Ген-восстановитель rf4 для цитоплазматической мужской стерильности (cms) c-типа кукурузы, молекулярные маркеры и их применение

Ген-восстановитель rf4 для цитоплазматической мужской стерильности (cms) c-типа кукурузы, молекулярные маркеры и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ

По данной заявке испрашивается приоритет на дату подачи временной патентной заявки США с серийным номером 61/390526, поданной 6 октября 2010 года, и безусловной патентной заявки с серийным номером 13/244049, поданной 23 сентября 2011 года, обе "MAIZE CYTOPLASMIC MALE STERILITY (CMS) C-TYPE RESTORER RF4 GENE, MOLECULAR MARKERS AND THEIR USE".

ТЕХНИЧЕСКАЯ ОБЛАСТЬ

Настоящее изобретение относится к генам фертильности растений. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к Rf4, гену-восстановителю фертильности кукурузы. В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к композициям и способам восстановления фертильности при цитоплазматической мужской стерильности (CMS-C) C-типа, например, с использованием молекулярных маркеров, сцепленных с геном Rf4, или находящихся в нем. Конкретные варианты осуществления относятся к способам использования конкретных последовательностей нуклеиновых кислот для идентификации растений, которые содержат восстановитель фертильности CMS-C, и получения гибридных семян. Некоторые конкретные варианты осуществления относятся к полипептидам, ассоциированным с восстановлением фертильности CMS-C.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Развитие разведения гибридных растений сделало возможными значительные достижения с точки зрения качества и количества продуцируемых культур. Увеличенный выход и комбинирование желаемых характеристик, таких как устойчивость к заболеваниям и насекомым, толерантность к жаре и засухе, и варьирование состава растения, являются возможными, частично, благодаря методикам гибридизации. Методики гибридизации основаны на вкладе, вносимом пыльцой из мужского родительского растения, в женское родительское растение, что приводит к получению гибрида.

Растения могут самоопыляться, если пыльца из одного цветка переносится на тот же или другой цветок одного и того же растения. Растения могут перекрестно опыляться, если пыльца происходит из цветка из другого растения. Растения кукурузы (Zea mays) можно выводить способами как самоопыления, так и перекрестного опыления. Растения кукурузы имеют мужские цветки, которые расположены на метелке, и женские цветки, которые расположены на початке того же растения. Естественное опыление кукурузы происходит, когда пыльца из метелки достигает рылец, которые находятся наверху зарождающихся початков. Разработка гибридов кукурузы основана на системах мужской стерильности.

Разработка гибридов кукурузы требует разработки гомозиготных инбредных линий, скрещивания этих линий и оценки продуктов скрещивания. Чистосортное разведение и рекуррентная селекция являются двумя способами разведения, используемыми для разработки инбредных линий из популяций. Программы разведения комбинируют желаемые признаки двух или более инбредных линий или различных универсальных источников в депо разведения, из которого разрабатывают новые инбредные линии путем самоопыления и селекции желаемых фенотипов. Гибридный сорт кукурузы является результатом скрещивания двух таких инбредных линий, каждая из которых может иметь одну или несколько желаемых характеристик, отсутствующих в одной, или дополняющих другую. Новые инбредные растения скрещивают с другими инбредными линиями, и гибриды этих скрещиваний оценивают для определения тех из них, которые являются желательными. Гибридное потомство первого поколения обозначают F₁. При выведении гибридов искомыми являются только гибриды F₁. Гибрид F₁, как правило, является более сильным, чем его инбредные родительские растения. Эта сила гибридов, называемая гетерозисом, как правило, приводит, например, к повышенному вегетативному росту и увеличенному выходу.

Гибридную кукурузу можно получать с помощью системы мужской стерильности, включающей удаление метелки вручную. Для получения гибридных семян мужскую метелку удаляют из растущих женских инбредных родительских растений, которые можно высевать по принципу различным образом чередующихся рядов с мужскими инбредными родительскими растениями. Следовательно, при условии, что существует достаточная изоляция от чужеродной пыльцы, початки женского инбредного растения будут оплодотворяться только пыльцой мужского инбредного растения. Полученные семена представляют собой гибридные семена F₁.

Удаление метелок вручную является трудоемким и дорогостоящим. Удаление метелок вручную часто является неэффективным, например, поскольку варьирование условий окружающей среды при выведении растений может приводить к растениям, у которых происходит выметывание метелок в женском родительском растении после проведения удаления метелок вручную, или поскольку лицо, осуществляющее удаление метелок, не полностью удалило метелку из женского инбредного растения. Если удаление метелок является неэффективным, женское растение будет продуктивно сбрасывать пыльцу, и некоторые женские растения будут самоопыляться. Это приведет к тому, что вместе с гибридными, семенами, продуцированными нормально, будут собраны семена женского инбредного растения. Семена женского инбредного растения являются не настолько продуктивными, как семена F₁. Кроме того, присутствие женских инбредных семян может привести к риску недостаточной сохранности зародышевой плазмы для производителя гибридных семян.

Метелки из женского инбредного растения также можно удалять с помощью устройства. Механическое удаление метелок является приблизительно настолько же надежным, как и удаление метелок вручную, однако является более быстрым и менее дорогостоящим. Однако большинство устройств для удаления метелок приводит к большему повреждению растений, чем удаление метелок вручную. Таким образом, в настоящее время не существует полностью удовлетворительной формы удаления метелок.

Генетическая мужская стерильность является альтернативным способом, который можно использовать при получении гибридных семян. Трудоемкого процесса удаления метелок можно избежать в некоторых генотипах с использованием инбредных растений с цитоплазматической мужской стерильностью (CMS). В отсутствие гена-восстановителя фертильности, инбредные растения CMS обладают мужской стерильностью в результате факторов, происходящих из цитоплазматического, а не ядерного генома. Таким образом, характеристикой мужской стерильности является то, что она наследуется исключительно через женское растение в растениях кукурузы, поскольку только женское растение предоставляет цитоплазму для оплодотворенных семян. Растения CMS оплодотворяют пыльцой другого инбредного растения, которое не обладает мужской стерильностью. Пыльца второго инбредного растения может обеспечивать или может не обеспечивать гены, которые приводят к наличию у гибридных растений мужской фертильности. Обычно семена нормальной кукурузы после удаления метелок и продуцированные с помощью CMS семена того же гибрида должны быть смешаны для обеспечения того, чтобы достаточная нагрузка пыльцой была доступна для оплодотворения, когда гибридные растения выращивают, и для обеспечения цитоплазматического разнообразия.

Недостатки CMS как системы продуцирования гибридных семян включают ассоциацию конкретных вариантов CMS с предрасположенностью к определенным заболеваниям культур. См., например, Beckett (1971) Crop Science 11:724-6. Эта проблема, в частности, препятствует применению варианта CMS-T в продуцировании гибридных семян кукурузы и обычно негативно отражается на применении CMS в кукурузе.

Цитоплазматическая мужская стерильность (CMS) представляет собой наследуемую по материнской линии неспособность продуцировать функциональную пыльцу. Было найдено более 40 источников CMS, и они были классифицированы на три основных группы по различным реакциям восстановления фертильности в кукурузе. Эти группы обозначают как CMS-T (Texas), CMS-S (USDA) и CMS-C (Charrua). Beckett (1971). В группе CMS-T для восстановления фертильности пыльцы требуется два доминантных гена: Rf1 и Rf2, которые расположены на хромосомах 3 и 9, соответственно. Duvick (1965) Adv. Genetics 13:1-56. S-цитоплазма восстанавливается с помощью одного гена, Rf3, который картирован на 2 хромосоме. Laughnan and Gabay (1978) "Nuclear and cytoplasmic mutations to fertility in S male-sterile maize", Maize Breeding and Genetics, pp. 427-446.

В предшествующих анализах было обнаружено, что, по сравнению с CMS-T и CMS-S, восстановление фертильности CMS-C является очень сложным. Duvick (1972), "Potential usefulness of new cytoplasmic male sterile and sterility system", Proceeding of the 27th annual corn and sorghum research conference, pp. 197-201, обнаружил, что полное восстановление фертильности CMS-C контролируется доминантным аллелем гена Rf4. Khey-Pour et al. (1981) также обнаружили, что этот ген является достаточным для восстановления CMS-C. Однако Josephson et al. (1978), "Genetics and inheritance of fertility restoration of male sterile cytoplasms in corn", Proceedings of the 33rd com and sorghum research conference 7:13, предположили, что полное восстановление фертильности CMS-C обуславливается взаимодополняющим действием доминантных аллелей двух генов: Rf4 и Rf5, которые с тех пор были картированы на хромосомах 8 и 5, соответственно. Sisco (1991) Crop Sci. 31: 1263-6. Между тем, Chen et al. (1979) Acta Agronom. Sin. 5(4):21-28, предположили, что два доминантных гена-восстановителя при CMS-C имеют дублирующие функции. Далее усложняя систему, Vidakovic (1988), Maydica 33:51-65, продемонстрировал существование трех доминантных и комплементарных генов для полного восстановления фертильности при CMS-C, добавив ген Rf6. Vidakovic et al, (1997a) Maize Genet. Coop. News Lett. 71:10; (1997b) Maydica 42:313-6, позднее сообщили, что эти взаимодополняющие гены, Rf4, Rf5 и Rf6, в действительности не были единственными генетическими механизмами для восстановления фертильности при CMS-C в кукурузе. Таким образом, механизмы восстановления фертильности при CMS-C остаются не проясненными. В результате трудно выбрать линии-восстановители для некоторых генотипически стерильных линий.

Для ускорения процесса введения гена или локусов количественных признаков (QTL) в элитный культивар или линию выведения путем обратного скрещивания особенно пригодны молекулярные маркеры. Маркеры, сцепленные с геном, можно использовать для селекции растений, обладающих желаемым признаком, и маркеры по всему геному можно использовать для селекции растений, генетически сходных с рекуррентным родительским растением (Young and Tanksley (1989) Theor. Appl. Genet. 77:95-101; Hospital et al. (1992) Genetics 132:1199-210).

Большинство генов-восстановителей фертильности растений было клонировано с помощью стратегии клонирования на основе картирования. На сегодняшний день, было выделено девять генов Rf из нескольких видов растений, включая кукурузу (Zea Mays L.) (Cui et al. (1996) Science 272:1334-6; Liu et al. (2001) Plant Cell 13:1063-78), петунию (Petunia hybrida) (Bentolila et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:10887-92, хрен (Raphanus sativus L.) (Brown et al. (2003) Plant J. 35:262-72; Desloire et al. (2003) EMBO Rep. 4:1-7; Koizuka et al. (2003) Plant J. 34:407-15), сорго (Sorghum bicolor L.) (Klein et al. (2005) Theor. Appl. Genet. 111: 994-1012), рис (Oryza sativa L.) (Kazama и Toriyama (2003) FEBS Lett. 544:99-102; Akagi et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 108: 1449-57; Komori et al. (2004) Plant J. 37:315-25; Wang et al. (2006) Plant Cell 18:676-87; и Fujii and Toriyama (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(23): 9513-8), и губастик (Mimulus guttatus) (Barr and Fishman (2010) Genetics 184:455-65).

Все из идентифицированных генов-восстановителей, за исключением Rf2 в кукурузе и Rf17 в рисе, кодируют различные белки с пентатрикопептидными повторами (PPR). Геномы растений кодируют несколько сотен белков PPR, многие из которых вовлечены в регуляцию экспрессии генов органелл. Lurin et al. (2004) Plant Cell 16:2089-103; и Schmitz-Linneweber and Small (2008) Trends Plant Sci. 12:663-70. Белок PPR содержит от 2 до 27 повторов по 35 аминокислот, называемых мотивами PPR. Small and Peeters, (2000) Trends Biochem. Sci. 25(2):46-7. Предсказано, что белки PPR связываются с РНК (Delannoy et al. (2007) Biochemical Society Transactions 35:1643-7), и многие белки PPR нацеливаются на митохондрии, где расположены ассоциированные с CMS гены и продукты. Lurin et al. (2004), выше. Данные указывают на то, что белки PPR связываются непосредственно с транскриптами CMS. Akagi et al. (2004), выше; Gillman et al. (2007) Plant J. 49:217-27; и Kazama et al. (2008) Plant J. 55:619-28. Белки Rf снижают экспрессию ассоциированных с CMS транскриптов путем изменения их характера процессинга (Kazama & Toriyama (2003), выше), снижения стабильности РНК (Wang et al. (2006), выше; и Ohta et al. (2010) Plant Cell Rep. 29:359-69), или предотвращения их трансляции (Kazama et al. (2008), выше).

Дополнительная информация, касающаяся генов-восстановителей фертильности из кукурузы, риса, петунии и хрена, может быть найдена в патентной заявке США с серийным номером № US2006/0253931, и в патентах США № 5981833; 5624842; 4569152; 6951970; 6392127; 7612251; 7314971; 7017375; 7164058 и 5644066.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании описано картирование локуса Rf4 кукурузы до небольшой области размером 12 т.п.н., расположенной в верхней части хромосомы 8. В этой области единственным вероятным кандидатом для Rf4 является ген, кодирующий фактор транскрипции bHLH. Путем клонирования локуса Rf4-bHLH из линий CMS-C, линий-невосстановителей и линий-восстановителей, был идентифицирован ряд различий в последовательности. На белковом уровне все из линий CMS-C и линий-невосстановителей имеют одну и ту же последовательность, и отличаются от аллелей-восстановителей (также идентичных друг другу) на 4 аминокислотных замены, включая консервативный гидрофильный остаток тирозина в домене bHLH (Y₁₈₆), который заменен на гидрофобный остаток фенилаланина (F₁₈₇) в линии-восстановителе.

Ген Rf4 кукурузы и кодируемый им полипептид представлены в настоящем описании, и кроме того, описаны молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательность гена Rf4. Неожиданно, ген Rf4 не является геном белка с пентатрикопептидным повтором (PPR), как практически все другие гены-восстановители фертильности. Более того, показано, что восстановление фертильности в зародышевой плазме системы CMS-C/Rf4 по настоящему изобретению контролируется Rf4 в качестве единственного доминантного гена-восстановителя, что было неожиданным вследствие недавних работ нескольких групп. См. выше. Гидрофильный остаток тирозина в домене bHLH rf4-bHLH (Y₁₈₆) кукурузы, который заменен на гидрофобный остаток фенилаланина (F₁₈₇) в линиях восстановителей, является консервативным среди однодольных растений. Таким образом, идентификация гена Rf4 и маркеров гена Rf4 значительно способствовала разработке и широкому внедрению признака восстановления фертильности CMS-C в зародышевой плазме растений.

В вариантах осуществления мутация консервативного остатка тирозина в положении 186 rf4-bHLH на гидрофобный аминокислотный остаток (например, фенилаланин) ответственна за фенотип восстановителя в полипептиде Rf4-bHLH. Таким образом, в настоящем описании описаны гены Rf4-bHLH кукурузы или ортологи генов Rf4-bHLH кукурузы, которые кодируют гидрофобный аминокислотный остаток в этом положении (как определяют выравниванием последовательностей), где эти гены обеспечивают фенотип восстановителя CMS-C при включении в растение.

В настоящем описании описаны молекулярные маркеры нуклеиновых кислот, которые сцеплены (например, сцеплены; прочно сцеплены; или чрезвычайно прочно сцеплены) с геном Rf4 кукурузы или которые расположены в нем. В некоторых вариантах осуществления маркеры, которые сцеплены (например, сцеплены; прочно сцеплены; или чрезвычайно прочно сцеплены) с геном Rf4 кукурузы или которые расположены в нем, или саму последовательность гена Rf4 кукурузы, можно использовать для введения гена Rf4 кукурузы в организмы, например, растения (например, кукуруза и другие однодольные растения).

Также в настоящем описании описаны способы использования маркеров нуклеиновых кислот, которые сцеплены с геном Rf4 или расположены в нем, например и не ограничиваясь этим, для идентификации растений с функциональным геном-восстановителем для CMS C-типа; для введения Rf4 в новые генотипы растений (например, путем скрещивания с использованием маркера или генетической трансформации); и для получения гибридных семян от скрещиваний мужских растений, содержащих молекулярные маркеры нуклеиновых кислот, которые сцеплены с геном Rf4 или расположены в нем, и женских растений, несущих CMS C-типа.

Кроме того, описаны средства для восстановления фертильности кукурузы CMS-C, и средства для идентификации растений, имеющих ген восстановления фертильности кукурузы CMS-C. В некоторых примерах средства для восстановления фертильности кукурузы CMS-C могут представлять собой маркер, который сцеплен (например, сцеплен; прочно сцеплен; или чрезвычайно прочно сцеплен) с геном Rf4 кукурузы или который расположен в нем. В некоторых примерах средства для идентификации растений, имеющих ген восстановления фертильности кукурузы CMS-C, могут представлять собой зонд, который специфично гибридизуется с маркером, который сцеплен (например, сцеплен; прочно сцеплен; или чрезвычайно прочно сцеплен) с геном Rf4 или который расположен в нем.

Также в настоящем описании описаны способы, посредством которых можно получать гибридные семена путем скрещиваний мужского растения, содержащего молекулярные маркеры нуклеиновых кислот, которые сцеплены (например, сцеплены; прочно сцеплены; или чрезвычайно прочно сцеплены) или с геном Rf4 кукурузы или которые расположены в нем, и женского растения, имеющего CMS C-типа. Получение таких гибридных семян может приводить к экономии затрат вследствие ручного или механического устранения удаления метелок, и, кроме того, могут увеличить выход семян.

Кроме того, описаны способы использования молекул нуклеиновых кислот, описанных в настоящем описании, для идентификации гомологичных последовательностей Rf4 из видов растений, отличных от кукурузы (например, путем сравнения последовательностей). В некоторых вариантах осуществления систему CMS-C/Rf4 для получения гибридных семян создают способами инженерии в видах растений, отличных от кукурузы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГ.1 представлено 197 маркеров SNP, определенных как находящиеся в области гена Rf4, и их положения на физической карте.

На ФИГ.2 представлены тридцать четыре случайным образом отобранных рекомбинантных растения с их фенотипическими данными и соответствующими генетическими данными по 27 SNP-маркерам.

На ФИГ.3 представлены относительные положения маркеров SNP для гена Rf4 и генов в пределах области размером 1,5 млн п.н. на 8 хромосоме.

На ФИГ.4 представлены относительные положения маркеров SNP для гена Rf4 и генов в пределах области размером 0,56 млн п.н. и в пределах области размером 100 т.п.н. на 8 хромосоме.

На ФИГ.5 представлено точное картирование Rf4 в области размером 12 т.п.н. Буквами указаны генотипы: A=гомозиготный по BE4207 (CMS); H=гетерозиготный. Стрелками указаны левый и правый пограничные маркеры Rf4, и два наиболее важных рекомбинантных растения.

На ФИГ.6 представлено схематическое изображение геномной структуры аллеля Rf4-bHLH, демонстрирующее полную кодирующую область (от кодона инициации до стоп-кодона - 1,38 т.п.н.), 5'-UTR/промотор размером 1,1 т.п.н., и 3'-UTR/терминатор размером 0,75 т.п.н.

На ФИГ.7 представлено выравнивание последовательностей Rf4-bHLH из следующих генотипов кукурузы: B73; BE4207; B104; XJH58; BE9515; и MLW03. Положения кодона инициации трансляции, стоп-кодона и маркеров с DAS-CMS21 по DAS-CMS34, расположенных в гене, обозначены. Положения SNP и InDel затемнены.

На ФИГ.8 представлено выравнивание предсказанной последовательности кДНК Rf4-bHLH из следующих генотипов кукурузы: B73; BE4207; B104; XJH58; BE9515; и MLW03. Положения кодона инициации трансляции, стоп-кодона и маркеров для DAS-CMS22-25, 28-29 и 31, расположенных в кДНК, обозначены.

На ФИГ.9 представлено выравнивание предсказанных белковых последовательностей Rf4-bHLH. Положения консервативного домена bHLH, сигналов ядерной локализации (NLS) и положения соответствующих маркеров для DAS-CMS22, 23 и 28 обозначены. Замена Tyr на Phe в домене bHLH вызвана динуклеотидной заменой AC на TT в положении 747 (предсказанной последовательности кДНК B73), практически рядом с маркером DAS-CMS24 (см. ФИГ.8 и полиморфизм ID 54 в таблице 3).

На ФИГ.10 представлены данные, демонстрирующие профили экспрессии Rf4-HLH. L1=5 - слабые листья, L2=7 - слабые листья, L3=9 - слабые листья, T = метелки с развивающимися пыльниками и пыльцой, P = сбрасываемая пыльца. A = гомозиготный по BE4207, H = гетерозиготный, B = гомозиготный по XJH58. Данные соответствуют средним значениям для трех растений каждого генотипа для сегрегирующих F3 и для 1 растения каждого из родительских растений. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению.

На ФИГ.11 представлено выравнивание Rf4-bHLH кукурузы (из восстановителя XJH58 и невосстановителя BE4207) с их ортологами из других однодольных видов. Положение консервативного домена bHLH подчеркнуто. Четыре аминокислотных замены между Rf4-bHLH XJH58 и Rf4-bHLH BE4207 обозначены.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновых кислот, приведенные в прилагаемом списке последовательностей, представлены с использованием стандартных буквенных обозначений для нуклеотидных оснований, как определено в 37 C.F.R. § 1.822. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, однако следует понимать, что при любой отсылке на представленную цепь включается комплементарная цепь. Для простоты при описании гена или локуса ген может быть описан с помощью мутантной формы гена (например, Rf4, в противоположность rf4), даже несмотря на то, что истинная последовательность может представлять собой форму гена дикого типа в соответствующем положении в геноме. Тем не менее, понятно, что оба аллеля имеют различные последовательности, и из контекста понятно, какой аллель подразумевается. В прилагаемом списке последовательностей:

В SEQ ID NO: 1-197 представлены иллюстративные нуклеотидные последовательности маркеров, которые сцеплены (например, сцеплены; прочно сцеплены; или чрезвычайно прочно сцеплены) с геном Rf4 кукурузы или которые расположены в нем.

В SEQ ID NO: 198-211 представлены нуклеотидные последовательности в области приблизительно 0,56 млн п.н. в верхней части 8 хромосомы кукурузы, в которой аллель Rf4 был первоначально картирован. SEQ ID NO: 203 представляет собой аллель Rf4-bHLH.

SEQ ID NO: 212-216 представляют собой иллюстративные различия нуклеотидных последовательностей между линиями CMS (BE4207) и восстановителя (XJH58).

В SEQ ID NO: 217 представлена нуклеотидная последовательность интервала приблизительно 12 т.п.н. из сорта кукурузы B73, в котором был точно картирован аллель Rf4.

В SEQ ID NO: 218 представлена нуклеотидная последовательность аллеля rf4-bHLH из сортов кукурузы B73 и BE4207.

В SEQ ID NO: 219 представлена нуклеотидная последовательность аллеля bHLH из сорта кукурузы B104.

В SEQ ID NO: 220 представлена нуклеотидная последовательность аллеля Rf4-bHLH из сортов кукурузы XJH58, BE9515 и MLW03.

В SEQ ID NO: 221 представлена нуклеотидная последовательность предсказанной кДНК rf4-bHLH из сортов кукурузы B73 и B4207.

В SEQ ID NO: 222 представлена нуклеотидная последовательность предсказанной кДНК bHLH из сорта кукурузы B104.

В SEQ ID NO: 223 представлена нуклеотидная последовательность предсказанной кДНК Rf4-bHLH из сортов кукурузы XJH58, BE9515 и MLW03.

В SEQ ID NO: 224 представлена аминокислотная последовательность предсказанного полипептида rf4-bHLH кукурузы.

В SEQ ID NO: 225 представлена аминокислотная последовательность предсказанного полипептида Rf4-bHLH.

В SEQ ID NO: 226 представлена аминокислотная последовательность предсказанного полипептида rf4-bHLH Brachypodium distachyon.

В SEQ ID NO: 227 представлена аминокислотная последовательность предсказанного полипептида rf4-bHLH Sorghum bicolor.

В SEQ ID NO: 228 представлена аминокислотная последовательность предсказанного полипептида rf4-bHLH Oryza sativa.

В SEQ ID NO: 229 и 230 представлены сигналы ядерной локализации (NLS) в Rf4-bHLH.

СПОСОБ(Ы) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Обзор нескольких вариантов осуществления

В настоящем описании описаны конкретные варианты осуществления генов, влияющих на мужскую фертильность в растениях: Rf4 кукурузы и прочно сцепленные с ними генетические маркеры, которые могут быть пригодны в различных системах контроля мужской фертильности. Более того, полиморфизм, присущий описанным прочно сцепленным генетическим маркерам, позволяет растениеводу отслеживать конкретный аллель гена, Rf4 или rf4, в сегрегирующей популяции. Ген Rf4 был первоначально картирован на 8 хромосоме в трех популяциях, полученных скрещиванием четырех культиваров кукурузы: BE4207×BE9515; BE4207×LW03F; и BE4207×XJH58. Точное картирование и клонирование на основе картирования были продемонстрированы в качестве примера в популяции BE4207×XJH58, в конечном итоге локализовав ген Rf4 в пределах приблизительно 12 т.п.н.

Восстановление цитоплазматической мужской стерильности (CMS) является стандартной сельскохозяйственной практикой при получении гибридных семян в течение многих лет. Использование гена-восстановителя фертильности (Rf) при цитоплазматической мужской стерильности упрощает программы продуцирования и снижает общие затраты путем полного устранения ручного или машинного удаления метелок. Однако полное преимущество применений генетики восстановления фертильности для цитоплазматической мужской стерильности C-типа в кукурузе для получения гибридных семян не было осуществлено, поскольку предшествующие исследования генетики восстановления фертильности для цитоплазматической мужской стерильности C-типа в кукурузе привели к противоречивым результатам.

Ввиду практической важности цитоплазматической мужской стерильности и восстановления фертильности пыльцы при получении гибридных семян кукурузы и необходимости диверсификации источника цитоплазмы, описано точное картирование гена-восстановителя Rf4 кукурузы для CMS-C до очень небольшой области с использованием молекулярных маркеров с помощью способа генотипирования KASPar™ и идентификация гена Rf4 кукурузы с помощью клонирования на основе картирования. Было открыто, что Rf4 является единственным доминантным геном-восстановителем для CMS-C в трех инбредных растениях кукурузы: BE9515, MLW03 и XJH58.

Rf4 первоначально был картирован с использованием маркеров SSR и SNP до области приблизительно 5,0 млн п.н., начиная с маркера SSR umc-1075 до верхней части короткого плеча хромосомы 8. Была создана популяция для подтверждения F₂ BE4207×XJH58 с 500 особями, и она была оценена в отношении фертильности в полевых условиях. Был проведен скрининг всего 197 маркеров SNP в популяции для подтверждения и было идентифицировано 104 рекомбинанта в пределах области размером 5,0 млн п.н. Путем сравнения фенотипических показателей и генотипических данных для информативных рекомбинантных линий, ген Rf4 кукурузы был положительно идентифицирован в пределах области приблизительно 0,56 млн п.н. (14 генов), и, вероятно, в пределах 100 т.п.н. (6 генов).

Таким образом, использование вариантов осуществления способов, описанных в настоящем описании, продемонстрировало, что ген Rf4 выбран из группы, состоящей из GRMZM2G 122853 (SEQ ID NO: 198); AC187051.4JFG005 (SEQ ID NO: 199); GRMZM2G122851 (SEQ ID NO: 200); GRMZM2G122850 (SEQ ID NO: 201); GRMZM2G582028 (SEQ ID NO: 202); GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203); GRMZM2G381376 (SEQ ID NO: 204); GRMZM2G081127 (SEQ ID NO: 205); GRMZM2G085111 (SEQ ID NO: 206); GRMZM2G085038 (SEQ ID NO: 207); GRMZM2G317468 (SEQ ID NO: 208); GRMZM2G328030 (SEQ ID NO: 209); GRMZM2G029450 (SEQ ID NO: 210); и GRMZM2G077212 (SEQ ID NO: 211).

С использованием большой популяции для точного картирования размером приблизительно 5000 особей, локус Rf4 был картирован до небольшой области размером приблизительно 12 т.п.н., расположенной в верхней части 8 хромосомы. Тем самым, было продемонстрировано, что ген Rf4 выбран из группы, состоящей из перемещающегося генетического элемента растений [GRMZM2G582028 (SEQ ID NO: 202)] и фактора транскрипции основная спираль-петля-спираль (bHLH) (GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203)). Среди этих двух генов единственным вероятным кандидатом для Rf4 является фактор транскрипции основная спираль-петля-спираль (bHLH), геном Rf4 является GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203). Таким образом, в конкретных вариантах осуществления ген Rf4 представляет собой GRMZM2G021276 (SEQ ID NO: 203), который иногда называют в настоящем описании как Rf4-bHLH. Понятно, что ген Rf4 также может представлять собой последовательность ДНК, которая кодирует тот же полипептид, что и ген Rf4-bHLH кукурузы, например, кодирующую последовательность SEQ ID NO: 203.

Локус bHLH был клонирован из линии CMS BE4207 кукурузы; линии B104 кукурузы; и трех линий восстановителей кукурузы: XJH58, BE9515 и MLW03. Был идентифицирован ряд изменений последовательностей между различными инбредными растениями. Следует отметить, что три линии-восстановителя имеют идентичные последовательности ДНК Rf4-bHLH, в то время как B73 и BE4207 (которые не содержат функциональный восстановитель Rf4) являются идентичными. Последовательность B104 является более сходной с аллелем BE4207/B73, чем с аллелем-восстановителем. На белковом уровне все из BE4207, B73 и B104 имеют одинаковую последовательность и отличаются от генного продукта аллеля-восстановителя на 4 аминокислотных замены, включая замену гидрофобным фенилаланином консервативного гидрофильного тирозина в домене bHLH.

В соответствии с функцией Rf4 в восстановлении фертильности пыльцы, аллель-восстановитель Rf4-bHLH экспрессируется специфически в развивающихся метелках (с пыльниками и пыльцой) растений, которые восстанавливают CMS-C. В линии CMS кукурузы BE4207 не происходит ни появление пыльников, ни развитие функциональной пыльцы. В результате в листьях и мужских репродуктивных тканях из растений BE4207 была выявлена очень низкая экспрессия rf4-bHLH или отсутствие его экспрессии. Поскольку B73 (инбредное растение, которое ни содержит цитоплазму CMS-C, ни восстанавливает CMS-C) имеет значительную экспрессию rf4-bHLH, маловероятно, что восстановление фертильности является следствием различий в уровне экспрессии между аллелем-восстановителем (Rf4-bHLH) и аллелем-невосстановителем (rf4-bHLH).

Полагают, что восстановление мужской фертильности является следствием различий в аминокислотной последовательности между продуктами генов аллеля-восстановителя и аллеля-невосстановителя. В частности, Y₁₈₆ rf4-bHLH кукурузы расположен в первой спирали (Carretero-Paulet et al. (2010) Plant Physiol. 153: 1398-412; и Pires and Dolan (2010) Mol. Biol. Evol. 27:862-74) в связывающем домене ДНК bHLH, и этот остаток является абсолютно консервативным в B73 (не CMS, не восстановитель), BE4207 (CMS, не восстановитель) и в ортологах сорго, риса и Brachypodium. В трех линиях восстановителей кукурузы этот гидрофильный остаток заменен гидрофобным фенилаланином (F₁₈₇). Такая неконсервативная замена может значительно изменить структуру спирали в домене bHLH и повлиять на связывание ДНК и последующую транскрипцию гена. Ввиду вышесказанного, авторы изобретения предсказали, что аллель rf4 из B104 не восстанавливает фертильность CMS-C, поскольку bHLH B104 имеет идентичную белковую последовательность с rf4-bHLH B73 и BE4207, включая консервативный тирозин в положении 186.

В некоторых вариантах осуществления молекулярные маркеры на основе Rf4-bHLH или прочно сцепленные высокопроизводительные молекулярные маркеры, описанные в настоящем описании, можно использовать для идентификации генотипов восстановителя Rf4, интрогрессии Rf4 в новые генотипы в кукурузе и других растениях для мужской конверсии, и удаления Rf4 из женских растений CMS. Имея маркеры и ген Rf4, в настоящее время возможно надежно перенести Rf4 в элитную зародышевую плазму и увеличить масштаб использования системы CMS-C/Rf4 для получения гибридных семян. Полная реализация этой системы может обеспечить значительные финансовые преимущества для сельскохозяйственной промышленности и потребителей ее продукции.

II. Термины

Обратное скрещивание: способы обратного скрещивания можно использовать для введения последовательности нуклеиновой кислоты в растения. Способ обратного скрещивания широко используют в течение десятилетий для введения новых признаков в растения. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. В типичном протоколе обратного скрещивания исходный представляющий интерес сорт (рекуррентное родительское растение) скрещивают со вторым сортом (нерекуррентное родительское растение), который имеет представляющий интерес ген, подлежащий переносу. Затем полученное потомство этого скрещивания вновь скрещивают с рекуррентным родительским растением, и этот процесс повторяют до тех пор, пока не получают растение, где по существу все из желаемых морфологических и физиологических характеристик рекуррентного растения не появятся в преобразованном растении, в дополнение к перенесенному гену из нерекуррентного родительского растения.

Сцепленные, прочно сцепленные и чрезвычайно прочно сцепленные: как используют в рамках изобретения, сцепление между генами или маркерами относится к явлению, когда гены или маркеры на хромосоме демонстрируют поддающуюся измерению вероятность совместной передачи особям следующего поколения. Чем ближе два гена или маркера друг к другу, тем ближе к (1) эта вероятность. Таким образом, термин "сцепленный" может относиться к одному или нескольким генам или маркерам, которые передаются совместно с геном с вероятностью более 0,5 (которая ожидается, исходя из независимого распределения, где маркеры/гены расположены на различных хромосомах). Поскольку близкое расположение двух генов или маркеров на хромосоме прямо связано с вероятностью того, что гены или маркеры будут передаваться совместно особям в следующем поколении, термин "сцепленный" также может относиться в настоящем описании к одному или нескольким генам или маркерам, которые расположены в пределах приблизительно 2,0 млн п.н. друг от друга на одной и той же хромосоме кукурузы. Таким образом, два "сцепленных" гена или маркера могут быть разделены приблизительно 2,1 млн п.н.; 2,00 млн п.н.; приблизительно 1,95 млн п.н.; приблизительно 1,90 млн п.н.; приблизительно 1,85 млн п.н.; приблизительно 1,80 млн п.н.; приблизительно 1,75 млн п.н.; приблизительно 1,70 млн п.н.; приблизительно 1,65 млн п.н.; приблизительно 1,60 млн п.н.; приблизительно 1,55 млн п.н.; приблизительно 1,50 млн п.н.; приблизительно 1,45 млн п.н.; приблизительно 1,40 млн п.н.; приблизительно 1,35 млн п.н.; приблизительно 1,30 млн п.н.; приблизительно 1,25 млн п.н.; приблизительно 1,20 млн п.н.; приблизительно 1,15 млн п.н.; приблизительно 1,10 млн п.н.; приблизительно 1,05 млн п.н.; приблизительно 1,00 млн п.н.; приблизительно 0,95 млн п.н.; приблизительно 0,90 млн п.н.; приблизительно 0,85 млн п.н.; приблизительно 0,80 млн п.н.; приблизительно 0,75 млн п.н.; приблизительно 0,70 млн п.н.; приблизительно 0,65 млн п.н.; приблизительно 0,60 млн п.н.; приблизительно 0,55 млн п.н.; приблизительно 0,50 млн п.н.; приблизительно 0,45 млн п.н.; приблизительно 0,40 млн п.н.; приблизительно 0,35 млн п.н.; приблизительно 0,30 млн п.н.; приблизительно 0,25 млн п.н.; приблизительно 0,20 млн п.н.; приблизительно 0,15 млн п.н.; приблизительно 0,10 млн п.н.; приблизительно 0,05 млн п.н.; приблизительно 0,025 млн п.н.; приблизительно 0,012 млн п.н.; и приблизительно 0,01 млн п.н. Конкретные примеры маркеров, которые "сцеплены" с Rf4, включают нуклеотидные последовательности в верхней части 8 хромосомы генома кукурузы, например, SEQ ID NO: 1-197; и маркеры, упоминаемые в настоящем описании как полиморфизмы ID №№ 1-106 (таблица 3).

Как используют в рамках изобретения, термин "прочно сцепленный" может относиться к одному или нескольким генам или маркерам, которые расположены в пределах приблизительно 0,5 млн п.н. друг от друга на одной и той же хромосоме кукурузы. Таким образом, два "прочно сцепленных" гена или маркера могут быть разделены приблизительно 0,6 млн п.н.; приблизительно 0,55 млн п.н.; 0,5 млн п.н.; приблизительно 0,45 млн п.н.; приблизительно 0,4 млн п.н.; приблизительно 0,35 млн п.н.; приблизительно 0,3 млн п.н.; приблизительно 0,25 млн п.н.; приблизительно 0,2 млн п.н.; приблизительно 0,15 млн п.н.; приблизительно 0,12 млн п.н.; приблизительно 0,1 млн п.н.; и приблизительно 0,05 млн п.н. Конкретные примеры маркеров, которые "прочно сцеплены" с Rf4, включают SEQ ID NO: 6-9; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 118-120; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 189-191; и SEQ ID NO: 97; и маркеры, упоминаемые в настоящем описании как полиморфизмы ID №№ 1-106 (таблица 3).

Как используют в рамках изобретения, термин "чрезвычайно прочно сцепленный" может относиться к одному или нескольким генам или маркерам, которые расположены в пределах приблизительно 100 т.п.н. друг от друга на одной и той же хромосоме кукурузы. Таким образом, два "чрезвычайно прочно связанных" гена или маркера могут быть разделены приблизительно 125 т.п.н.; приблизительно 120 т.п.н.; приблизительно 115 т.п.н.; приблизительно 110 т.п.н.; приблизительно 105 т.п.н.; 100 т.п.н.; приблизительно 95 т.п.н.; приблизительно 90 т.п.н.; приблизительно 85 т.п.н.; приблизительно 80 т.п.н.; приблизительно 75 т.п.н.; приблизительно 70 т.п.н.; приблизительно 65 т.п.н.; приблизительно 60 т.п.н.; приблизительно 55 т.п.н.; приблизительно 50 т.п.н.; приблизительно 45 т.п.н.; приблизительно 40 т.п.н.; приблизительно 35 т.п.н.; приблизительно 30 т.п.н.; приблизительно 25 т.п.н.; приблизительно 20 т.п.н.; приблизительно 15 т.п.н.; приблизительно 12 т.п.н.; приблизительно 10 т.п.н.; приблизительно 5 т.п.н.; и приблизительн