Изменение иммуногенности антигена путем введения эпитопов, узнаваемых nkt-клетками

Изменение иммуногенности антигена путем введения эпитопов, узнаваемых nkt-клетками

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к пептидам или полипептидам, способным рекрутировать и активировать NKT-клетки, и их использованию при лечении инфекций, вызванных внутриклеточными организмами, или опухолей и предотвращению заболеваний с помощью вакцинации.

Уровень техники

Хронические инфекционные заболевания, вызываемые внутриклеточными патогенами, трудно поддаются лечению, поскольку у инфицированных клеток уменьшается поверхностная экспрессия ряда молекул, которые в норме позволили бы иммунной системе специфически распознать упомянутые выше инфицированные клетки. Примерами являются микобактериальные инфекции, при которых инфицированные клетки ингибируют экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС), тем самым препятствуя узнаванию T-лимфоцитами линии дифференцировки CD8 (посредством узнавания MHC класса I) и лимфоцитами линии дифференцировки CD4 (посредством узнавания MHC класса II). В действительности множество бактерий и вирусов выработали способы, позволяющие избежать узнавания инфицированных клеток.

В некоторой степени аналогичные механизмы позволяют опухолям избежать обнаружения. Некоторые из таких опухолей, по меньшей мере, при воспалительных процессах экспрессируют детерминанты MHC класса II. Недавние эксперименты показали, что даже в случае повышенного CD8 узнавания пептидов, полученных из опухоли презентирующей MHC класса I, например, в результате вакцинации, общее воздействие на рост опухоли остается умеренным.

Как при хронической инфекции внутриклеточными патогенами, так и при опухолях существует острая необходимость разработки новых способов распознавания и уничтожения инфицированных или опухолевых клеток, соответственно.

Современной практикой является вакцинация против инфекционных заболеваний. Тем не менее, в значительном количестве случаев эффективность вакцинации ограничена преимущественной индукцией специфических антител к патогенам и отсутствием или недостаточной активацией иммунных клеток, которые должны распознавать инфицированные клетки. Таким образом, предотвращение вирусных и бактериальных заболеваний путем вакцинации часто имеет ограниченную эффективность. Можно найти примеры эффективности некоторых вакцин против вирусных заболеваний, таких как вирус гриппа, ротавирус или даже полиовирус, по меньшей мере, в некоторых областях земного шара. В ряде случаев антигены, которые предполагалось использовать для вакцинации, являются слабыми иммуногенами, и, вследствие большого разнообразия MHC детерминант, наблюдается значительное варьирование эффективности от одного субъекта к другому.

Вакцинация против аллергических заболеваний также страдает от ограничений, имеющих отношение или к слабой иммуногенности аллергенов, или к отсутствию контроля за рисками, связанными с введением аллергена субъекту, определенно склонному к проявлению аллергических симптомов.

Существует необходимость в более эффективных и более безопасных способах вакцинации как против инфекционных агентов, так и против аллергенов.

Натуральные T клетки-киллеры (NKT) составляют отдельную линию дифференцировки необычных T-лимфоцитов, распознающих антигены, презентируемые молекулой неклассического MHC комплекса CD1d. В настоящее время описано два подкласса NKT-клеток. Наиболее распространены NKT-клетки типа 1, также называемые инвариантными NKT-клетками (iNKT). Они характеризуются наличием альфа-бета T-клеточного рецептора (TCR), состоящего из инвариантной альфа-цепи, Vальфа14 у мыши и Vальфа24 у человека. Данная альфа-цепь соединена с переменным, хотя и ограниченным числом бета-цепей. NKT-клетки типа 2 обладают альфа-бета TCR, но с полиморфной альфа-цепью. Однако очевидно, что существуют другие подклассы NKT-клеток, фенотип которых все еще не полностью определен, но которые имеют общие характерные черты, будучи активируемыми гликолипидами, презентируемыми в тесной связи с молекулой CD1d.

Как правило, NKT-клетки экспрессируют комбинацию рецепторов клеток-натуральных киллеров (NK), включая NKG2D и NK1.1. NKT-клетки являются частью системы врожденного иммунитета, которую можно отличить от системы адаптивного иммунитета по тому факту, что клеткам не требуется размножения перед достижением полной эффекторной способности. Активация NKT-клеток приводит к различным эффектам. Такие клетки высвобождают предварительно образованные медиаторы, включая большой набор цитокинов (включая IL-4, IFN-гамма, IL-21 и IFN-альфа), которые способствуют выработке антител В-клетками, при этом предполагается, что высвобождение цитокинов также может оказывать влияние на CD4+ T клетки (Burrows et al Nature Immunology 2009, 10; 669-671). В контексте настоящего изобретения, увеличение активации B-клеток и активация рестриктированных по главному комплексу гистосовместимости (MHC) класса II CD4+ T клеток было бы целесообразным.

Единица распознавания для NKT-клеток, молекула CD1d, обладает структурой, близко сходной со структурой молекулы MHC класса I, включая наличие бета-2 микроглобулина. Она характеризуется глубоким углублением, окаймленным двумя альфа-цепями и содержащим высокогидрофобные остатки, которые взаимодействуют с липидными цепями. Углубление открыто с обоих концов, что обеспечивает возможность размещения более длинных цепей. Каноническим лигандом CD1d является синтетический альфа-галактозилцерамид (альфа GalCer). Однако было описано множество альтернативных природных лигандов, включая глико- и фосфолипиды, природный липид сульфатид, обнаруженный в миелине, микробные фосфоинозитолманнозид и альфа-глюкуронозилцерамид. Существующее общее мнение сводится к тому (смотри обзоры, например, Matsudaetal, Current Opinion in Immunology 2008, 20: 358-368 и Godfrey et al, Nature reviews Immunology 2010, 11: 197-206), что CD1d связывает только лиганды, содержащие липидные цепи или в большинстве случаев типичную структуру, состоящую из липидного хвоста, углубленного в CD1d, и концевой группы остатка сахара, которая выступает из CD1d.

Пептиды не считаются способными активировать NKT-клетки посредством презентации CD1d. Однако было сделано предположение о том, что длинные гидрофобные пептиды, содержащие объемные аминокислотные остатки, могут связываться с CD1d (Castano et al. Science 1995, 269: 223-226). Наблюдения, сделанные при использовании библиотек фагов, экспрессирующих пептиды произвольных последовательностей с неустановленной физиологической значимостью, обеспечили возможность установления теоретического консенсусного мотива (Castano et al, Science 1995, 269: 223-226 и смотри ниже).

Известно, что Castano et al показали, что активированные клетки представляют собой CD8+ T клетки, а именно рестриктированные по MHC класса I клетки, и не являются NKT-клетками. Эти данные специалисту в этой области техники говорят о том, что отсутствуют доказательства того, что гидрофобные пептиды презентируются молекулами CD1d. Физиологическая значимость заявлений, сделанных Castano et al, в дальнейшем подвергалась сомнению вследствие невозможности вызвать (образование) NKT-клеток по общепринятым протоколам иммунизации (Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20: 358-368 and Brutkiewicz Journal of Immunology 2006, 177: 769-775). Искусственные системы, такие как иммунизация клетками, трансфицированными для сверхэкспрессии CD1d и загруженными in vitro пептидом, полученным из овальбумина, были способны вызвать образование NKT-клеток. Аналогично внутрикожная иммунизация плазмидной ДНК вместе с мышиным CD1d и ко-стимулирующими молекулами индуцирует цитолитические рестриктированные по CD1d T клетки (Lee et al, Journal of Experimental Medicine 1998, 187: 433-438). Гидрофобные пептиды, содержащие структурный мотив, состоящий из ароматического остатка в положении P1 и P7 и алифатической цепи в положении P4, заявленные Castano et al (Science 269: 223, 1995), содержат основной мотив для CD1d-связывающих эпитопов. Как описано выше, выводы, сделанные Castano et al, не подтверждаются данными.

Нами было неожиданно обнаружено, что пептиды, содержащие гидрофобную аминокислотную последовательность, на самом деле способны вызывать активацию NKT-клеток.

Кроме того, активация NKT-клеток дает возможность увеличения эффективности вакцин против инфекционных заболеваний и против аллергенов благодаря большим количествам цитокинов, секретируемых NKT-клетками, которые способствуют стимулированию выработки В-клеток и активации рестриктированных по классу II T клеток (Burrows et al Nature Immunology 2009, 10: 669-671) и, таким образом, производству антител.

Если бы эпитопы белков могли связываться с CD1d, то введение CD1d-связывающего мотива в белок могло бы повысить активацию NKT-клеток, что могло бы привести или к индукции гибели антиген-презентирующей клетки, что было бы необходимо для лечения инфекций внутриклеточными патогенами или опухолей, или увеличению иммуногенности антигенов, что было бы целесообразно при вакцинации против инфекционных заболеваний или аллергии.

Примеры инфекций внутриклеточными патогенами включают микобактериальные инфекции, внутриклеточные бактериальные инфекции, вирусные заболевания и паразитические инфекции. Примерами опухолей являются любые опухоли, экспрессирующие CD1d. Примерами антигенов, используемых для вакцинации, являются вирусные белки, используемые при противогриппозной вакцинации, пероральной вакцинации против ротавируса или против вируса полиомиелита и вакцинации против аллергена.

Конкретнее, введение CD1d-связывающего мотива может быть использовано, когда желательно повысить «убивающую» активность NKT-клеток по отношению к антиген-презентирующим клеткам или увеличить продукцию цитокинов NKT-клетками и посредством этого увеличить иммуногенность.

Создание нового CD1d связывающего мотива(ов) в пределах природной последовательности пептидов или полипептидов или введение CD1d-связывающего мотива(ов) в такие пептиды или полипептиды для рекрутирования и активации NKT-клеток составляет основу настоящего изобретения.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к применению пептидов или полипептидов для лечения инфекций внутриклеточными патогенами у субъекта путем увеличения уничтожения клеток, содержащих такие патогены.

Настоящее изобретение также относится к применению пептидов или полипептидов для лечения опухолей у субъекта путем увеличения распознавания и уничтожения опухолевых клеток.

Настоящее изобретение также имеет отношение к применению пептидов или полипептидов в целях вакцинации субъекта антигенами, полученными от инфекционных агентов или аллергенами.

Мы сделали неожиданное наблюдение, что пептиды могут презентироваться молекулами CD1d и активировать NKT-клетки. Активация таких клеток приводит к приобретению цитолитических свойств по отношению к клетке, презентирующей пептид, связанный с CD1d, и высвобождению цитокинов.

В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к применению, по меньшей мере, одного выделенного иммуногенного пептида или полипептида, полученного из внутриклеточного патогена, который модифицирован путем создания, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или путем добавления, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива к указанному пептиду или полипептиду, в качестве медикамента для лечения у субъекта инфекции, вызванной указанным внутриклеточным патогеном.

В одном аспекте настоящее изобретение также имеет отношение к применению, по меньшей мере, одного выделенного иммуногенного пептида или полипептида, полученного из опухоли, модифицированного путем создания, по меньшей мере, одного нового CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или путем введения, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива в указанный пептид или полипептид, в качестве медикамента для лечения у субъекта указанной опухоли.

В одном аспекте настоящее изобретение также имеет отношение к применению, по меньшей мере, одного выделенного иммуногенного пептида или полипептида, полученного из внеклеточного инфекционного агента, который модифицирован путем создания, по меньшей мере, одного нового CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или путем введения, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива в указанный пептид или полипептид, в качестве медикамента для предотвращения указанной инфекции у субъекта.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению, по меньшей мере, одного выделенного иммуногенного пептида или полипептида, полученного из аллергена, который модифицирован путем создания, по меньшей мере, одного нового CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или путем введения, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива в указанный пептид или полипептид, в качестве медикамента для предотвращения у субъекта аллергических реакций.

Специалисту в данной области техники должно быть ясно, что создание CD1d-связывающего мотива при любом из вышеуказанных показаний, подразумевает, что, будучи презентируемым молекулой CD1d, экспрессированной антиген-презентирующей клеткой, указанный мотив распознается NKT-клетками и активирует указанные NKT-клетки.

В дополнительном аспекте изобретение также относится к применению, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, полученного из внутриклеточного патогена, опухоли, инфекционного агента или аллергена, который модифицирован путем создания, по меньшей мере, одного нового CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или путем добавления, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива к указанному пептиду или полипептиду для привлечения и активации NKT-клеток, в качестве медикамента для активации у субъекта цитолитической активности и продукции цитокинов CD4+ NKT-клетками у указанного субъекта.

В любом из вышеперечисленных вариантов использования указанный пептид или полипептид, полученный из внутриклеточного патогена, может представлять собой любой пептид или полипептид, полученный из вирусов, бактерий, микобактерий или паразитов с внутриклеточным жизненным циклом. Вирусы включают ssДНК-, dsДHK- и РНК-вирусы, например, Herpesviridae, Flaviviridae и Picornaviridae, вирусы гриппа, кори и иммунодефицита. Бактерии и микобактерий включают Mycobacterium tuberculosis, другие микобактерий, патогенные для человека или животных, Yersinia, Brucella, Chlamydiae, Mycoplasma, Rickettsiae, Salmonellae и Shigellae. Паразиты включают Plasmodiums, Leishmanias, Trypanosomas, Toxoplasma gondii, Listeria, Histoplasma.

В любом из вышеперечисленных вариантов применения указанный пептид или полипептид, полученный из опухоли, может представлять собой любой пептид или полипептид, полученный из: (1) онкогенов, таких как MAGE, идентифицированный в некоторых меланомах; (2) протоонкогенов, таких как циклин D1, экспрессируемый карциномами мягких тканей, такими как карцинома почки или паращитовидной железы, а также во множественной миеломе; (3) белков, полученных из вирусов, таких как белки вируса Эпштейна-Барр в некоторых карциномах и некоторых лимфомах ходжкинского типа; (4) факторов выживания (surviving factors), являющихся антиапоптотическими факторами, таких как сурвивин или bc12; (5) клонотипических детерминант, таких как идиотипические детерминанты, полученные из B-клеточного рецептора при фолликулярной лимфоме или множественной миеломе или детерминант T-клеточного рецептора в T-клеточных злокачественных опухолях.

В любом из вышеперечисленных вариантов применения указанный пептид или полипептид получают из инфекционного агента, включая вирусы, бактерии и паразитов.

В любом из вышеперечисленных вариантов применения указанный пептид или полипептид, полученный из аллергена, может представлять собой любой пептид или полипептид, полученный из:

- пищевых аллергенов, присутствующих в арахисе, рыбе, например треске, яичном белке, ракообразных, например креветках, молоке, например коровьем молоке, пшенице, злаках, фруктах семейства Розоцветных (яблоках, сливах, клубнике), овощах семейств Лилейных, Крестоцветных, Пасленовых и Зонтичных, лесных орехах, кунжуте, арахисе, соевых бобах и других аллергенов семейства бобовых, пряностей, дыни, авокадо, манго, инжира, бананов и т.д.,

- аллергенов клещей, обитающих в домашней пыли, полученных из Dermatophagoides spp или D. pteronyssinus, D. farinae и D. microceras, Euroglyphus maynei или Blomia sp.,

- аллергенов насекомых, например тараканов или Перепончатокрылых,

- аллергенов пыльцы, в частности пыльцы деревьев, трав и сорняков,

- аллергенов животных, в частности кошек, собак, лошадей и грызунов,

- аллергенов грибов, в частности Aspergillus, Allernaria или Cladosporinmu, и

- производственных аллергенов, присутствующих в таких продуктах, как латекс или амилаза.

Кроме того, изобретение дополнительно включает выделенные вирусные векторы, характеризующиеся тем, что они содержат, по меньшей мере, один пептид или полипептид, полученный из внутриклеточного патогена, из опухоли, из инфекционного агента или из аллергена, в котором, по меньшей мере, один новый CD1d-связывающий мотив создается в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или в который вводится, по меньшей мере, один CD1d-связывающий мотив,

Определения

Термин "пептид" при использовании в данном описании относится к молекуле, включающей аминокислотную последовательность, содержащую от 2 до 200 аминокислот, соединенных пептидными связями, но которая может в определенном варианте осуществления содержать структуры, не являющиеся аминокислотами (как, например, сшивающее органическое соединение). Пептиды в соответствии с изобретением могут содержать любые из 20 обычных аминокислот или их модифицированные варианты, или могут содержать не встречающиеся в природе (искусственные) аминокислоты, включенные путем химического пептидного синтеза или с помощью химической или ферментативной модификации. Термин "полипептид" при использовании в данном описании в большинстве случаев относится к более длинным пептидам или белкам.

Термин "эпитоп", использующийся в данном описании, относится к одному или нескольким участкам (которые могут определять конформационный эпитоп) белка, который/ые специфически узнается/ются и связываются антителом или его фрагментом (Fab¹, Fab2' и т.д.) или рецептором, присутствующим на клеточной поверхности B или T-клеточного лимфоцита, и который способен, с помощью указанного связывания, индуцировать иммунный ответ.

Термин "антиген", использующийся в данном описании, относится к структуре макромолекулы, содержащей один или более гаптенов и/или содержащей один или более T-клеточных эпитопов. Как правило, указанная макромолекула представляет собой белок или пептид (с или без полисахаридов) или состоит из композиции белков и содержит один или более эпитопов; указанная макромолекула в этом описании может альтернативно называться "антигенный белок" или "антигенный пептид".

Термин "аллерген" относится к специфической разновидности антигена, отличающейся способностью вызывать образование антител IgE изотипа у предрасположенных лиц.

Термин "T-клеточный эпитоп" или "T-клеточная антигенная детерминанта" в контексте настоящего изобретения относится к доминирующему, субдоминирующему или второстепенному T-клеточному эпитопу, т.е. части антигенного белка, которая специфически распознается и связывается рецептором клеточной поверхности T-лимфоцита. Является ли эпитоп доминирующим, субдоминирующим или второстепенным зависит от иммунного ответа, вызванного к данному эпитопу. Доминантность зависит от частоты, с которой такие эпитопы распознаются T-клетками и способны активировать их среди всех возможных T-клеточных эпитопов белка. В частности, T-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, связываемый молекулами MHC класса I или MHC класса II.

Термин "NKT-клеточный эпитоп (детерминанта)" относится к части антигенного белка, которая специфически распознается и связывается рецептором на поверхности клетки T-лимфоцита. В частности, NKT-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, связываемый CD1d молекулами.

Термин "CD4+ эффекторные клетки" относится к клеткам, принадлежащим к подклассу CD4-положительных T-клеток, функцией которых является обеспечение содействия другим клеткам, таким как, например, B-клетки. Эти эффекторные клетки обычно называются Th-клетками (T-хелперные клетки), при наличии различных подклассов, таких как ThO, Th1, Th2 и Thl7 клетки.

Термин "NKT-клетки" относится к клеткам системы врожденного иммунитета, характеризующимся тем фактом, что они несут рецепторы, такие как NK1.1 и NKG2D, и распознают эпитопы, презентируемые молекулой CD1d. В контексте настоящего изобретения NKT-клетки могут принадлежать как к подклассу типа 1 (инвариантные), так и типа 2.

"Молекула CD1d" относится к молекуле, не происходящей от MHC, состоящей из 3 альфа-цепей и антипараллельного набора бета-цепей, сгруппированных в глубокий гидрофобный желобок, открытый с обеих сторон и способный презентировать липиды, гликолипиды или гидрофобные пептиды NKT-клеткам.

Термин "CD1d-связывающий мотив" относится к аминокислотной последовательности, соответствующей общему аминокислотному мотиву [FW]-XX-[ILMV]-XX-[FW], в котором F обозначает фенилаланин, W - триптофан, I - изолейцин, L - лейцин, M - метионин и V - валин. X представляет собой любую аминокислоту. В некоторых случаях, [FW] в положении 7 замещен на T (треонин) или H (гистидин). Термин "предполагаемый CD1d-связывающий мотив" при использовании в данном описании относится к аминокислотной последовательности, которая соответствует общему аминокислотному мотиву [FWHY]-X₂X₃-[ILMV] или [ILMV]-X₂X₃-[FWHY], в котором Y обозначает тирозин. В некоторых случаях, предполагаемый мотив может представлять собой [FWHY]-X₂-[ILMV] или [ILMV]-X₂-[FWHY] или [FWHY]-X₂X₃X₄-[ILMV] или [ILMV]-X₂X₃X₄-[FWHY].

Термин "иммунные расстройства" или "иммунные заболевания" относится к заболеваниям, при которых реакция иммунной системы несет ответственность за или поддерживает нарушение функции или нефизиологическое состояние в организме. Иммунные расстройства в контексте настоящего изобретения относятся к патологии, вызванной инфекционными агентами, и иммунологическому надзору за опухолями.

Термин "субъект" относится к млекопитающим, включая приматов и неприматов.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предоставляет способы подавления или устранения у субъекта инфекции внутриклеточным патогеном или опухоли, или увеличения иммуногенности антигенов, таких как некоторые инфекционные агенты и аллергены, используемые для вакцинации.

В частности, изобретение предоставляет способы увеличения экспансии (размножения) и функциональной активности CD4+ NKT-клеток. Такие клетки обычно подразделяют на два различных подкласса, а именно NKT-клетки 1 типа, несущие инвариантную TCR альфа-цепь (Vальфа14 у мыши, Vальфа24 у человека), или NKT-клетки типа 2, которые имеют различный набор альфа-цепей. Однако последние данные свидетельствуют об альтернативных подклассах NKT-клеток, которые не соответствуют типу 1 или типу 2. Целью настоящего изобретения является включение этих необычных NKT-клеток, при условии, что они несут CD4 ко-рецептор. В результате презентации антигена, связанного с CD1d, NKT-клетки быстро активируются, приобретают цитолитические свойства и секретируют ряд цитокинов, которые как полагают, являются определяющими при оказании влияния на другие клетки систем как врожденного, так и адаптивного иммунитета.

В контексте настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что пептиды могут презентироваться молекулой CD1d и могут активировать NKT-клетки, распознающие комплекс, образованный CD1d и пептидом. Характерной чертой молекулы CD1d являются две антипараллельные альфа-цепи, образующие углубление, располагающееся на вершине платформы, состоящей из двух антипараллельных бета-цепей. Узкое и глубокое углубление связывает только гидрофобные остатки, и как полагают, представляющие собой исключительно липиды.

В этом углублении может разместиться последовательность из 7 аминокислот, характеризующаяся наличием гидрофобного остатка в положении (P)1 и 7 и алифатического остатка в P4. P1 обязательно является гидрофобным остатком, таким как F, W, H или Y. Однако P7 является необязательным и может содержать другие остатки при условии, что они не являются полярными. Остатки в P4 предпочтительно являются алифатическими, однако это необязательно. Общая последовательность CD1d-связывающего мотива, таким образом, представляет собой [FWTHY]-X₂X₃-[ILMV]-X₅X₆-[FWTHY]. Однако специалисту в данной области техники должно быть ясно, что мотив является симметричным, и что P7 может рассматриваться как P1 и P1 может рассматриваться как P7. Общая последовательность CD1d-связывающего мотива предоставляется в описании в качестве общего указания без какого-либо ограничения. Пептиды и полипептиды изобретения определены в соответствии с их способностью активировать NKT-клетки путем презентации CD1d молекулы.

Множество пептидов и полипептидов не несут CD1d-связывающий мотив в естественных условиях. Однако настоящее изобретение также включает пептиды и полипептиды, которые уже несут, по меньшей мере, один CD1d мотив в своей природной последовательности, так как это может оказаться полезным, увеличив количество указанных мотивов для усиления подавления инфекций внутриклеточными патогенами или опухолевых клеток или для увеличения иммуногенности к антигенам инфекционных агентов или аллергенов.

Настоящее изобретение относится к получению пептидов и полипептидов, которые модифицированы путем создания, по меньшей мере, одного нового CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанных пептидов и полипептидов, или путем добавления, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива к указанному пептиду или полипептиду, несмотря на то, что они уже несут такой мотив.

В дополнительном аспекте изобретение также включает использование, по меньшей мере, одного выделенного гидрофобного пептида или полипептида, содержащего, по меньшей мере, один CD1d-связывающий мотив, представленный мотивом общей последовательности [FW]-X₂X₃-[ILMV]-X₅X₆-[FWTHY] для увеличения у субъекта уничтожения клеток, инфицированных внутриклеточными патогенами, или опухолевых клеток, или для увеличения у указанного субъекта иммуногенности инфекционных антигенов или аллергенов, использованных для вакцинации.

В другом дополнительном аспекте изобретение также включает использование, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, в котором, по меньшей мере, один CD1d-связывающий мотив, представленный последовательностью [FW]-X₂X₃-[ILMV]-X₅X₆-[FWTHY], был создан в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или был добавлен к указанной природной последовательности для активации у субъекта NKT-клеток.

В другом дополнительном аспекте изобретение также включает использование, по меньшей мере, одного, выделенного гидрофобного пептида или полипептида, содержащего, по меньшей мере, один новый CD1d-связывающий мотив, представленный последовательностью [FW]-X₂X₃-[ILMV]-X₅X₆-[FWTHY], в качестве медикамента для подавления у субъекта инфекции внутриклеточными патогенами или опухолевых клеток или для повышения эффективности антигенов из инфекционных агентов или аллергенов для вакцинации.

Дополнительным преимуществом настоящего изобретения является то, что введение ароматических аминокислотных остатков в пептиды или полипептиды приводит к образованию CD1d-связывающих мотивов, которые являются разнородными в том смысле, что указанные мотивы могут связываться с молекулами CD1d всех или подавляющего большинства субъектов. Это связано с тем, что сама молекула CD1d обладает очень ограниченной степенью полиморфизма. В дополнение к этому, учитывая, что полиморфизм антигенного рецептора NKT-клетки является строго ограниченным, специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что введение одной и той же ароматической аминокислоты применимо ко всем субъектам, рассматриваемым в отношении применения настоящего изобретения.

Это находится в резком контрасте с пептидными и полипептидными мотивами, связывающимися с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса II, когда может быть описано большое количество пептидов, содержащих подходящую последовательность. Это обусловлено минимальными ограничениями, налагаемыми на пептиды, связывающиеся с MHC класса II, и широким полиморфизмом молекул класса II.

Пептиды и полипептиды, являющиеся целью настоящего изобретения, получают, как указано далее:

(1) в некоторых случаях оценивается способность пептида или полипептида активировать NKT-клетки. Это осуществляется путем инкубации указанного пептида или полипептида с клеточной линией, экспрессирующей молекулу CD1d. Примеры таких клеточных линий известны в данной области техники (например, JAWS2 клетки). В предпочтительном варианте осуществления клеточная линия не имеет молекул МНС класса II и для сверхэкспрессии CD1d трансфектируется вирусным вектором, содержащим ДНК-последовательность CD1d, или используются любые другие способы введения гена в клетку, известные в данной области техники. Способы трансдукции клеток известны в данной области техники. Пептид или полипептид вводится при культивировании клеточной линии. Эффективное презентирование пептида или полипептида молекулой CD1d затем оценивается путем измерения активации NKT-клеток. Такие клетки можно получить из периферической крови, например, путем магнитной сепарации и поддерживать в культуре со стимуляторами, такими как альфа-гал-церамид, в присутствии цитокинов, таких как IL-2 и IL-15 или IL-7. Такие методы описаны в данной области техники (смотри, например, Brutkiewicz Journal of Immunology 2006, 177: 769-775). Для оценки активации NKT-клеток может использоваться, например, метод оценки выработки цитокинов. Выбираются пептиды или полипептиды, обнаруживающие отсутствие или только ограниченную активацию NKT-клеток.

(2) затем определяют присутствие в аминокислотной последовательности пептида или полипептида, по меньшей мере, одного мотива, соответствующего последовательности [FWHY]-X₂X₃[ILMV] или [ILMV]-X₂X₃-[FWHY] (предполагаемый CD1d-связывающий мотив) с использованием алгоритмов, хорошо известных в данной области техники, таких как http://expasy,org/tools/scanprositc/

В частности, указанные алгоритмы делают возможным предсказание в пределах пептида или полипептида одной или более последовательностей длиной 7 аминокислот, которые соответствуют последовательности [FWHY]-X₂X₃-[ILMV]-X₅X₆-[FWHY] и, таким образом, имеют возможность уместиться в углубление молекулы CD1d. Конкретнее, указанные алгоритмы обеспечивают возможность предсказания аминокислотных последовательностей, соответствующих [FW]-X₂X₃-[ILMV] или [ILMV]-X₂X₃-[FW].

(3) последовательности аминокислот, установленные при помощи указанных алгоритмов, анализируют и модифицируют заменой аминокислот для увеличения способности связывания с CD1d. В основном, это включает замену аминокислот в положении P1 такими гидрофобными остатками, как F, W, H или Y и/или замену аминокислот в положении P7 на F, W, T, H или Y, в случае необходимости.

(4) дополнительно устанавливают предполагаемый CD1d-связывающий мотив, соответствующий [FWHY]-X₂-[ILMV] или [ILMV]-X₂-[FWHY], или [FWHY]-X₂X₃X₄-[ILMV] или [ILMV]-X₂X₃X₄-[FWHY]. В таких случаях добавление X₃ или делеция X₄, соответственно, оказывается выгодной для воссоздания CD1d-связывающего мотива, содержащего алифатический аминокислотный остаток в положении P4. В более общем смысле, предполагаемый CD1d-связывающий мотив может соответствовать общей формуле [FWHY]-R-[ILMV] или [ILMV]-R-[FWHY], где R представляет собой аминокислоту или аминокислотную последовательность.

(5) в некоторых случаях CD1d мотив может быть введен в аминокислотную последовательность пептида или полипептида как с карбоксиконцевого, так и с аминоконцевого конца последовательности или где-либо в пределах природной последовательности пептида или полипептида.

(6) в некоторых случаях пептиды и полипептиды изобретения могут быть модифицированы путем создания, по меньшей мере, одного CD1d-мотива и путем введения, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива.

(7) в некоторых случаях синтетический пептид, включающий последовательность, содержащую CD1d-связывающий мотив, тестируется in vitro при помощи клеточной линии, экспрессирующей молекулу CD1d, как описано в (1).

(8) в некоторых случаях способность пептида или полипептида, модифицированная путем замены, вставки или удаления аминокислот, как описано выше, связываться с CD1d тестируется in vitro с использованием тетрамеров молекулы CD1d для обнаружения NKT-клеток, специфичных к такому пептиду. Одним из возможных вариантов является использование флуоресцентно-меченых тетрамеров и обнаружение методом флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (facs).

Специалисту в данной области техники должно быть ясно, что замена или добавление аминокислотных остатков, или добавление CD1d-связывающего мотива(ов) может осуществляться с использованием нефизиологических аминокислотных остатков, таких как D-аминокислоты или органического соединения.

Затем пептид или полипептид, содержащий замену, вставку или делецию аминокислоты, получают с использованием методов, известных в данной области техники, для производства рекомбинантных белков при помощи экспрессионных систем, таких как бактериальные клетки, клетки дрожжей, клетки насекомых, растительные клетки или клетки млекопитающих.

В соответствии с настоящим изобретением рассматриваются медикаменты для лечения заболеваний, вызванных внутриклеточными пато генами. Примеры указанных внутриклеточных патогенов включают ssДНК, dsДНК и РНК-вирусы, бактерии и микобактерии и паразиты.

Кроме того, рассматриваются медикаменты для лечения опухолей.

Дополнительно также рассматриваются медикаменты для вакцинации против инфекционных агентов, преимущественно с внеклеточным жизненным циклом, и против аллергенов.

Следует понимать, что любой из пептидов или полипептидов, рассматриваемых в контексте настоящего изобретения, может вводиться в виде гена для переноса генов, который может осуществляться с использованием вирусных векторов или других способов, известных специалисту в данной области техники. В этом случае может оказаться выгодным изменение аминокислотной последовательности собственно вирусного вектора путем добавления CD1d-связывающего мотива, и тем самым увеличение экспрессии трансгена.

В предпочтительном варианте осуществления пептид может состоять из CD1d-связывающего мотива, включающего последовательность [FW]-X₂X₃-[ILMV]-X₅X₆-[FWTHY]. В еще более предпочтительном варианте осуществления указанный пептид также содержит фланкирующие аминокислотные остатки как на амино-конце, так и на карбокси-конце или обоих концах указанного пептида. В другом предпочтительном варианте осуществления указанный пептид содержит большие аминокислотные остатки внутри фланкирующих остатков. В следующем варианте осуществления указанный пептид несет, по меньшей мере, один рестриктированный по классу II T-клеточный эпитоп. В другом варианте осуществления указанный пептид содержит фланкирующие аминокислотные остатки, которые являются частью природной последовательности, на основе которой получен пептид.

Медикамент изобретения является, хотя и необязательно, (фармацевтической) композицией, содержащей в качестве активного ингредиента, по меньшей мере, один из пептидов или полипептидов изобретения или генотерапевтический вектор, способный экспрессировать указанные пептиды или полипептиды. Помимо активного ингредиента(ов), такая композиция будет содержать, по меньшей мере, один (фармацевтически приемлемый) разбавитель.

В общем, введение пептидов или полипептидов изобретения увеличивает активацию системы врожденного иммунитета, конкретнее, активацию NKT-клеток, конкретнее, продукцию цитокинов вследствие активации NKT-клеток, конкретнее, цитолитические свойства NKT-клеток.

Способ введения пептидов и полипептидов настоящего изобретени