Функциональное улучшение микроорганизмов для минимизации продукции акриламида

Функциональное улучшение микроорганизмов для минимизации продукции акриламида

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

По настоящей заявке по пункту 35 U.S.C. 119 испрашивается приоритет соответствующих Предварительных Патентных заявок США No. 61/309623 и 61/316634, поданных 2 марта 2010 г. и 23 марта 2010 г., соответственно, полное содержание которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Область изобретения

Описание относится к продуктам и способам для уменьшения концентрации акриламида в пище, так же как к пищевым продуктам, обладающим сниженным содержанием акриламида. В частности, описание относится к микроорганизмам, генетически модифицированным для их способности уменьшать количество акриламида.

Предпосылки изобретения

Акриламид представляет собой кристаллическое твердое вещество без цвета и без запаха, которое является важным промышленным мономером, общеупотребительным в качестве связующего для цемента и для синтеза полимеров и гелей. На основании различных исследований in vivo и in vitro получено убедительное доказательство канцерогенных и генотоксических эффектов акриламида и его метаболита глицидамида (Wilson et al., 2006; Rice, 2005). Акриламид оценен Международным агентством онкологических исследований (IARC) в 1994 г. и классифицирован как «возможно канцерогенный для человека» на основании положительных биологических исследований на мышах и крысах, что поддерживается доказательством того, что акриламид подвергается биологической трансформации в тканях млекопитающих до генотоксического метаболита глицидамида (IARC, 1994). Известно, что биологическая трансформация акриламида в глицидамид эффективно происходит в тканях как человека, так и грызунов (Rice, 2005). В дополнение к классификации IARC, как «The Scientific Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment» Европейского Союза, так и независимый «Committee on Carcinogenicity of Chemicals in Food, Consumer Products and the Environment» в Великобритании, советуют контролировать воздействие акриламида на людей на уровне, настолько низком, насколько возможно, из-за его по существу токсичных свойств, включающих нейротоксичность и генотоксичность как для соматических, так и для зародышевых клеток, канцерогенность и репродуктивную токсичность.

Что касается эпидемиологических исследований на человеке воздействия акриламида, поступающего с пищей, не существует доказательств какого-либо канцерогенного эффекта этого химического вещества; однако известно также, что эти эпидемиологические исследования акриламида могут не являться достаточно чувствительными для выявления потенциальных опухолей у человека после воздействия акриламида (Rice, 2005; Wilson et al., 2006).

В 2002 г. Шведская Национальная Пищевая Организация опубликовала подробное описание концентраций акриламида, обнаруженного в общепринятых пищевых продуктах, особенно подвергнутых тепловой обработке богатых углеводами пищевых продуктах, таких как картофель фри и картофельные чипсы. В настоящее время этот список расширен с включением пищевых продуктов на основе зерна, пищевых продуктов на основе овощей, пищевых продуктов на основе бобовых, напитков, таких как кофе или заменители кофе; в таблице 1 показаны данные FDA по концентрациям акриламида в различных пищевых продуктов.

В настоящее время установлено, что акриламид образуется в ходе приготовления пищевых продуктов в первую очередь посредством реакции Майларда между аминокислотой аспарагином и восстанавливающими сахарами, такими как глюкоза, где аспарагин является лимитирующим предшественником (Amrein et al., 2004; Becalski et al., 2003; Mustafa et al., 2005; Surdyk et al., 2004; Yaylayan et al., 2003).

Существовал также ряд попыток уменьшения содержания акриламида в пищевых продуктах, включая добавление коммерческих препаратов фермента аспарагиназы (Acrylaway®, Novozymes, Denmark и PreventASe, DSM, Netherlands), продолжительную ферментацию дрожжей в течение 6 часов (Fredriksson et al., 2004), применение глицина в тесте до брожения (Brathen et al., 2005; Fink et al., 2006), погружение картофеля в хлорид кальция перед обжариванием во фритюре (Gokmen and Senyuva, 2007), замену восстанавливающих сахаров сахарозой (Amrein et al., 2004), общую оптимизацию условий переработки, таких как температура, pH и влагосодержание (Claus et al., 2007; Gokmen et al., 2007) и исследования, касающиеся различного выбора сырья (Claus et al., 2006). Все из этих перечисленных способов являются до некоторой степени неадекватными или им присущи ограничения, делающие их непрактичными во время изготовления пищевых продуктов, включая стоимость, эффект на органолептические свойства пищевых продуктов и/или неэффективное снижение количества акриламида в условиях переработки пищевых продуктов.

Подобно многим микроорганизмам, Saccharomyces cerevisiae способны естественным образом потреблять/деградировать предшественники акриламида аспарагин и восстанавливающие сахара. Это может являться причиной наблюдаемого снижения количества содержания акриламида в хлебе после продолжительного времени брожения в течение 6 часов (Fredriksson et al., 2004). Однако такое продолжительное время брожения для эффективного снижения количества акриламида является непрактичным для современных способов переработки пищевых продуктов.

В S. cerevisiae генами, ответственными за аспарагин, являются ASP1 и ASP3, кодирующие аспарагиназу цитозоля и аспарагиназу клеточной стенки, соответственно. Существуют также по меньшей мере 41 ген в S. cerevisiae, аннотированные термином «транспорт аминокислот», и известно, что шесть из этих транспортеров способны транспортировать аспарагин в клетку [«Saccharomyces Genome Database» http://www.yeastgenome.org/ (10/01/09)]. Названия генов для этих шести транспортеров аспарагина в S. cerevisiae представляют собой GAP1, AGP1, GNP1, DIP5, AGP2 и AGP3. Хорошо известно также, что S. cerevisiae способны использовать широкое множество источников азота для роста и что в культурах на смешанных субстратах они последовательно выбирают от хороших до плохих источников азота (Cooper, 1982). Это последовательное использование контролируют молекулярные механизмы, состоящие из сенсорной системы и механизма регуляции транскрипции, известного как азотная катаболитная репрессия (NCR). Как правило, NCR относится к различиям экспрессии генов пермеаз и катаболических ферментов, необходимых для деградации источников азота. Экспрессию в путях катаболитов азота регулируют четыре регулятора, известные как Gln3p, Gat1p, Dal80p и Gzf3p, которые связываются с вышестоящей активирующей консенсусной последовательностью 5'-GATAA-3'. Gln3p и Gat1p положительно действуют на экспрессию генов, в то время как Dal80p и Gzf3p действуют отрицательно. В присутствии хорошего источника азота Gln3p и Gat1p фосфорилируются посредством TOR киназ Tor1p и Tor2p; затем образуют цитозольные комплексы с Ure2p и таким образом являются ингибированными против активации NCR-чувствительной транскрипции. В присутствии плохих источников азота или при азотном голодании Gln3p и Gat1p становятся дефосфорилированными, диссоциируют из Ure2p, накапливаются в ядре и активируют NCR-чувствительную транскрипцию.

Хорошо документировано также, что конкретная мутация URE2 приводит к доминантной мутации, обозначаемой [URE3]. [URE3] представляет собой прион дрожжей, образуемый посредством автокаталитического превращения Ure2p в инфекционные, устойчивые к протеазам амилоидные волокна (Wickner, 1994). Фенотипы клеток S. cerevisiae с отсутствием функционального Ure2p и инфицированных [URE3] клеток являются сходными, поскольку они больше не отвечают на NCR (Wickner, 1994; Wickner et al., 1995). Как указано выше, в ответ на хороший источник азота, Ure2p вовлекается в понижающую регуляцию активности Gln3p и Gat1p.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее описание относится к микроорганизму, трансформированному по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для уменьшения азотной катаболитной репрессии в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов. Настоящее описание относится также к микроорганизму, трансформированному по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для сверхэкспрессии гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов. Настоящее описание относится также к микроорганизму, трансформированному по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для снижения азотной катаболитной репрессии и/или для сверхэкспрессии гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов.

В одном варианте осуществления микроорганизм трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточную аспарагиназу, такую как связанная с клеточной стенкой аспарагиназа, Asp3p. В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей транспортер аминокислот, такой как транспортер аминокислоты аспарагина, например, Gap1p, Agp1p, Gnp1p, Dip5p, Agp2p и/или Agp3p.

В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей как Asp3p, так и Gap1p или как Asp3p, так и Gat1p. В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют первой и второй молекулой нуклеиновой кислоты, где первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует Asp3p, и вторая молекула нуклеиновой кислоты кодирует Gap1p или Gat1p.

В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, модифицирующей активность регуляторного фактора азотной катаболитной репрессии транспорта/деградации аспарагина, такого как Ure2p, Dal80p, Gzf3p, Gln3p, Gat1p, Tor1p и/или Tor2p. В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, модифицирующей активность обоих регуляторных факторов азотной катаболитной репрессии Gln3p и Ure2p. В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют первой и второй молекулой нуклеиновой кислоты, модифицирующей азотную катаболитную репрессию, где первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует Gln3p, и вторая молекула нуклеиновой кислоты модифицирует экспрессию Ure2p.

В одном варианте осуществления микроорганизм представляет собой гриб или бактерию. Гриб может представлять собой любой гриб, включая дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptotoccous neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolyitca или любые виды дрожжей, принадлежащих к царству грибов. Другие грибы, которые можно использовать, включают в себя, но без ограничения, виды из родов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus и Mucor. Бактерии могут представлять собой любые бактерии, включая Erwinia sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Bacillus sp., Pediococcus sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., и Leuconostoc sp. В одном варианте осуществления микроорганизм является неактивным, таким как неактивные дрожжи.

В одном варианте осуществления по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты является функционально связанной с констутивно активным промотором. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты является функционально связанной с промотором, не подверженным азотной катаболитной репрессии.

В настоящем документе представлен также способ снижения количества акриламида в пищевом продукте, включающий в себя добавление микроорганизма, описанного в настоящем документе, в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки; где микроорганизм снижает азотную катаболитную репрессию или сверхэкспрессирует ген, вовлеченный в транспорт и/или деградацию аспарагина в условиях приготовления или переработки; таким образом снижая количество акриламида в пищевом продукте.

Кроме того, в настоящем документе представлен способ снижения количества акриламида в пищевом продукте, включающий в себя (a) трансформацию микроорганизма по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для снижения азотной катаболитной репрессии или для сверхэкспрессии гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина; (b) добавление микроорганизма в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки; где микроорганизм снижает азотную катаболитную репрессию или сверхэкспрессирует ген, кодирующий внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или ген, кодирующий белок, вовлеченный в транспорт аспарагина, таким образом снижая количество акриламида в пищевом продукте.

В другом варианте осуществления представлен пищевой продукт, обладающий сниженной концентрацией акриламида, полученный с использованием трансформированного микроорганизма, описанного в настоящем документе. В другом варианте осуществления представлен пищевой продукт, обладающий сниженной концентрацией акриламида, полученный с использованием способа, описанного в настоящем документе.

В одном варианте осуществления пищевой продукт представляет собой пищевой продукт на основе зерна, включая, без ограничения, бисквиты, хлеб и крекеры, пищевой продукт на основе овощей включая, без ограничения, картофельные продукты, напиток, включая, без ограничения, кофе и заменители кофе, фруктовый, бобовый, молочный или мясной продукт.

Другие признаки и преимущества по настоящему описанию становятся очевидными из следующего подробного описания. Следует понимать, однако, что подробное описание и конкретные примеры, в то время как в них указаны предпочтительные варианты осуществления, приведены только для иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах содержания и объема изобретения очевидны специалистам в данной области из этого подробного описания.

Краткое описание фигур

Описание поясняется фигурами, на которых:

Фиг.1 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты ASP3 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус LEU2 или URA3 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.

Фиг.2 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты GAP1 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус URA3 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.

Фиг.3 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты AGP3 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус LEU2 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.

Фиг.4 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты AGP2 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус LEU2 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.

Фиг.5 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты GNP1 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус LEU2 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.

Фиг.6 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты AGP1 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус URA3 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.

Фиг.7 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты GAT1 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус LEU2 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.

Фиг.8 представляет собой схематическое представление интеграции самоклонирующейся кассеты ure2∆ в локус URE2 штаммов S. cerevisiae с использованием маркера kanMX и последующей утраты маркера посредством рекомбинации части фланкирующих последовательностей 5'URE2, действующих как прямые повторы. Полученная трансформация делетирует ген URE2 из генома.

На фиг.9 показана карта сконструированной плазмиды pAC1, использованной в клонируемых генетических кассетах для интеграции в локус LEU2.

На фиг.10 показаны карты сконструированной плазмиды pAC2, использованной в клонируемых генетических кассетах для интеграции в локус URA3.

На фиг.11 показано потребление аспарагина в хлебном тесте с использованием коммерческих хлебных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией гена ASP1 или ASP3.

На фиг.12 показаны концентрации акриламида в образце хлебного теста, взятого во временной точке 5 час из эксперимента, изображенного на фиг.11.

На фиг.13 показано потребление аспарагина в хлебном тесте с использованием коммерческих хлебопекарных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией ASP3 или GAP1 и комбинации ASP3/GAP1.

На фиг.14 показано потребление аспарагина в хлебном тесте с использованием лабораторных (LY) с нокаутом гена DAL80 или URE2.

На фиг.15 показаны концентрации акриламида в образце хлебного теста, взятого во временной точке 5 час из эксперимента, изображенного на фиг.14.

На фиг.16 показано потребление аспарагина в комплексной среде с использованием коммерческих хлебопекарных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией AGP2 или AGP3 после 5 часов роста.

На фиг.17 показано потребление аспарагина в синтетической среде, содержащей аспарагин и аммиак, с использованием коммерческих хлебопекарных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией GAT1 или ASP3 и комбинации GAT1/ASP3.

На фиг.18 показано потребление аспарагина в синтетической среде, содержащей аспарагин и аммиак, с использованием коммерческих хлебопекарных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией GNP1.

На фиг.19 показано потребление аспарагина в синтетической среде, содержащей аспарагин и аммиак, с использованием лабораторных дрожжей (LY) со сверхэкспрессией ASP3 или делецией TOR1 и с комбинацией tor1∆/ASP3.

На фиг.20 показано потребление аспарагина в синтетической среде, содержащей аспарагин, с использованием коммерческих хлебопекарных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией AGP1 и лабораторных дрожжей (LY) с нокаутом GZF3 после 5 часов роста.

Подробное описание

Авторы настоящего изобретения получили штаммы дрожжей, обладающие увеличенной способностью к потреблению и/или деградации аспарагина, который является лимитирующим предшественником, получаемым в ходе переработки или приготовления пищевого продукта, который приводит к продукции акриламида.

Микроорганизмы

В одном варианте осуществления представлен микроорганизм, трансформированный по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для снижения азотной катаболитной репрессии и/или для сверхэкспрессии гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина, в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов.

В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют по меньшей мере двумя, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или более молекулами нуклеиновой кислоты.

Фраза «сверхэкспрессия гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина», как применяют в настоящем документе, относится к увеличенной экспрессии мРНК или белков, которые транспортируются к мембране клетки или секретируются к клеточной стенке и которые вовлечены в транспорт и/или деградацию аминокислоты аспарагина по сравнению с контролем, не трансформированным молекулой нуклеиновой кислоты.

Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой любую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, вовлеченный, напрямую или опосредованно, в транспорт аспарагина, и/или внеклеточный белок, вовлеченный напрямую или опосредованно в деградацию аспарагина. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аспарагиназу клеточной стенки или ее фрагмент, обладающий активностью деградации аспарагина. Внеклеточные аспарагиназы представляют собой ферменты, известные в данной области, и включают в себя, без ограничения, внеклеточные аспарагиназы, такие как аспарагиназы клеточной стенки из любого источника, способные превращать аспарагин в аспартат, такого как дрожжи Asp3p, или их гомологи, и могут быть кодированы любыми генами аспарагиназы, кодирующие аспарагиназы клеточной стенки, включая, без ограничения, ASP3 или их гомологи. В одном варианте осуществления аспарагиназа клеточной стенки является кодированной молекулой нуклеиновой кислоты ASP3, как показано на SEQ ID NO:2 или ее гомолог или фрагмент, или содержит аминокислотную последовательность Asp3p, как показано на SEQ ID NO:1, или ее гомолог или фрагмент. Микроорганизмы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие внеклеточные аспарагиназы, способные деградировать аспарагин в условиях приготовления и переработки пищевых продуктов.

В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует транспортер аминокислот или его фрагмент, обладающий способностью транспортировать аспарагин в клетку. Транспортеры аминокислот известны в данной области и включают в себя, без ограничения, транспортеры аминокислот из любого источника, способные к активному транспорту аспарагина в микроорганизм, такой как дрожжи Gap1p, Agp1p, Gnp1p, Dip5p, Agp2p и Agp3p (NP_012965, NP_009905, NP_010796, NP_015058, NP_009690 и NP_116600), или их гомолог, и могут быть кодированы любым геном транспортера аминокислот, включая, без ограничения, GAP1, AGP1, GNP1, DIP5, AGP2 и AGP3 (SGD:S000001747, SGD:S000000530, SGD:S000002916, SGD:S000006186, SGD:S000000336 и SGD:S000001839) или их гомолог. Соответственно, в одном варианте осуществления транспортер аминокислот кодирован молекулой нуклеиновой кислоты GAP1, AGP3, AGP2, GNP1, AGP1 или DIP5, как показано на SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12 или 30 соответственно, или ее гомологом или фрагментом, или содержит аминокислотную последовательность Gap1p, Agp3p, Agp2p, Gnp1p, Agp1p или Dip5p, как показано на SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11 или 29 соответственно, или ее гомолог или фрагмент. Микроорганизмы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие транспортеры аминокислот, способны потреблять или поглощать аспарагин в условиях приготовления и переработки пищевых продуктов.

В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют нуклеиновой кислотой, кодирующей аспарагиназу клеточной стенки, и нуклеиновой кислотой, кодирующей транспортер аминокислот. В таком варианте осуществления микроорганизм является способным потреблять и деградировать аспарагин.

Фраза «снижать азотную катаболитную репрессию (NCR)» транспорта/деградации аспарагина, как применяют в настоящем документе, относится к действительному снижению репрессии генов для NCR-чувствительных генов или относится к увеличенной эндогенной экспрессии или гетерологичной экспрессии NCR-чувствительных генов. Например, молекула нуклеиновой кислоты для снижения NCR может представлять собой регуляторный фактор, который модифицирует выражение азотной катаболитной репрессии или может представлять собой сверхэкспрессию NCR-чувствительного гена.

В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты модифицирует активность регуляторного фактора азотной катаболитной репрессии. Регуляторные факторы для азотной катаболитной репрессии известны в данной области и включают в себя, без ограничения, регуляторные факторы из любого источника, такого как дрожжи Gat1p, Ure2p, Tor1p, Dal80p, Gzf3p, Tor2p, или Gln3p, как показано на SEQ ID NO:13, 15, 17, 19, 21, 33 или 31, или их гомолог или фрагмент, и могут быть кодированы любым геном, кодирующим регуляторный фактор, такой как GAT1, URE2, TOR1, DAL80, GZF3, TOR2, или GLN3, как показано на SEQ ID NO:14, 16, 18, 20, 22, 34 или 32. Например, можно получить микроорганизм, больше не обладающий функциональным отрицательным регулятором, таким как Ure2p, Tor1p, Tor2p Dal80p или Gzf3p. Этого можно достигать, например, посредством молекулы нуклеиновой кислоты, приводящей к делеции гена URE2, выделения и экспрессии мутантного фенотипа ure2, так что он больше не осуществляет понижающей регуляции активности Gln3p и Gat1p, посредством скрещивания штамма дикого типа со штаммом [URE3], или индукции фенотипа [URE3] любыми способами молекулярной биологии, включая цитодукию и сверхэкспрессию URE2. Последствия отсутствия у клеток функционального Ure2p приводят к тому, что чувствительные к NCR гены, такие как гены, вовлеченные в транспорт и утилизацию аспарагина (т.е. ASP3, AGP1, GAP1, GAT1, DAL80 и GZF3), больше не репрессированы в присутствии хорошего источника азота, такого как аммиак или глутамин. Соответственно, в одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит делеционную кассету URE2, TOR1, TOR2, DAL80 и/или GZF3. Микроорганизмы с отсутствием функционального Ure2p, Tor1p, Dal80p и/или Gzf3p способны потреблять и деградировать аспарагин в условиях приготовления и переработки пищевых продуктов. Альтернативно, этого можно достигать посредством молекулы нуклеиновой кислоты, приводящей к сверхэкспрессии функционального положительного регулятора, такого как Gat1p и/или Gln3p.

Термин «ген», как применяют в настоящем документе, находится в соответствии с его обычным определением, для обозначения функционально связанной группы последовательностей нуклеиновой кислоты. Модификация гена в контексте настоящего описания может включать в себя модификацию любой из различных последовательностей, функционально связанной с геном. Под «функционально связанными» понимают, что конкретные последовательности взаимодействуют напрямую или опосредованно для выполнения предназначенной им функции, такой как опосредование или модуляция экспрессии гена. Взаимодействие функционально связанных последовательностей может быть, например, опосредовано белками, которые, в свою очередь, взаимодействуют с последовательностями нуклеиновой кислоты.

Последовательности различных генов и нуклеиновых кислот по описанию могут представлять собой рекомбинантные последовательности. Термин «рекомбинантный», как применяют в настоящем документе, относится к чему-либо, что подвергали рекомбинации, так что по отношению к конструкции нуклеиновой кислоты термин относится к молекуле, содержащей последовательности нуклеиновой кислоты, соединенные вместе в некоторой точке или полученные способами молекулярной биологии. Термин «рекомбинантный» по отношению к белку или полипептиду обозначает молекулу белка или полипептида, которую экспрессируют с использованием рекомбинантной конструкции нуклеиновой кислоты, полученной способами молекулярной биологии. Термин «рекомбинантный» по отношению к генетической композиции относится к гамете или потомству, или клетке, или геному с новыми комбинациями аллелей, не встречающимися в природных родительских геномах. Рекомбинантные конструкции нуклеиновых кислот могут включать в себя нуклеотидную последовательность, лигированную, или подвергнутую манипуляциям для лигирования с последовательностью нуклеиновой кислоты, с которой она не лигирована в природе, или с которой она лигирована в природе в другой локализации. Обозначение конструкции нуклеиновой кислоты как «рекомбинантной» таким образом, обозначает, что с молекулой нуклеиновой кислоты манипулировали посредством вмешательства человека с использованием генной инженерии.

Молекулы нуклеиновой кислоты можно химически синтезировать с использованием таких способов, как описанные, например, в Itakura et al., Патент США No. 4598049; Caruthers et al., Патент США No. 4458066; и Itakura, Патенты США No. 4401796 и 4373071. Такие синтетический нуклеиновые кислоты по их природе являются «рекомбинантными», как этот термин применяют в настоящем документе (являясь продуктом последовательных стадий объединения составляющих частей молекулы).

Степень гомологии между последовательностями (такими как природные аминокислотные последовательности Asp3p, Gap1p, Dip5p, Gnp1p, Agp1p, Agp2p, Agp3p, Tor1p, Tor2p, Gat1p, Gln3p, Dal80p, Gzf3p или Ure2p, или природные последовательности нуклеиновой кислоты ASP3, GAP1, DIP5, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3, TOR1, TOR2, GAT1, GLN3, DAL80, GZF3 или URE2, и последовательность гомолога) можно выражать как процент идентичности, когда последовательности оптимально выровнены, подразумевая существование точных совпадений между последовательностями. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнений идентичности можно проводить с использованием множества алгоритмов, таких как алгоритм поиска локальных гомологий Смита и Уотермана, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, алгоритм выравнивания по гомологии Нидлемана и Вунша, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, способ поиска сходства по Пирсону и Липману, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, и компьютеризированные реализации этих алгоритмов (такие как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.). Выравнивание последовательностей можно проводить также с использованием алгоритма BLAST, описанного в Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (с использованием опубликованных параметров по умолчанию). Программное обеспечение для проведения анализа BLAST может быть доступно через Национальный центр биотехнологической информации (через Интернет на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Алгоритм BLAST включает в себя первичную идентификацию пар последовательностей с высокой степенью сходства (HSP) посредством идентификации коротких слов длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительно оцениваемому пороговому показателю T при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. T обозначает пороговую оценку сходства соседних слов. Первоначальное попадание в соседнее слово является источником для инициации поисков с целью найти более длинные HSP. Попадания в слова расширяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности, пока кумулятивная оценка выравнивания может увеличиваться. Расширение попадания в слова в каждом направлении прекращается, когда встречаются следующие параметры: кумулятивная оценка выравнивания уменьшается на количество Х от ее максимально достигнутого значения; кумулятивная оценка стремится к нулю или ниже из-за накопления одного или нескольких отрицательно оцениваемых выравниваний остатков; или достигнут конец какой-либо из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, T и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программы BLAST могут использовать по умолчанию длину слова (W), оценочную матрицу BLOSUM62 (Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) выравнивания (B) 50, ожидание (E) 10 (которое может меняться в альтернативных вариантах осуществления до 1 или 0,1 или 0,01 или 0,001 или 0,0001; хотя значения E, намного превышающие 0,1, могут не идентифицировать функционально сходные последовательности, полезно проверять попадания с более низкой значимостью, значениями E между 0,1 и 10 по коротким областям сходства), M=5, N=4, для сравнения обеих цепей нуклеиновых кислот. Для сравнения белков BLASTP можно использовать со следующими параметрами по умолчанию: G=11 (штраф за открытие пропуска); E=1 (штраф за расширение пропуска); E=10 (величина ожидания, в этом параметре предполагают ожидание того, что 10 попаданий с показателями, равными или лучшими, чем определенный показатель выравнивания, S, появляются случайно в базе данных того же размера, что и та, в которой ведется поиск; значение E можно увеличивать или уменьшать для изменения строгости поиска.); и W=3 (длина слова, по умолчанию 11 для BLASTN, 3 для других программ blast). Матрица BLOSUM определяет оценку вероятности для каждого положения при выравнивании, которая основана на частоте, с которой, как известно, эта замена встречается среди консенсусных блоков в пределах родственных белков. Матрицу замен BLOSUM62 (штраф за существование пропуска = 11; штраф за пропуск остатка = 1; соотношение лямбда = 0,85) используют по умолчанию в BLAST 2.0. Множество других матриц может быть использовано в качестве альтернативных для BLOSUM62, включая: PAM30 (9,1,0.87); PAM70 (10,1,0.87) BLOSU 80 (10,1,0.87); BLOSUM62 (1,1,0.82) и BLOSUM45 (14,2,0.87). Одним из измерений статистического сходства между двумя последовательностями с использованием алгоритма BLAST является наименьшая сумма вероятностей (P(N)), которая указывает на вероятность, с которой совпадение двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей может происходить случайно. В альтернативных вариантах осуществления нуклеотидные или аминокислотные последовательности считают по существу идентичными, если наименьшая сумма вероятностей при сравнении тестируемых последовательностей составляет менее приблизительно 1, менее приблизительно 0,1, менее приблизительно 0,01 или менее приблизительно 0,001. Сходство между последовательностями можно также выражать как процентную идентичность.

Последовательности нуклеиновой кислоты и белка, описанные в настоящем документе, могут в некоторых вариантах осуществления являться по существу идентичными, например, по существу идентичными аминокислотным последовательностям Asp3p, Gap1p, Gnp1p, Agp1p, Agp2p, Agp3p, Gat1p, Tor1p, Tor2p, Dip5p, Gln3p, Dal80p, Gzf3p или Ure2p, или последовательностям нуклеиновой кислоты ASP3, GAP1, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3, TOR1, TOR2, DIP5, GLN3, GAT1, DAL80, GZF3 или URE2. Значительная идентичность таких последовательностей может быть отражена в проценте идентичности при оптимальном выравнивании, который может составлять, например, более 50%, 80%-100%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, что в случае нацеливаемых на гены субстратов может относиться к идентичности части нацеливаемого на ген субстрата части последовательности-мишени, где степень идентичности может облегчать гомологичное спаривание и рекомбинацию и/или репарацию. Альтернативным указанием на то, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются, по существу, идентичными, является то, что эти две последовательности гибридизуются друг с другом в умеренно строгих или высоко строгих условиях. Гибридизацию со связанными с фильтром последовательностями в умеренно строгих условиях можно проводить, например, в 0,5M NaHPO₄, 7% додецилсульфате натрия (SDS), 1 мМ ЭДТА при 65°C, а отмывку в 0,2×SSC/0,1% SDS при 42°C (см. Ausubel, et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., и John Wiley & Sons, Inc., New York, p. 2.10.3). Альтернативно, гибридизацию со связанными с фильтром последовательностями в высоко строгих условиях можно проводить, например, в 0,5M NaHPO₄, 7% SDS, 1 мМ ЭДТА при 65°C, а отмывку в 0,1×SSC/0,1% SDS при 68°C (см. Ausubel, et al. (eds), 1989, выше). Условия гибридизации можно модифицировать в соответствии с известными способами в зависимости от интересующей последовательности (см. Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Часть I, Глава 2 «Обзор принципов гибридизации и стратегии анализов с использованием нуклеотидных зондов», Elsevier, New York). Как правило, выбирают строгие условия, которые приблизительно на 5°C ниже, чем точка плавления специфической последовательности при определенной ионной силе и pH. Отмывки для строгой гибридизации могут, например, составлять по меньшей мере 15 минут, 30 минут, 45 минут, 60 минут, 75 минут, 90 минут, 105 минут или 120 минут.

В данной области хорошо известно, что некоторые модификации и изменения можно вносить в структуру полипептида, такого как Asp3p, Gap1p, Gnp1p, Agp1p, Agp2p, Agp3p, Gatp, Tor1p, Tor2p, Dip5p, Gln3p, Dal80p, Gzf3p или Ure2p, без существенного изменения биологической функции этого пептида, для получения биологически эквивалентного полипептида. В одном аспекте белки, обладающие активностью транспорта аспарагина, могут включать в себя белки, отличающиеся от аминокислотных последовательностей природных Gap1p, Gnp1p, Dip5p, Agp1p, Agp2p, Agp3p или других транспортеров консервативными заменами аминокислот. Подобным образом, белки, обладающие активностью аспарагиназы, могут включать в себя белки, отличающиеся от последовательностей природного Asp3p, или других аспарагиназ клеточной стенки консервативными аминокислотными заменами. Как применяют в настоящем документе, термин «законсервированные или консервативные аминокислотные замены» обозначает замену одной аминокислоты на другую в заданном положении в белке, где замену можно осуществлять без существенной потери соответствующей фу