характеристики

Штамм О №2123/Южная Осетия/2011 репродуцируется в первично-трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2, и в течение 18÷24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,0 до 7,0 lg ТЦД₅₀/см³. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристика

Штамм О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеиновая оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³. Устойчивость к внешним факторам

Штамм О №2123/Южная Осетия/2011 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенн