Выделение и очистка антител против il-13 с применением аффинной хроматографии с белком а

Выделение и очистка антител против il-13 с применением аффинной хроматографии с белком а

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 61/253411, зарегистрированной 20 октября 2009 года, которая включена в настоящий документ путем ссылки в полном объеме.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

IL-13 человека представляет собой гликопротеин массой 17 кДа, клонированный из активированных Τ-клеток, и он продуцируется активированными Τ-клетками Th2-линии, ThO и ThI CD4+ Τ-клетками, CD8+ Τ-клетками и некоторыми не-T-клеточными популяциями, такими как тучные клетки. (Zurawski and de Vries, 1994 Immunol Today, 15, 19-26). IL-13 способствует переключению изотипа иммуноглобулина на IgE в Β-клетках человека (Punnonen, Aversa et al. 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 3730-4) и супрессирует продукцию воспалительных цитокинов у человека и мыши (de Waal Malefyt et al., 1993, J Immunol, 151, 6370-81; Doherty et al., 1993, J Immunol, 151, 7151-60). IL-13 связывается со своими рецепторами IL-13Rα1 и IL-13Rα2 на поверхности клетки. IL-13Rα1 взаимодействует с IL-13 с низкой аффинностью (KD ~10 нМ) с последующим вовлечением IL-4R для образования высокоаффинного (KD ~0,4 нМ) сигнального гетеродимерного рецепторного комплекса (Aman et al., 1996, J Biol Chem, 271, 29265-70; Hilton et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 497-501). Комплекс IL-4R/IL-13Rα1 экспрессируется на многих типах клеток, таких как Β-клетки, моноциты/макрофаги, дендритные клетки, эозинофилы, базофилы, фибробласты, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки дыхательных путей и гладкомышечные клетки дыхательных путей (Graber et al., 1998, Eur J Immunol, 28, 4286-98; Murata et al., 1998, Int Immunol, 10, 1103-10; Akaiwa et al., 2001, Cytokine, 13, 75-84). Лигирование рецепторного комплекса IL-13Rα1/IL-4R приводит к активации множества путей передачи сигнала, включая пути трансдуктора сигнала и активатора транскрипции (ST AT6) и субстрата рецептора инсулина 2 (IRS-2) (Wang et al, 1995, Blood, 864218-27; Takeda et al., 1996, J Immunol, 157, 3220-2). Отдельно цепь IL-13Rα2 обладает высокой аффинностью (KD ~0,25-0,4 нМ) к IL-13 и функционирует в качестве рецептора-ловушки, отрицательно регулирующего связывание IL-13 (Donaldson et al., 1998, J Immunol, 161, 2317-24), и сигнального рецептора, индуцирующего синтез TGF-β и фиброз через путь AP-I в макрофагах и, возможно, в других типах клеток (Fichtner-Feigl, Strober et al. 2006 Nat Med 12 99-106).

Некоторые исследования, проведенные на доклинических моделях астмы у животных, свидетельствуют о том, что IL-13 играет важную роль при астме. Эти данные включают устойчивость к астме у нокаутных по IL-13 мышей, а также ингибирование фенотипа астмы антагонистами IL-13 (растворимые рецепторы IL-13, mAb против IL-13 и т.д.) на различных моделях мышей (Wills-Karp and Chiaramonte, 2003, Curr Opin Pulm Med, 9 21-7; Wills-Karp, 2004, Immunol Rev, 202 175-90). Многочисленные исследования показали, что фармакологическое введение рекомбинантного IL-13 в легкие мышей, а также морских свинок, индуцирует гиперсекрецию слизи в дыхательных путях, эозинофилию и гиперчувствительность дыхательных путей ("AHR"); Grunig et al., 1998, Science, 282, 2261-3; Wills-Karp et al., 1998, Science, 282, 2258-61; Kibe et al., 2003, Am J Respir Crit Care Med, 167, 50-6; Vargaftig and Singer, 2003, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 284, L260-9; Vargaftig and Singer, 2003, Am J Respir Cell Mol Biol, 28, 410-9). Данные эффекты IL-13 воспроизводят в системах трансгенных мышей с конститутивной или индуцируемой экспрессией IL-13 13 (Zhu et al., 1999, J Clin Invest, 103, 779-88; Zhu et al., 2001, Am J Respir Crit Care Med, 164, S67- 70; Lanone et al., 2002, J Clin Invest, 110463-74). Хроническая трансгенная гиперэкспрессия IL-13 также индуцирует субэпителиальный фиброз и эмфизему. У мышей, дефектных по сигнальной молекуле IL-13 (и IL-4) STAT6, не может развиваться индуцируемая аллергеном AHR и сверхпродукция слизи (Kuperman et al, 2002, Nat Med, 8, 885-9). Исследования с использованием слитого белка растворимого рецептора IL-13 (sIL-13Rα2Fc) показали ключевую роль данного цитокина в экспериментальном заболевании дыхательных путей, индуцированном аллергеном овальбумином (OVA) (Grunig et al., 1998, Science, 282, 2261-3; Wills-Karp et al., 1998, Science, 282, 2258-61; Taube et al., 2002, J Immunol, 169, 6482-9). Эффективность лечения против IL-13 также демонстрировали на хронической модели астмы у мышей. Кроме проявления свойств гиперсекреции слизи и AHR, на данной модели хронической астмы демонстрируют некоторые черты заболевания человека, отсутствующие во многих острых моделях. Они включают эозинофилию ткани легкого, находящейся во внутриэпителиальных пространствах, а также фиброз гладких мышц, измеряемый по повышению накопления коллагена. Хроническую модель астмы индуцируют повторными ингаляторными провокациями OVA OVA-сенсибилизированных мышей 1 раз в неделю, всего в течение 4 недель. Антитело против IL-13, вводимое в течение последних 2 недель провокаций OVA (с 36 дня с учетом эффективности, оцениваемой на 53 день исследования), значимо ингибировало AHR, легочное воспаление, гиперплазию бокаловидных клеток, гиперсекрецию слизи и фиброз дыхательных путей (Yang et al., 2005, J Pharmacol Exp Ther, 313, 8-15). IL-13 вовлечен в патогенез астмы человека, поскольку в легких астматических пациентов были обнаружены повышенные уровни мРНК и белка IL-13, коррелирующие с тяжестью заболевания (Huang et al., 1995, J Immunol, 155, 2688-94). Кроме того, были идентифицированы генетические полиморфизмы IL-13 человека, приводящие к повышенным уровням IL-13, и они ассоциированы с астмой и атопией (Heinzmann et al., 2000, Hum Mol Genet, 9, 549-59; Hoerauf et al., 2002, Microbes Infect, 4, 37-42; Vercelli, 2002, Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2, 389-93; Heinzmann et al., 2003, J Allergy Clin Immunol, 112, 735-9; Chen et al., 2004, J Allergy Clin Immunol, 114, 553-60; Vladich et al., 2005, J Clin Invest, 115, 747-54), и в легких пациентов с астмой были обнаружены повышенные уровни IL-13 (Huang et al., 1995, J Immunol, 155, 2688-94; Arima et al., 2002, J Allergy Clin Immunol, 109, 980-7; Berry et al., 2004, J Allergy Clin Immunol, 114, 1106-9). Также была продемонстрирована генетическая связь между IL-13 и астмой, так как индивидуумы с полиморфизмом гена IL-13, который является причиной более высоких уровней IL-13 в плазме, обладают повышенным риском атопии и астмы (Wills-Karp, 2000, Respir Res, 1, 19-23).

Вследствие роли IL-13 человека в различных нарушениях у человека были разработаны терапевтические стратегии для ингибирования или противодействия активности IL-13. В частности, проводили поиск антител, которые связываются с IL-13 и нейтрализуют его, в качестве средств для ингибирования активности IL-13. Однако в данной области существует потребность в совершенствовании способов получения и очистки таких антител для фармацевтического применения. Настоящее изобретение направлено на решение этой потребности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к очищенным, выделенным антителам и фрагментам антител, которые связываются с IL-13, а также к фармацевтическим композициям, содержащим такие антитела и фрагменты. В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к выделенным антителам или их антигенсвязывающим частям, которые связываются с IL-13 человека. Выделенные антитела против IL-13 по настоящему изобретению можно использовать в клинических условиях, а также в исследованиях и разработках. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу против IL-13, содержащему последовательности тяжелой и легкой цепи, указанные на фигуре 1.

Определенные варианты осуществления изобретения относятся к способам очистки антител против IL-13 или их антигенсвязывающих частей из матрицы образца для получения антител, по существу не содержащих белки клетки-хозяина ("HCP") и выщелоченный белок A. В определенных аспектах матрица образца (или просто "образец") включает клеточную линию, используемую для получения антител против IL-13 по настоящему изобретению. В конкретных аспектах образец содержит клеточную линию, используемую для получения антител человека против IL-13.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки антител против IL-13, который включает первичную стадию выделения, в частности, удаления клеток и продуктов распада клеток. В некоторых вариантах осуществления способа первичная стадия выделения включает одну или несколько стадий центрифугирования или глубинной фильтрации. Для примера, а не путем ограничения, такие стадии центрифугирования можно выполнять при скорости от приблизительно 7000×g до приблизительно 11000×g. Кроме того, определенные варианты осуществления описываемого выше способа будут включать стадию глубинной фильтрации, такую как стадия обезжиривающей глубинной фильтрации.

В конкретных вариантах осуществления первично выделенный образец подвергают стадии аффинной хроматографии. Стадия аффинной хроматографии включает помещение первично выделенного образца на колонку, содержащую подходящую подложку для аффинной хроматографии. Неограничивающие примеры таких подложек для хроматографии включают, но не ограничиваются ими,, смолу с белком А, смолу с белком G, подложки для аффинной хроматографии, содержащие антиген, против которого индуцировали представляющее интерес антитело, и подложки для аффинной хроматографии, содержащие Fc-связывающий белок. Смола с белком A применима для аффинной очистки и выделения антител (IgG). В одном из аспектов колонку с белком A уравновешивают подходящим буфером до нагрузки образца. Примером подходящего буфера является буфер Трис/NaCl, pH приблизительно 7,2. После такого уравновешивания образец можно нагружать на колонку. После нагрузки колонки ее можно промыть один или несколько раз с помощью, например, равновесного буфера. До элюирования из колонки можно использовать другие промывки, включая промывки с применением различных буферов. Затем можно проводить элюирование из колонки с белком A, используя соответствующий элюирующий буфер. Примером подходящего элюирующего буфера является буфер уксусная кислота/NaCl, pH приблизительно 3,5. Элюат можно проверять с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, затем можно измерять поглощение при OD₂₈₀. После этого для дальнейшей обработки можно получать представляющую интерес элюированную фракцию (фракции).

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения за аффинной хроматографией с белком A следует стадия доведения до низкого pH. В таких вариантах осуществления pH элюата с белком A, содержащего предполагаемое антитело против IL-13 или его антигенсвязывающую часть, доводят до значения pH от приблизительно 3 до приблизительно 4. В некоторых аспектах pH доводят до значения приблизительно 3,5. Низкий pH, в частности, способствует снижению и/или инактивации pH-чувствительных вирусов, которые могут контаминировать образец. После соответствующего периода времени pH доводят до значения от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,0, включая, без ограничения, приблизительно 5,0, и образец подвергают дополнительным стадиям очистки.

В конкретных вариантах осуществления после стадии аффинной хроматографии с белком A или доведения до низкого pH следует стадия ионного обмена. Данная стадия ионного обмена может представлять собой обмен катионов или анионов или последовательное сочетание обоих. Данная стадия может быть одной процедурой ионного обмена или может включать несколько стадий ионного обмена, таких как стадия обмена катионов с последующей стадией обмена анионов или наоборот. В одном из аспектов стадия ионного обмена является процедурой в одну стадию. В другом аспекте стадия ионного обмена включает две стадии процесса ионного обмена. Подходящей для катионного обмена колонкой является колонка, неподвижная фаза которой содержит анионные группы. Примером такой колонки является Fractogel™ SO₃ ^-. Данная стадия ионообменной хроматографии с захватом облегчает выделение антител из образца. Подходящей для анионного обмена колонкой является колонка, неподвижная фаза которой содержит катионные группы. Примером такой колонки является колонка Q Sepharose™. Альтернативой является мембранный элемент Pall Mustang Q. Также одной или несколькими стадиями ионного обмена выделяют антитела путем снижения примесей, таких как белки и ДНК клетки-хозяина, и, при необходимости, белок аффинной матрицы. Данный метод анионного обмена является проточным методом хроматографии, где представляющие интерес антитела не взаимодействуют или не связываются с анионообменной смолой (или твердой фазой). Однако многие примеси взаимодействуют и связываются с анионообменной смолой. В конкретном аспекте стадия ионного обмена представляет собой анионообменную хроматографию.

Элюат аффинной хроматографии получают для ионообменной хроматографии путем регулирования pH и ионной силы буфера для образцов. Например, pH элюата, полученного при аффинной хроматографии, можно доводить до значения pH от приблизительно 4,5 до приблизительно 8,5 в 1 Μ буфере Трис. До нагрузки образца (элюата, полученного при аффинной хроматографии) на ионообменную колонку ее можно уравновешивать с помощью подходящего буфера. Примером подходящего буфера является буфер Трис/NaCl с pH от приблизительно 4,5 до приблизительно 8. После уравновешивания колонку можно нагружать элюатом, полученным при аффинной хроматографии. После нагрузки колонку можно промыть подходящим буфером один или несколько раз. Примером подходящего буфера является сам уравновешивающий буфер. Сбор элюата можно начинать, например, при достижении поглощения (OD₂₈₀) выше приблизительно 0,2 о.е.

В конкретных вариантах осуществления первую и вторую стадию ионного обмена осуществляют после первичного выделения или, в ином случае, в отсутствие стадии аффинной хроматографии. В некоторых таких вариантах осуществления образец, полученный на стадии ионного обмена, подвергают промежуточной стадии фильтрации до первой стадии ионного обмена, между двумя стадиями ионного обмена или обоим. В конкретных аспектах данная стадия фильтрации включает ультрафильтрацию/диафильтрацию ("UF/DF") с захватом. В частности, такая фильтрация облегчает концентрирование и обмен буфера антител против IL-13 и их антигенсвязывающих частей.

Конкретные варианты осуществления изобретения относятся к способу, включающему одну или несколько стадий хроматографии с гидрофобным взаимодействием ("HIC"). Подходящей колонкой для HIC является такая колонка, неподвижная фаза которой содержит гидрофобные группы. Неограничивающим примером такой колонки является колонка Phenyl HP Sepharose™. В некоторых обстоятельствах при выделении/очистке антитела против IL-13 будут образовываться агрегаты. Включение одной или нескольких стадий HIC облегчает снижение или удаление таких агрегатов. HIC также способствует удалению примесей. В конкретных вариантах осуществления на стадии HIC используют высокосолевой буфер для стимулирования взаимодействия антител против IL-13 (или их агрегатов) с гидрофобной колонкой. Затем антитела против IL-13 можно элюировать с использованием более низких концентраций соли.

В конкретных вариантах осуществления элюат, полученный при HIC, фильтруют с использованием фильтра для удаления вирусов такого как, но без ограничения, фильтр Ultipor DV50™ (Pall Corporation, East Hills, N.Y.). В таких вариантах осуществления также можно использовать альтернативные фильтры, такие как фильтры Viresolve™ (Millipore, Billerica, Mass.); фильтры Zeta Plus VR™ (CUNO; Meriden, Conn.); и фильтры Planova™ (Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, 111.).

В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к одной или нескольким фармацевтическим композициям, содержащим выделенное антитело против IL-13 или его антигенсвязывающую часть и приемлемый носитель. В одном из аспектов, в дополнение к антителу против IL-13, композиция дополнительно содержит одно или несколько антител или их антигенсвязывающие части. В другом аспекте композиции дополнительно содержат одно или несколько фармацевтических средств.

Чистоту представляющих интерес антител в полученном препарате образца можно анализировать с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области, например, эксклюзионной хроматографии, ВЭЖХ-анализа Poros™ A, HCP ELISA, ELISA с белком A и вестерн-блоттинга.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 представлены последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи неограничивающего примера антитела против IL-13.

На фигуре 2 представлена функциональная диаграмма примера способа культивирования клеток, включая заданные величины, производственные тесты и пределы воздействия.

На фигуре 3 представлено сравнение альтернативных стратегий культивирования клеток.

На фигуре 4 представлена функциональная диаграмма способа первичного выделения и хроматографии с захватом, включая заданные величины, производственные тесты и пределы воздействия.

На фигуре 5 представлено сравнение альтернативных стратегий первичного выделения и захвата.

На фигуре 6 представлена функциональная диаграмма способа глубокой очистки, включая заданные величины, производственные тесты и пределы воздействия.

На фигуре 7 представлено сравнение альтернативных стратегий глубокой очистки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с IL-13. В одном из аспектов изобретение относится к выделенным антителам или их антигенсвязывающим частям, которые связываются с IL-13 человека. Выделенное антитело против IL-13 по настоящему изобретению можно использовать в клинических условиях, а также в исследованиях и разработках. Настоящее изобретение также относится к способам очистки антител против IL-13 или их антигенсвязывающих частей. Подходящие антитела против IL-13, которые могут быть очищены в контексте настоящего изобретения, описаны в заявке PCT № PCT/US2007/019660, которая включена в данное описание путем ссылки в полном объеме, включая антитело, которое затем было идентифицировано как ABT-308. Примеры последовательностей тяжелой и легкой цепи антитела против IL-13 приведены на фигуре 1. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитела против IL-13 или их антигенсвязывающие части, описываемые в настоящем документе.

Для ясности, но не для ограничения, данное подробное описание разделено на следующие подчасти:

1. Определения;

2. Образование антител;

3. Получение антител;

4. Очистка антител;

5. Методы анализа чистоты образца;

6. Дополнительные модификации;

7. Фармацевтические композиции; и

8. Применение антител.

1. Определения

Для лучшего понимания настоящего изобретения сначала приведены определения конкретных терминов.

Термин "антитело" включает молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, связанных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в настоящем документе как HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в настоящем документе как LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL дополнительно могут быть разделены на гипервариабельные области, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или "часть антитела") включает фрагменты антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, hIL-13). Показано, что антигенсвязывающую функцию антитела могут осуществлять фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, содержащий VL, VH, CL и CH1 домены; (ii) F(ab')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, содержащий VH и CH1 домены; (iv) Fv-фрагмент, содержащий VL и VH домены одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (публикация Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, полное содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки), содержащий VH домен; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируют разные гены, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов синтетическим линкером, позволяющим получать их как одну белковую цепь, в которой области VL и VH расположены парой с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, публикации Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, полное содержание которых включено в настоящий документ путем ссылки). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термин "антигенсвязывающая часть" антитела. Также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела являются бивалентными, биспецифическими антителами, в которых VH и VL домены экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить возможность образования пар между двумя доменами на одной цепи, таким образом, вынуждая домены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антигенсвязывающих участка (см., например, публикации Holliger P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123, полное содержание которых включено в настоящий документ путем ссылки). Кроме того, антитело или его антигенсвязывающая часть могут быть частью большей молекулы иммуноадгезии, образованной ковалентной или нековалентной связью антитела или части антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают применение коровой области стрептавидина для получения тетрамерной scFv молекулы (публикация Kipriyanov S. M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101, полное содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки) и применение остатка цистеина, маркерного пептида и C-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и биотинилированных молекул scFv (публикация Kipriyanov S. M et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058, полное содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки). Части антитела, такие как Fab- и F(ab')₂-фрагменты, могут быть получены из целых антител с использованием общепринятых способов, таких как расщепление целых антител папаином или пепсином, соответственно. Кроме того, антитела, части антитела и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных способов рекомбинантной ДНК, как описано в настоящем документе. В одном из аспектов антигенсвязывающие части являются полными доменами или парами полных доменов.

Как используется в настоящем документе, фраза "интерлейкин-13 человека" (сокращенно обозначаемый в настоящем документе как hIL-13 или IL-13) относится к гликопротеину массой 17 кДа, клонированному из активированных Τ-клеток (Zurawski and de Vries, 1994 Immunol Today 15 19-26), и он продуцируется активированными Τ-клетками Th2-линии. ThO и ThI CD4+ Τ-клетки, CD8+ Τ-клетки и некоторые не-T-клеточные популяции, такие как тучные клетки, также продуцируют IL-13 (Zurawski and de Vries, 1994 Immunol Today 15 19-26). Функция IL-13 включает стимуляцию переключения изотипа иммуноглобулина на IgE в Β-клетках человека (Punnonen, Aversa et al. 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 3730-4) и супрессию продукции воспалительных цитокинов у человека и мыши (de Waal et al., 1993 J Immunol 151 6370-81; Doherty et al., 1993 J Immunol 151 7151-60). IL-13 связывается с рецепторами на поверхности клетки, идентифицированными как IL-13Rα1 и IL-13Rα2. Рецептор IL-13Rα1 взаимодействует с IL-13 с низкой аффинностью (KD ~10 нМ) с последующим вовлечением IL-4R для образования высокоаффинного (KD ~0,4 нМ) сигнального гетеродимерного рецепторного комплекса (Aman et al., 1996 J Biol Chem 271 29265-70; Hilton et al., 1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 497-501). Комплекс IL-4R/IL-13Rα1 экспрессируется на многих типах клеток, таких как Β-клетки, моноциты/макрофаги, дендритные клетки, эозинофилы, базофилы, фибробласты, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки дыхательных путей и гладкомышечные клетки дыхательных путей (Graber et al., 1998 Eur J Immunol 28 4286-98; Murata et al., 1998 Int Immunol 10 1103-10; Akaiwa et al., 2001 Cytokine 13 75-84) Лигирование рецепторного комплекса IL-13Rα1/IL-4R приводит к активации множества путей передачи сигнала, включая пути трансдуктора сигнала и активатора транскрипции (STAT6) и субстрата рецептора инсулина 2 (IRS-2) (Wang et al., 1995 Blood 864218-27; Takeda et al., 1996 J Immunol 157 3220-2). Цепь IL-13Rα2 сама по себе обладает высокой аффинностью (KD ~0,25-0,4 нМ) к IL-13 и функционирует в качестве рецептора-ловушки, отрицательно регулирующего связывание IL-13 (Donaldson, Whitters et al. 1998 J Immunol 161 2317-24), и в качестве сигнального рецептора, который индуцирует синтез TGF-β и фиброз через путь AP-I в макрофагах и, возможно, в других типах клеток (Fichtner-Feigl et al., 2006 Nat Med 12 99-106). Кодирующая IL-13 нуклеиновая кислота доступна под номером доступа GenBank NM_002188, и полипептидная последовательность доступна под номером доступа GenBank NP_002179. Термин IL-13 человека предназначен для включения рекомбинантного IL-13 человека (rh IL-13), который может быть получен стандартными рекомбинантными способами экспрессии.

Термины "нумерация по Kabat", "значения по Kabat" и "обозначение по Kabat" используют взаимозаменяемо в настоящем документе. Эти общепризнанные в данной области термины относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными), чем другие аминокислотные остатки в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи антитела или его антигенсвязывающей части (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 and Kabat Ε. Α. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, полное содержание которых включено в настоящий документ путем ссылки). Что касается вариабельной области тяжелой цепи, то гипервариабельная область находится в диапазоне положений аминокислоты от 31 до 35 для CDR1, положений аминокислоты от 50 до 65 для CDR2 и положений аминокислоты от 95 до 102 для CDR3. Что касается вариабельной области легкой цепи, то гипервариабельная область находится в диапазоне положений аминокислоты от 24 до 34 для CDR1, положений аминокислоты от 50 до 56 для CDR2 и положений аминокислоты от 89 до 97 для CDR3.

Термин "антитело человека" включает антитела, обладающие вариабельными и константными областями, соответствующими последовательностям зародышевой линии иммуноглобулина человека, как описано Kabat et al. (См. Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями зародышевой линии иммуноглобулина человека (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR и, в частности, CDR3. Мутации могут быть введены с использованием "подхода избирательного мутагенеза". Антитело человека может иметь по меньшей мере одно положение, замененное аминокислотным остатком, например, повышающим активность аминокислотным остатком, не кодируемым последовательностью зародышевой линии иммуноглобулина человека. Антитело человека может иметь вплоть до двадцати положений, замененных аминокислотными остатками, которые не являются частью последовательности зародышевой линии иммуноглобулина человека. В других вариантах осуществления заменяют до десяти, до пяти, до трех или до двух положений. В одном из вариантов осуществления такие замены находятся внутри областей CDR. Однако, как используется в настоящем документе, термин "антитело человека" не предназначен для включения антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, пересаживают на каркасные последовательности человека.

Фраза "подход избирательного мутагенеза" включает способ повышения активности антитела посредством выбора и отдельного мутагенеза аминокислот CDR по меньшей мере одного подходящего для избирательного мутагенеза положения, гипермутации и/или положения контакта. "Подвергнутое избирательному мутагенезу" антитело человека является антителом, которое содержит мутацию в положении, выбранном с использованием подхода избирательного мутагенеза. В другом аспекте подход избирательного мутагенеза предназначен для обеспечения способа предпочтительного мутагенеза выбранных отдельных аминокислотных остатков в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (далее в настоящем документе H1, H2 и H3, соответственно), или CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи (далее в настоящем документе обозначаемыми как LI, L2 и L3, соответственно) антитела. Аминокислотные остатки могут быть выбраны из положений для избирательного мутагенеза, положений контактов или положений гипермутаций. Отдельные аминокислоты выбирают на основе их положения в вариабельной области легкой или тяжелой цепи. Следует понимать, что положение гипермутации также может быть положением контакта. В одном из аспектов подход избирательного мутагенеза является "нацеленным подходом". Выражение "нацеленный подход" предназначено для включения способа мутагенеза выбранных отдельных аминокислотных остатков в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи или CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела нацеленным образом, например, "нацеленного подхода по группам" или "нацеленного подхода по CDR". При "нацеленном подходе по группам" отдельные аминокислотные остатки в конкретных группах являются целевыми для избирательных мутаций, включая группы I (включая L3 и H3), II (включая H2 и L1) и III (включая L2 и H1), группы приведены в порядке предпочтения для нацеливания. При "нацеленном подходе по CDR" отдельные аминокислотные остатки в конкретных CDR являются целевыми для избирательных мутаций в следующем порядке предпочтения для нацеливания: H3, L3, H2, L1, H1 и L2. Выбранный аминокислотный остаток подвергают мутагенезу, например, по меньшей мере до двух других аминокислотных остатков, и определяют эффект мутации на активность антитела. Активность измеряют как изменение специфичности связывания/аффинности антитела и/или нейтрализующей активности антитела. Следует понимать, что подход избирательного мутагенеза можно использовать для оптимизации любого антитела, полученного из любого источника, включая фаговый дисплей, трансгенных животных с генами зародышевой линии IgG человека, антитела человека, выделенные из B-клеток человека. Подход избирательного мутагенеза можно применять на антителах, которые дополнительно не могут быть оптимизированы с использованием технологии фагового дисплея. Следует понимать, что антитела из любого источника, включая фаговый дисплей, трансгенных животных с генами зародышевой линии IgG человека, антитела человека, выделенные из B-клеток человека, могут быть подвергнуты обратной мутации до или после подхода избирательного мутагенеза.

Фраза "рекомбинантное антитело человека" включает антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека, антитела, выделенные у животного (например, мыши), трансгенного по генам иммуноглобулина человека (см., например, публикацию Taylor L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295, полное содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки), или антитела полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими средствами, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека обладают вариабельными и константными областями, полученными из последовательностей зародышевой линии иммуноглобулинов человека (см., Kabat, Ε. Α., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Однако в конкретных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности VH и VL областей рекомбинантных антител являются последовательностями, которые могут не существовать в природе в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo, несмотря на то, что они получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и относятся к ним. Однако в конкретных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела являются результатом подхода избирательного мутагенеза или обратной мутации, или обоих.

"Выделенное антитело" включает антитело, которое по существу не содержит другие антитела, обладающие различными антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфически связывает hIL-13, по существу не содержит антитела, которые специфически связывают антигены, отличные от hIL-13). Выделенное антитело, которое специфически связывает hIL-13, может связывать молекулы IL-13 других видов. Кроме того, выделенное антитело может по существу не содержать другой клеточный материал и/или химические вещества.

"Нейтрализующее антитело" (или "антитело, которое нейтрализует активность hIL-13") включает антитело, связывание с hIL-13 которого приводит к ингибированию биологической активности hIL-13. Данное ингибирование биологической активности hIL-13 можно оценивать путем измерения одного или нескольких индикаторов биологической активности hIL-13. Эти индикаторы биологической активности hIL-13 можно оценивать одним или несколькими из некоторых известных в данной области анализов in vitro или in vivo.

Термин "активность" включает активности, такие как специфичность связывания/аффинность антитела к антигену, например, антитела против hIL-13, которое связывается с антигеном IL-13, и/или нейтрализующая активность антитела, например, антитела против hIL-13, связывание которого с hIL-13 ингибирует биологическую активность hIL-13.

Фраза "поверхностный плазмонный резонанс" включает оптическое явление, позволяющее проводить анализ биоспецифических взаимодействий в реальном времени путем определения изменений концентраций белка в матрице биосенсора, например, с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, Ν.J.). Для дополнительного описания см. публикации Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., el al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277, полное содержание которых включено в настоящий документ путем ссылки.

Как используется в настоящем документе, термин "Koff" предназначен для обозначения константы скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

Как используется в настоящем документе, термин "Kd" предназначен для обозначения константы диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

Фраза "молекула нуклеиновой кислоты" включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но в одном из аспектов является двухцепочечной ДНК.

Как используется в настоящем документе, фраза "выделенная молекула нуклеиновой кислоты" относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела или части антител (например, VH, VL, CDR3), например, те, которые связывают hIL-13 и включают молекулу нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или часть антитела, не содержат другие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или части антител, которые связывают антигены, отличные от hIL-13, причем эти другие последовательности могут естественным образом фланкировать нуклеиновую кислоту в геномной ДНК человека. Таким образом, например, выделенная нуклеиновая кислота по изобретению, кодирующая VH область антитела против hIL-13, не содержит другие последовательности, кодирующие другие VH области, которые связывают антигены, отличные, например, от hIL-13. Фраза "выделенная молекула нуклеиновой кислоты" также предназначена для включения последовательностей, кодирующих бивалентные, биспецифические антитела, такие как диатела, в которых VH и VL области не содержат другие последовательности, отличные от последовательностей диатела.

Фраза "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") включает клетку, в которую был введен рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует понимать, что такие термины предназначены для обозначения не только конкретного объекта клетки, но и потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут иметь место определенные модификации по причине их мутации или воздействий о