Изолированные штаммы микроорганизмов lactobacillus plantarum mcc1 dsm 23881 и lactobacillus gasseri mcc2 dsm 23882 и их применение

Изолированные штаммы микроорганизмов lactobacillus plantarum mcc1 dsm 23881 и lactobacillus gasseri mcc2 dsm 23882 и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и будет использовано в пищевой промышленности. Более конкретно, изобретение относится к штаммам микроорганизмов L. plantarum МСС1 и L. gasseri MCC2 и их применению для уменьшения аллергии на молоко и симптомов раздражения нижних мочевыводящих путей, сопутствующих доброкачественной гиперплазии предстательной железы, а также окислительного стресса и воспаления, ассоциированных с ними.

Уровень техники

Молочнокислые бактерии в течение долгого времени используются при производстве полезных для здоровья пищевых продуктов, например в качестве заквасочных культур. Наиболее распространенным способом является применение молочнокислых бактерий в функциональных пищевых продуктах. Функциональные пищевые продукты представляют собой пищевые продукты, которые в дополнение к обычной пищевой ценности содержат добавочные натуральные компоненты, которые оказывают полезное влияние на некоторые функции организма или снижают риск возникновения заболеваний.

Способы, включающие в себя применение специально биологически отобранных живых молочнокислых бактерий, которые на следующем технологическом этапе умерщвляют пастеризацией, менее широко использовались при приготовлении пищевых продуктов. Это означает, что конечный продукт не содержит живых молочнокислых бактерий, но при предварительной обработке, надлежащей технологической схеме и необходимых добавках созданный продукт имеет целенаправленный биологический эффект.

Аллергия на молоко и ее уменьшение

Инфекции, проблемы, связанные с воспалением, аллергией и окислительным стрессом, например пищевые аллергии, симптомы, связанные с мочеиспускательными путями (например, расстройства мочеиспускания, ассоциированные с заболеваниями предстательной железы), становятся все более экономически обременительными для общества. Например, до 4% населения страдает пищевыми аллергиями, и в США 100-200 случаев смерти напрямую связаны с пищевой аллергией. Пищевые аллергии (включая аллергическую реакцию на коровье молоко) представляют собой особенно серьезную проблему для детей. Применение молочных продуктов в детском питании необходимо для нормального роста и развития детей. Решение проблемы аллергенности пищи является очень сложным, поскольку невозможно создать продукты, которые абсолютно свободны от компонентов, вызывающих аллергическую реакцию, и при этом имеют очень высокий уровень хорошего биологического качества. Результатом недавних обсуждений в ООН, ВПО и ВОЗ стала следующая декларация: безаллергенность - время для ясности; тезис: не существует действующего законодательства, позволяющего декларировать полное отсутствие аллергенов. Таким образом, любые технологические идеи/решения, приводящие к созданию более гипоаллергенных продуктов, которые позволят уменьшить число случаев аллергических реакций у детей по меньшей мере на несколько процентов, будут иметь высокую ценность. Каждый процент, на который уменьшается число случаев аллергической реакции, очень важен в итоге/в долгосрочной перспективе, поскольку любой успех в области аллергологии, позволяющий снизить аллергенность пищевых продуктов, имеет значительные социально-экономические результаты (в том числе повышение качества жизни у детей и взрослых и снижение затрат на лечение).

Аллергенность молочных продуктов определяется белками, но выделение так называемого основного аллергена является затруднительным (Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition (EFSN) AP, 2003, Wal J.M. (2004) Bovine Milk Allergenicity. Ann.Allergy Asthma Immunol., 93, S2-11). Тем не менее, аллергические реакции на равном уровне вызываются казеином и бета-лактоглобулином. Аллергия на коровье молоко связана главным образом с α-казеином и β-лактоглобулином (Host A. (2002). Frequency of cow′s milk allergy in childhood. Ann Allergy Immunol 89 (Suppl 1): 33-7; EFSN, 2003). У многих детей с аллергией на молоко наблюдается реакция на альфа-казеин (Hill D.J, Firer M.A, Shelton M.J et al. (1986) Manifestation of milk allergy in infancy: clinical and immunologic findings. J Pediatr 109: 270-6; EFSN, 2003, Vandenplas Y, Brueton M, Dupont C, Hill D, Isolauri E, Koletzko S, Oranje AP, Staiano A. (2007) Guidelines for the diagnosis and management of cow′s milk protein allergy in infants. Arch Dis Child. 92: 902-908).

Казеин состоит из следующих элементов: α-S1 (основной аллерген), α-S2, β- и κ-казеин, где преобладают α-S1 и β-казеин. Ферментный гидролиз молочных белков снижает их аллергенность. При частичном гидролизе молочных белков формируются длинные пептиды, а более полный гидролиз приводит к образованию смеси длинных и коротких пептидов и аминокислот. Даже глубокий пепсин-трипсиновый гидролиз не приводит к получению безаллергенных веществ, поскольку аллергическая реакция может быть вызвана незначительными количествами иммунореактивных компонентов нативного белка. Таким образом, лишь подход, основанный на глубоком гидролизе, обеспечил некоторые возможности, однако он не обеспечивает окончательного решения, даже в случае с гидролизатами белков молочной сыворотки (Businco L, Cantani A, Longhi MA, Giampietro PG (1989) Anaphylactic reactions to a cow′s milk whey protein hydrolysate (Alfa-Ré, Nestlé) in infants with a cow′s milk allergy. Ann Allergy. 62 (4): 333-5.; Sampson НА, James MJ, Bernhisel-Broadbent J. (1992) Safety of an amino-derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics. 90, 463-465). Таким образом, необходимы новые подходы к уменьшению аллергии на коровье молоко, в связи с чем перспективную тенденцию к значительному уменьшению проблем, связанных с аллергией, представляет направленный гидролиз вызывающих аллергию молочных белков штаммом(ами) микроорганизмов, придающих дополнительную ценность продуктам.

Гидролиз молочных белков при помощи молочнокислых бактерий и добавок уже описан ранее. В патенте ЕЕ 03424 (заявка на патент WO 9700078, Valio Oy) описано применение штамма L. rhamnosus ATCC 53103 (LGG) для приготовления препарата гидролизата белка, причем белки гидролизуют пепсином и трипсином. Применение LGG для снижения риска аллергии рассматривается в нескольких изобретениях Nestec SA. В патенте ЕР 1296694 описано применение LGG для снижения риска атопических заболеваний у детей. В заявке на патент WO 2008116907 описано применение бифидобактерий и LGG, L. rhamnosus CGMCC 1.3724, L. reuteri ATCC 55730 и L. paracasei CNCM I-2116 для снижения риска у грудных детей, рожденных при помощи кесарева сечения, и в том числе с применением частично (2-20%) гидролизованных белков. В патентной заявке WO 03099037 Nestec SA описана протеолитическая система молочнокислых бактерий и пищевого продукта, содержащего Bifidobacterium lactis ATCC 27536 для применения в том числе для уменьшения пищевой аллергии, в то время как бактерии могут быть инактивированы или мертвы. В патенте ЕЕ 04724 (заявка на патент WO 9929833, Arla Foods) описано применение L. paracasei subsp. paracasei, в том числе для устранения атопических проблем у детей. В патенте ЕР 1175156 (Bioferme OY) описан пастеризованный зерновой напиток, содержащий микроорганизмы. В заявке на патент CN 101427782 (Min Zhao) описан содержащий бифидобактерий кукурузный напиток, который производят с помощью ферментации, и в котором бактерии инактивируют в ферментированном продукте. В концентрате белка молочной сыворотки (WPC) максимальный достигнутый уровень гидролиза β-лактоглобулина составил 21% (M. Pescuma et al (2007), Hydrolysis of whey proteins by L. acidophilus, Streptococcus thermophilus and L. delbrueckii ssp. bulgaricus grown in a chemically defined medium, Journal of Appl Microbiol, 103, 5, 1738-1746). Гидролиз молочных белков (2-32%) двумя микроорганизмами с целью получения продукта с хорошими вкусовыми качествами описан в европейском патенте ЕР 1383394 (New Zealand Dairy Board), причем один предлагаемый микроорганизм представляет собой Macrococcus, Micrococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Brevibacterium, Anthrobacker или Corynebacterium, предпочтительно Macrococcus caseolyticus, a другой микроорганизм представляет собой молочнокислую бактерию Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus или Leuconostoc, и ферментацию останавливают путем удаления или уничтожения микроорганизмов. В заявке на патент Японии JP 7203844 (Morinaga Milk Industry Co) описан частичный гидролиз молочной сыворотки (30%) с помощью фермента, получаемого от микроорганизма Bacillus subtilis, трипсина и папаина.

Проблемы с предстательной железой и их уменьшение

С предстательной железой может быть связано несколько проблем: нарушение проходимости мочевыводящих путей и раздражение и боль или дискомфорт в области малого таза. Проблемы с предстательной железой, в особенности связанные с мочеиспусканием, являются очень распространенными и снижают качество жизни у большого числа мужчин. По оценкам, гиперплазия предстательной железы (доброкачественная гиперплазия предстательной железы - ВРН) встречается приблизительно у половины мужчин в возрасте 50 лет и приблизительно у 70% мужчин старше 70 лет. Симптомы в области нижних мочевыводящих путей (LUTS), сопутствующие доброкачественной гиперплазии предстательной железы, включают в себя симптомы раздражения и непроходимости (связанные с опорожнением), которые оценивают по международной шкале простатических симптомов (IPSS). Любая возможность облегчения затрудненного мочеиспускания у мужчин нефармацевтическими средствами будет иметь значительную ценность, и наилучшей возможностью было бы создание нового пищевого продукта с таким эффектом.

Применение молочнокислых бактерий в терапевтических композициях для лечения и облегчения мочеполовых инфекций, в том числе инфекции предстательной железы, описано в нескольких заявках на патенты, причем описанные композиции содержат один или несколько видов молочнокислых бактерий (US 2008274162, Nessa Jeffrey Bryan et al., 2007).

Сочетание молочнокислых бактерий, одна из составляющих которого содержит L. crispatus, L. salivarius и L. casei, a другая составляющая содержит L. brevis, L. gasseri и L. fermentum, может быть использовано в качестве пищевой добавки или фармацевтической композиции для лечения и профилактики инфекций и воспалений, в том числе уретрита (ЕЕ 04620, Actial Farmaceutica Lda, 2000). Молочнокислые бактерии L. coprophilus PL 9001 (KCCM-10245) применялись для профилактики и лечения мочеполовых инфекций (KR 20040067161, PL BIO Co Ltd., 2003). Фармацевтические композиции, используемые в урологии для местного лечения, могут содержать в качестве активного вещества молочнокислые бактерии L. casei, L. gasseri (EP 353581, Silvana Tosi et al., 1993).

Вышесказанное показывает, что уменьшение аллергии на молоко и облегчение проблем с предстательной железой, в том числе с помощью частичного гидролиза и молочнокислых бактерий, исследовались в течение длительного времени.

Тем не менее, на рынке доступно недостаточное количество пищевых продуктов и пищевых добавок, которые уменьшают аллергию на молоко и облегчают проблемы с предстательной железой. Таким образом, существует потребность в приготовлении и применении надежных, проверенных испытаниями продуктов и пищевых добавок с полезными для здоровья свойствами.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к новым изолированным антиоксидантным штаммам микроорганизмов L. plantarum MCC1 DSM 23881 и L. gasseri MCC2 DSM 23882, композициям, содержащим один или оба упомянутых штамма, применению упомянутых микроорганизмов в качестве антиоксидантного протеолитического ингредиента для приготовления пищевого продукта и пищевой добавки, применению микроорганизмов для приготовления пищевого продукта и пищевой добавки, уменьшающих аллергию на молоко и симптомы воспаления нижних мочевыводящих путей, сопутствующие доброкачественному увеличению предстательной железы, и ассоциированный с ними окислительный стресс и воспаление, и к способу приготовления пищевого продукта и пищевой добавки, уменьшающих вышеупомянутые проблемы.

Молочнокислые бактерии, частично гидролизующие молочные белки, которые являются объектами настоящего изобретения, были обнаружены путем постепенной биоселекции. Цель состояла в нахождении штаммов с многовалентным биопотенциалом, многовалентность которого обеспечила бы возможность синергетического использования полезных биологических эффектов (большая степень гипоаллергенности, менее выраженные аллергические реакции, эффект уменьшения воспаления и окислительного стресса) для получения пищевых продуктов с желаемыми свойствами. Идея, лежащая в основе подхода согласно изобретению состоит не в достижении полного гидролиза белков. Попытки полного гидролиза предпринимались, но это создает новые проблемы, включая очень неприятные органолептические свойства продукта. Применение штаммов со множеством биологических потенциалов с требуемыми техническими процедурами и применение надлежащих полезных дополнительных сырых продуктов были выбраны в качестве идеологии настоящего изобретения. L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 имеют множество биологических потенциалов и обладают синергетическим эффектом - они способны целенаправленно (частично) гидролизовать молочные белки (казеины), они обладают значительной устойчивостью к окислению, они вырабатывают конъюгированную линолевую кислоту, NO и другие компоненты. Таким образом, изобретение обеспечивает возможность создания пищевых продуктов, обладающих потенциалом уменьшения аллергии на молоко и проблем с мочевыводящими путями, с помощью интегрального биотехнологического решения.

Описание L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2

Объекты настоящего изобретения, L. plantarum MCC1 DSM 23881 и L. gasseri MCC2 DSM 23882, были изолированы из фекалий здорового ребенка во время эстонско-шведского сравнительного исследования микрофлоры у детей. Штамм L. plantarum MCC1 и штамм L. gasseri MCC2 были изолированы путем посева нескольких растворов фекалий ребенка в возрасте 1 года (10^-2-10^-7 в фосфатном буфере с 0,04% тиогликолевой кислотой, pH 7,2). Растворы были посеяны на свежеприготовленную культуральную среду агара MRS (Oxoid, Великобритания) и культивированы при 37°C в микроаэробной среде. Штаммы, которые являются объектами настоящего изобретения, были изолированы на основе колонии и морфологии клеток, характерной для Lactobacillus ssp. Затем была выполнена предварительная идентификация, а после этого и более точная идентификация, описанная ниже.

L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 были депонированы в коллекции культур Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH под номерами DSM 23881 и DSM 23882, соответственно, 5 августа 2010 г.

Культурально-морфологические характеристики

Культурально-морфологические характеристики определяли после культивации в средах агара MRS и бульона (Oxoid).

Для культивирования L. plantarum MCC1 в течение 24-48 часов в микроаэробной среде подходил бульон MRS, после чего в бульоне наблюдался равномерно плотный рост. После культивирования в течение 48 часов в культуральной среде агара MRS при 37°C в микроаэробной среде колонии L. plantarum MCC1 имели диаметр 2-2,5 мм, белый цвет, были выпуклыми, блестящими и с правильными границами. Клетки представляют собой короткие палочки в цепочке с частично параллельным расположением. Оптимальная температура роста клеток составляет 37°C; штамм также размножается при 15°C и 45°C. pH оптимальной среды роста клеток составляет 6,5. L. plantarum MCC1 является каталазотрицательной и оксидазотрицательной, при необходимости гетероферментативной, не гидролизует аргинин и не вырабатывает газ во время ферментации глюкозы.

L. plantarum MCC1 идентифицировали на основании тест-набора API 50CHL System (bioMérieux, Франция) в качестве L. plantarum (совпадение с типовым штаммом: отличное, ID %-99,9, Т-индекс 0,83).

Молекулярная идентификация L. plantarum MCC1 на основании последовательности 16S рРНК показала гомологичность с типовым штаммом L. plantarum Lp-01 (BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/sequence-analysis/).

Характеристика ферментации углеводов L. plantarum MCC1 на основании API CHL 50 была следующей. Ферменты штамма: рибоза, галактоза, D-глюкоза, D-фруктоза, D-манноза, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиоза, мальтоза, лактоза, сахароза, трегалоза, мелецитоза, D-рафиноза, L-арабиноза, метил-αD-маннопиранозид, D-тураноза, мелибиоза, сорбит и манит.

Согласно показаниям тест-набора API ZYM (bioMerieux, Франция) L. plantarum MCC1 характеризуется активностью лейцинариламидазы, валинариламидазы, α-глюкозидазы, β-глюкозидазы.

Для культивирования L. gasseri MCC2 в течение 24-48 часов в анаэробной среде подходил бульон MRS, после чего в бульоне наблюдался равномерно плотный рост. После культивирования в течение 48 часов в культуральной среде агара MRS при 37°C в анаэробной среде (CO₂/H₂/N₂:5/5/90) колонии L. gasseri MCC2 имели диаметр 1,5-2 мм, беловатый цвет, были неровными и с неправильными краями. Клетки представляют собой палочки от коротких до кокковидных, со средней толщиной. Оптимальная температура роста клеток составляет 37°C; штамм также размножается при 45°C. pH оптимальной среды роста клеток составляет 6,5. L. gasseri MCC2 является каталазотрицательной и оксидазотрицательной, обязательно гомоферментативной (OHOL), не гидролизует аргинин и не вырабатывает газ при ферментации глюкозы.

L. gasseri MCC2 идентифицировали на основании тест-набора API 50CHL System (bioMérieux, Франция) в качестве L. delbrueckii ssp. delbrueckii (совпадение с типовым штаммом: хорошее, ID %-94,6, Т-индекс 0,35). Молекулярная идентификация L. gasseri MCC2 на основании последовательности 16S рРНК показала гомологичность с типовым штаммом L. gasseri IDCC 3102 (BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/sequence-analysis/).

Характеристика ферментации углеводов L. gasseri MCC2 на основании API CHL 50 была следующей. Ферменты штамма: лактоза, сахароза, трегалоза и эскулин.

Согласно показаниям тест-набора API ZYM (bioMérieux, Франция) L. gasseri MCC2 характеризуется активностью лейцинариламидазы, валинариламидазы, α-глюкозидазы и β-глюкозидазы.

Безопасность

Происхождение штаммов микробов из пищеварительного тракта здорового ребенка подтверждает их статус GRAS (общепризнанно безопасный), или штаммы микробов безопасны для человека и подходят для перорального введения. Виды лактобактерий L. plantarum и L. gasseri были внесены EFSA в перечень таксономических единиц со статусом QPS (квалифицированная презумпция безопасности) (EFSA. Introduction of a Qualified Presumption of Safety (QPS) approach for assessment of selected microorganisms referred to EFSA. EFSA J 2007; 587, 1-16).

Гемолитическая активность

Методика: Гемолитическую активность L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 определяли после инкубации в микроаэробной среде на планшетах с кровяным агаром (Blood Agar Base №2, Oxoid +7% человеческой или лошадиной крови).

Результат. Штаммы L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 не проявили гемолитической активности.

Устойчивость к антибиотикам

Методика: Восприимчивость L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 к антибиотикам испытывали с помощью Е-теста (АВ Biodisk, Сольна). Минимальную ингибирующую концентрацию определяли в соответствии с эпидемиологическими контрольными значениями, рекомендованными Европейской комиссией.

Таблица 1
Восприимчивость L. plantarum MCC1 DSM 23881 и L. gasseri MCC2 DSM 23882 (МПК, мг/Л) к антибактериальным средствам
	Значения МПК* (мкг/мЛ)
Антибиотик	L. plantarum MCC1	L. gasseri MCC2	Lactobacillus spp**	L. plantarum#	OHOL#
Ампициллин	0,094	0,031	2	2	1
Гентамицин	1,5	2	1	16	16
Стрептомицин	16	н/д	16	н/т**	16
Эритромицин	0,125	0,047	4	1	1
Клиндамицин	0,064	н/д	н/т	1	1
Тетрациклин	2	0,5	16	32	4
Хлорамфеникол	1,5	0,75	16	8	4
Хинупристин/ дальфопристин	1	н/д	4	4	4
Цефокситин	256	1,5	4	н/т	н/т
Цефуроксим	0,5	0,19	-	н/т	н/т
Имипенем	н/д	0,047	-	н/т	н/т
Ципрофлоксацин	0,38	>32	4	н/т	н/т
Рифампин	н/д	0,064	32	н/т	н/т
Трим/сульфам	н/д	>32	32	н/т	н/т
Ванкомицин	256	0,75	4	н/т	2
*МПК - минимальная подавляющая концентрация, контрольное значение для устойчивости, OHOL - обязательно гомоферметнативные лактобактерии, н/т - не требуется*
** European Commission (EC), 2002. Opinion of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the criteria for assessing the safety of microorganisms resistant to antibiotics of human clinical and veterinary importance. European Commission, Health and Consumer Protection Directorate General, Directorate C, Scientific Opinions, Брюссель, Бельгия, http://ec.europa.eu/food/fs/ec/scan/out64 en.pdf
# FEEDAP Panel EFSA Technical guidance prepared by the Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP) on the update of the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance. The EFSA Journal (2008) 732, 1-15

Было показано, что L. plantarum MCC1 является устойчивой к цефокситину и ванкомицину в соответствии с показателями, установленными для лактобактерий Европейской комиссией (ЕС, 2002. Opinion of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the criteria for assessing the safety of micro-organisms resistant to antibiotics of human clinical and veterinary importance. European Commission, Health and Consumer Protection Directorate General, Directorate C, Scientific Opinions, Brussels, Belgium. http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scan/out64 en.pdf).

Известно, что несколько видов/штаммов лактобактерий обладают естественной устойчивостью к упомянутым антибиотикам, и таким образом при применении этого микроорганизма не ожидается горизонтальная передача генов, обуславливающих устойчивость к антибиотикам. Устойчивость к другим исследованным антибиотикам не проявлялась.

Штамм L. gasseri MCC2 не обладал устойчивостью к испытанным антибиотикам.

Функциональные свойства L. plantarum МСС1 и L. gasseri MCC2

Характеристика метаболитов

Методика: Характеристику метаболитов устанавливали путем газовой хроматографии (HP 6890) после 24 ч и 48 ч инкубации в микроаэробной среде роста (Таблица 2). Лактобактерий выращивали в течение 48 часов в культуральной среде агара MRS в атмосфере с 10% CO₂, затем готовили суспензию в 0,9% растворе NaCl с плотностью 10⁹ микроорганизмов/мЛ по МакФарланду (McFarland), и 1,0 мЛ полученной суспензии высевали в 9,0 мЛ жидкой культуральной среды MRS. Определяли количество метаболитов в ммоль/Л с использованием капиллярной колонки HP-INNOWax (15 м × 0,25 мм; 0,15 мкм). Температурная программа колонки 60°C 1 мин, 20°C/мин 120°C 10 мин; детектор (FID) 350°C.

Таблица 2
Концентрация уксусной кислоты, молочной кислоты и янтарной кислоты (ммоль/Л) в культуральной среде MRS после 24 ч и 48 ч культивирования в микроаэробной среде L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 в культуральной среде MRS
Вид	Уксусная кислота (ммоль/Л)	Молочная кислота (ммоль/Л)	Янтарная кислота (ммоль/Л)
24 ч	48 ч	24 ч	48 ч	24 ч	48 ч
L. plantarum MCC1	0,9	1,3	100, 0	137,2	0,4	0,5
L. gasseri MCC2	0,7	0,7	39,7	48,4	0,3	0,4

Определение агрегации L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 и способности к свертыванию молока

Методика: Способность к свертыванию молока. Способность к свертыванию молока исследовали после инкубации штаммов в течение 48 ч в микроаэробных условиях в обезжиренном молоке UHT при температуре в 37°C. Способность к свертыванию оценивали в соответствии со следующей схемой:

1. Сильная (+) - молоко сворачивается в течение 24 часов,

2. Медленная (+/-) - молоко сворачивается в течение 48 часов,

3. Отсутствует (-) молоко не сворачивается.

Самоагрегация. Для оценки способности к самоагрегации штаммы, перед этим прокультивированные в течение 24 ч в культуральной среде агара MRS, суспендировали в физиологическом растворе. Полученную суспензию в течение 15 минут сохраняли при комнатной температуре. Способность к агрегации оценивали в соответствии со следующей схемой: 0 - отсутствует, суспензия равномерно плотная; 1 - некоторое количество хлопьев в растворе; 2 - большое количество хлопьев в суспензии, легкий осадок на дне тестовой пробирки; 3 - интенсивная, суспензия не развивается, осадок на дне, раствор почти прозрачный.

L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 свертывали молоко в течение 24 часов, имели сильные свойства самоагрегации (Таблица 3).

Таблица 3
Агрегация, общий протеолиз и способность штаммов к свертыванию молока
Штамм	Самоагрегация	Свертывание молока
L. plantarum MCC1	3	+
L. gasseri MCC2	3	+

Способность пребиотиков к ферментации

Для оценки ферментации тагатозы (Arla Food Ingredients), рафтилозы Р95 (Beneo Orafti), рафтилозы Synergy 1 (Beneo Orafti) и рафтилозы L60/75 (Orafti) 0,05 мЛ 48-часовой испытываемой культуры Lactobacillus sp. высевали в культуральную среду MRS, которая содержала 0,5% сорбита, тагатозы или мелецитозы вместо глюкозы. В качестве индикатора в культуральную среду добавляли хлорофеноловый красный (0,004%). Ферментацию оценивали на основании изменения цвета (с красного на желтый) после 48 ч.

Таблица 4
Способность к использованию пребиотиков L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2
	L. plantarum MCC1	L. gasseri MCC2
Тагатоза	-	+
L60/75	+	+
Рафтилоза Synergy 1	+	-
Рафтилоза Р95	+	+

Противомикробная активность против патогенов

Методика: Для оценки противомикробных свойств использовали способ окрашенной струи (Hütt P, Shchepetova J, Loivukene K, Kullisaar Т, Mikelsaar M. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entro- and uropathogens. J Appl Microbiol. 2006; 100 (6): 1324-32).

Для определения ингибирования патогенов измеряли зону отсутствия роста в мм. Аналогично методу Hütt et al (2006) вычисляли арифметическое среднее и стандартное отклонение на основании результатов для используемого образца, и оценивали антагонистическую активность штаммов (мм) во время инкубации при 37°C следующим образом: - слабая <9,7; средняя 9,7-12,2; сильная >12,2. Все пробы повторяли параллельно по меньшей мере три раза.

Таблица 5
Противомикробная активность L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 против патогенов способом окрашенной струи при культивировании в анаэробной и микроаэробной средах (ингибирование роста патогенов, мм)
Патоген	L. plantarum MCC1	L. gasseri MCC2
Анаэробная	Микроаэробная	Анаэробная	Микроаэробная
Shigella sonnei	20,3±2,3	20,3±2,1	9,5±2,9	7,7±1,5
Staphylococcus aureus	15,7±2,9	15,0±1,0	3±3,2	2,3±2,5
Escherichia coli	17,3±2,5	18,0±1,0	6,3±3,4	6,3±1,2
Enterococcus faecalis	16,7±2,1	14,7±2,7	4.5±2,9	2,0±1,0
Salmonella enterica serovar Typhimurium	18,8±2,1	17,8±1,8	7,15±1,6	4,3±2,1
S. enteritidis	н/о	7,1±2,8	н/о	2,2±2,6
Listeria monocytogenes	н/о	12,8±1,7	н/о	2,8±1,0
Yersinia enterocolitica	н/о	12,8±1,0	н/о	3,5±2,6
Слабая <9,7; средняя 9,7-12,2; сильная >12,2; н/о - не определено

Противомикробная активность L. plantarum MCC1 в пробе способом окрашенной струи (умерщвленные клетки и эффект их экскретированных метаболитов) была сильной по отношению к большинству испытанных патогенов (кроме L. monocytogenes и S. enteritidis) в обеих средах.

L. gasseri MCC2 оказалась слабым антагонистом в обеих средах.

Общие протеолитические свойства

Общие протеолитические свойства L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 изучали на культуральной среде SMA (среда с обезжиренным молоком и агаром) и на Ca-казеинатном агаре, с посевом штрихом на испытательные культуральные среды штаммов, предварительно выращенных в течение 48 ч в бульоне MRS. Их инкубировали в течение 7 дней в микроаэробной среде при 37°C. Интенсивность протеолиза оценивали (6 проб, арифметическое среднее значение) на основании системы оценок: 4 - сильный, 3 - средний, 2 - слабый, 1 - очень слабый, 0 - отсутствует.

Результаты: L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 обладают достаточно хорошим протеолитическим эффектом (в 4-балльной системе у L. plantarum MCC1 было три балла, а у L. gasseri MCC2 - два балла).

Биоселекция на основании более специфичной способности к протеолизу (масс-спектрометрические исследования и исследования по технологии ВЭЖХ-ОФ для определения уровня протеолиза α-S1-казеина и β-казеина)

В отношении L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 не было известно, как они гидролизуют различные молочные белки. Поэтому сначала были уточнены изменения в спектрах молекулярных масс, получаемые при гидролизе, с использованием отдельных чистых молочных белков (β-лактоглобулина, α-S1-казеина, β-казеина) для последующего анализа изменений спектра белков необезжиренного молока. Молекулярные массы продуктов гидролиза молочных белков определяли на масс-спектрометре MALDI-TOF (матричном лазерном десорбционном ионизационном времяпролетном масс-спектрометре) (Marsilio, R. Catinella, S. Seraglia R. Traldi P. (1995) Matrix-assisted Laser-Desorption lonization Mass-Spectrometry for the Rapid Evaluation of Thermal-Damage in Milk. Rapid. Communications In Mass Spectrometry, 9, 550-552). Суспензию плотностью 10⁹ КОЕ/мЛ по стандарту МакФарланда 4 приготовили из культур, помещенных в физиологический раствор KCl. 10 мкл молочной белковой фракции добавили в полученную суспензию. Выживаемость штаммов в растворах этих фракций определяли путем посева штрихом растворенных серий до и после испытания. Штаммы инкубировали в соответствующей среде белковой фракции в течение 2-6 дней при 37°C. Затем образцы центрифугировали и определяли характеристику белков на масс-спектрометре (Voyager DE Pro, Applied Biosystems) Фиг.1 и Фиг.2). Было установлено, что штаммы, которые являются объектами настоящего изобретения, способны адаптировать обмен веществ к среде, бедной питательными веществами. Например, в испытании единственным источником питательных веществ был либо α-S1-казеин, β-лактоглобулин, β-казеин, либо вещества, полученные из самих клеток штамма. Штаммы обнаруживались по окончании испытания во всех трех средах с белковыми фракциями (α-S1-казеином, β-лактоглобулином, β-казеином).

Затем протеолитические свойства штаммов исследовали в доступном на рынке молоке с содержанием жира 2,5% с помощью способа ВЭЖХ-ОФ {высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе). Уровень протеолиза α-S1-казеина и β-казеина измеряли на 2-й и 4-й день инкубации (Фиг.3). Для этого область пика хроматограммы ВЭЖХ-ОФ, соответствующую исследуемому молочному белку, сравнивали с начальным моментом (контроль, т.е. молоко до внесения лактобактерий, приравнивали к 100%) и вычисляли количество оставшегося молочного белка в процентах. Кроме того, проводили эксперименты с временем инкубации более 21 дня. Также исследовали сочетания штаммов, которые являются объектами настоящего изобретения, для повышения эффективности протеолиза и протеолитической активности также с молочной сывороткой (для уменьшения количества аллергенных казеинов) в случае с предварительно разведенным молоком. Приготовление образцов молока для анализа ВЭЖХ-ОФ и условия хроматографирования разрабатывали в соответствии с методическими указаниями, описанными в работе Bobe et al. (Bobe G, Beitz DC, Freeman AE, Lindberg GL. (1998) Separation and Quantification of Bovine Milk Proteins By reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography. J. Agric. Food Chem., 46, 458-463). Доступное на рынке молоко с содержанием жиров 2,5%, в которое добавляли 10⁷ КОЕ/мЛ исследуемых штаммов и инкубировали их при 37°C, сравнивали с молоком без штаммов. Для разделения молочных белков использовали высокоэффективный жидкостный хроматограф (ВЭЖХ) (Hewlett Packard 1100) и колонку с обращенной фазой Zorbax 300SB-C18, заполненную пористым силикагелем. Подвижная фаза представляла собой элюирующую систему с изменяющимся градиентом, состоящую из: раствора А - ацетонитрил, вода, трифторуксусная кислота (TFA) в соотношении 900:100:1 (об/об/об); раствор В - ацетонитрил, вода, TFA в соотношении 100:900:1 (об/об/об). Градиент начинался с раствора В и пропорция раствора А начинала возрастать непосредственно после введения образца в систему. Во время фазы разделения, когда происходило разделение молочных белков, содержание раствора А возрастало на 0,47% в минуту. Полученные фракции идентифицировали путем сравнения времени удерживания со значениями времени удерживания согласно стандартам для основных молочных белков и определения молекулярной массы посредством масс-спектрометра MALDI-TOF. Молочные белки элюируют в следующей последовательности: κ-CN, α_S2-CN, α_S1-CN, β-CN, α-LA и β-LG. L. plantarum MCC1 и L. gasseri МСС2 оказывали надлежащие эффекты в отношении α-S1-казеина и β-казеина (см. итоговые данные на Фиг.1 и Фиг.2), причем количество белков, доминирующих при аллергической реакции на коровье молоко у детей, α-S1-казеина и β-казеина, уменьшилось на 2-й день. На основании анализа ВЭЖХ-ОФ лучшим средством направленного частичного протеолиза оказалась L. gasseri MCC2 (Фиг.3). При объединении вышеупомянутых лактобактерий протеолитический эффект в молоке был несколько снижен по сравнению с использованием тех же штаммов по отдельности. L. plantarum MCC1 также инкубировали в течение 4 дней в смеси, состоящей из 40% молока и 60% молочной сыворотки: содержание α-казеина на четвертый день составило 81%, а содержание β-казеина составило 83% по сравнению с начальным моментом.

Поставленная задача была решена: штаммы L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 и их сочетание уменьшали количество α-S1-казеина и/или β-казеина на 20-40% (т.е. происходил умеренный направленный гидролиз).

L. plantarum MCC1 и L. gasseri MCC2 гидролизуют белки, вызывающие аллергию на молоко, и они обладают хорошей общей протеолитической активностью. Их использование по отдельности или совместно снижает аллергенность молока и таким образом они могут быть использованы при приготовлении пищевого продукта, уменьшающего аллергию на молоко, и пищевой добавки с полезными для здоровья свойствами.

Биоселекция на основании выработки конъюгированной линолевой кислоты (КЛК)

КЛК означает группу изомеров жирной кислоты, линолевой кислоты (ЛК, cis-9, cis-12-18:2) с 18 атомами углерода, в которых двойные связи являются конъюгированными. КЛК образуется естественным путем при процессах биогидрогенации и окисления. Предполагается, что КЛК имеет антиадипогенный, антиканцерогенный, антидиабетогенный и противовоспалительный эффект, а также регулирующий эффект на иммунную систему, участвует в выработке цитокинов и иммуноглобулинов и обладает способностью модулировать экспрессию определенных генов непосредственно или опосредованно через конкретные транскрипционные факторы (Wahle, K. W. J., Heys, S.D. и Rotondo, D (2004). Conjugated linoleic acids: are they beneficial or detrimental to health? Prog. Lipid Res. 43: 553-587). Поскольку несколько видов молочнокислых бактерий способны преобразовывать линолевую кислоту в конъюгированную линолевую кислоту, то предполагается, что возможно повысить содержание КЛК в ферментированных молочных продуктах (Sieber, R., Collomb, M., Aeschlimann, A., Jelen, Р. и Eyer, H. (2004). Impact of microbial cultures on CLA in dairy products- a review. Int. Dairy J. 14: 1-15). Для этого следует проверить, какие молочнокислые бактерии являются производителями КЛК. Известно, что свободные жирные кислоты, присутствующие в средах роста микроорганизмов, обладают бактериостатическим эффектом, влияющим на рост микроорганизмов и проницаемость клеточной мембраны. Интенсивность эффекта зависит от жирной кислоты. Жирные кислоты с длинной цепочкой с более высоким уровнем насыщенности обладают более сильным противомикробным эффектом. Стереохимия двойных связей также влияет на противомикробную активность: жирная кислота с cis-конфигурацией является более сильным ингибитором, чем trans-форма (Kankaanpää, Р.Е., Salminen, S.J., Isolauri, E., Lee, Y. K. (2001). The influence of polyunsaturated fatty acids on probiotic growth and adhesion. FEMS Microbiol. Lett. 194: 149-153). Микроорганизмы обладают установленным защитным механизмом для противодействия веществу, ингибирующему его жизненные функции: полиненасыщенные кислоты изомеризуются в менее ингибирующие варианты, например линолевая кислота (ЛК) с более сильным бактериостатическим эффектом преобразуется в КЛК (Sieber, R., Collomb, M., Aeschlimann, A., Jelen, Р. и Eyer, Н. (2004). Impact of microbial cultures on conjugated linoleic acid in dairy products- a review. Int. Dairy J. 14: 1-15). Большинство образующейся КЛК остается в среде; одна часть добавляется к липидам клеточной мембраны. Было обнаружено, что КЛК может в небольших количествах находиться в клетке микроорганизма. Способность конъюгировать ЛК и другие жирные кислоты (олеиновую кислоту, рицинолевую кислоту) обнаружена у представителей нескольких видов микроорганизмов, включая Lactobacillus sp. Способность штаммов вырабатывать КЛК на основании линолевой кислоты, добавляемой в среду роста (MRS, обезжиренное молоко) количественно оценивали с использованием способа определения КЛК, разработанного нами. Стало ясно, что L. plantarum МСС1 и L. gasseri MCC2, которые обладали необходимым направленным протеолитическим эффектом, в значительной мере вырабатывали КЛК (Таблица 7). В то же время, эти штаммы не были практически подвержены бактериостатическому эффекту ЛК.

Биоселекция на основании устойчивости к окислению (антиоксидантности)

Были проведены исследования для определения того, обладают ли штаммы L. plantarum МСС1 и L. gasseri MCC2, имеющие конкретные свойства ограниченного протеолиза, а также способность вырабатывать КЛК, физиологически значимой устойчивостью к окислению. Устойчивость к окислению следует определять с использованием по меньшей мере двух способов.

Тест с линолевой кислотой (ЛК-тест), который позволяет определить способность клеточных суспензий лактобактерий ингибировать пероксидацию линолевой кислоты, использовали в качестве первого способа.

Доступный на рынке тест (общий антиоксидантный с