Мыши, которые производят антитела, имеющие только тяжелые цепи

Мыши, которые производят антитела, имеющие только тяжелые цепи

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Областью изобретения являются генетически модифицированные, не являющиеся человеком, животные, которые производят антитела, имеющие только тяжелую цепь, в частности, генетически модифицированные животные, которые содержат делецию нуклеотидной последовательности в последовательности гена иммуноглобулина гамма (IgG), кодирующей домен CH1 (или домен CH1 и шарнирную область), но которые способны к экспрессии IgM, у которого не отсутствует функциональный домен CH1, и, в частности, мыши, которые способны к выработке молекулы IgM дикого типа (т.е. с доменами CH1), но которые производят тяжелую цепь антител IgG, лишенную функционального домена CH1 (или домена CH1 и шарнирной области).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

У большинства животных нормальные тяжелые цепи иммуноглобулинов хорошо экспрессируются только тогда, когда они спарены с их родственными легкими цепями. У людей одиночные тяжелые цепи обнаружены при болезни тяжелых цепей, которая проявляется наличием дисфункциональных тяжелых цепей, у которых потеряны последовательности вариабельного домена, домена CH1, или вариабельного и CH1 доменов. Только тяжелые цепи, без легких цепей, встречаются у определенных видов рыб и у верблюдов. У таких тяжелых цепей отсутствует функциональный домен CH1 и имеются не относящиеся к человеку особенности в вариабельных доменах тяжелых цепей. Были предприняты попытки сделать камелизированные антитела посредством модификации мышей для экспрессии камелизированных генов, которые имитируют домены VHH, обнаруженные у верблюдов или определенных видов рыб, частично за счет удаления доменов CH1 IgM и IgG и сборки вариабельных областей тяжелых цепей для того, чтобы они походили на таковые у верблюдов и/или определенных видов рыб. Однако можно ожидать, что камелизированные антитела будут индуцировать иммунные ответы у животных, не являющихся верблюдами.

Существует необходимость в данной области в генетически модифицированных, не являющихся человеком, животных, которые производят антитела, имеющие только тяжелую цепь с не-верблюжьими доменами VH.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фигура 1 изображает локус IgG1 дикого типа у мыши (IgG1, сверху), демонстрируя генный сегмент области JH, слитый с генным сегментом CH1, с последующей шарнирной областью, генным сегментом CH2 и генным сегментом CH3; локус IgG1, являющийся мишенью для конструкции, которая делетирует домен CH1 (IgG1∆CH1, середина); и локус IgG1, являющийся мишенью для конструкции, которая делетирует как домен CH1, так и шарнирную область (IgG∆CH1-∆шарнир, внизу).

Фигура 2 изображает мышиный ген-мишень IgG1 для создания генетически модифицированного локуса, который экспрессирует IgG1 без домена CH1.

Фигура 3 изображает мышиный ген-мишень IgG1 для создания генетически модифицированного локуса, который экспрессирует IgG1 без домена CH1 и шарнирной области.

Фигура 4 изображает локус-мишень константной области тяжелой цепи мыши для создания генетически модифицированного локуса, который экспрессирует IgG1 без домена CH1 и не экспрессирует IgG2b или IgG2a.

Фигура 5 изображает константную область тяжелой цепи мыши, являющейся мишенью для конструкции, которая делетирует как домен CH1, так и шарнирную область и которая делетирует гены IgG2b и IgG2.

Фигура 6 изображает константную область тяжелой цепи генетически модифицированной мыши с IgG1, у которого отсутствует домен CH1 или отсутствуют домен CH1 и шарнирная область (вверху), и константную область тяжелой цепи генетически модифицированной мыши с IgG1, у которого отсутствует домен CH1 или отсутствуют домен CH1 и шарнирная область, и у мыши отсутствует ген IgG2a и ген IgG2b (внизу).

На фигуре 7 представлены вестерн-блоттинги супернатантов из клеток CHO, сконструированных для того, чтобы независимо экспрессировать контроль (цитокиновый эктодомен, слитый с мышиным Fc), химерное антитело (человеческий VR)/(мышиный Fc), имеющее только тяжелую цепь, в которой отсутствует домен CH1 (hVR-mFc∆CH1), камелизированное химерное антитело (человеческий VR)/(мышиный Fc), имеющее только тяжелую цепь, в которой отсутствует домен CH1 (hVR^*-mFc∆CH1), химерное антитело (человеческий VR)/(мышиный Fc), имеющее только тяжелую цепь (hVR-mFc), камелизированное химерное антитело (человеческий VR)/(мышиный Fc), имеющее только тяжелую цепь (hVR^*-mFc), mFc с доменом CH1 (mFc) или без домена CH1 (mFc∆CH1).

На фигуре 8 представлены изображения вестерн-блоттингов с восстанавливающего SDS-PAGE мышиной сыворотки от мыши дикого типа (слева) и от генетически модифицированной мыши, у IgG1 которой отсутствуют домен CH1 и шарнирная область (гетерозиготная) (справа), блоты делали с анти-мышиным IgG; предоставлены схемы тяжелых цепей, поскольку они являются маркерами положения молекулярных масс.

На фигуре 9 представлены изображения Вестерн-блоттингов с невосстанавливающего SDS-PAGE мышиной сыворотки от мыши дикого типа (WT) и четырех генетически модифицированных мышей, у IgG1 которых отсутствует домен CH1 и шарнирная область (гомозиготные; обозначены как HO 1, HO 2, HO 3, HO 4, соответственно), блоты делали с анти-мышиным IgG; каждая мышь (WT или HO) представлена двумя дорожками, обозначенными квадратными скобками над линиями, соответствующими разведениям сыворотки 1:5 и 1:10 от каждого животного (последовательные полосы слева направо для каждого).

На фигуре 10 представлена схематическая диаграмма нормального антитела IgG1 (слева) и антитела, имеющего только тяжелую цепь, у которой отсутствуют домен CH1 и шарнирная область.

Фигура 11 показывает раздельные анализы сывороточных иммуноглобулинов IgG1 и IgG2b мышей дикого типа (WT) и генетически модифицированных мышей, у которых IgG1 не содержит домена CH1 и шарнирной области (HO; гомозиготная мышь, которая экспрессирует тяжелую цепь антитела, в которой отсутствуют домен CH1 и шарнирная область). Контроль представляет собой смешанную сыворотку человека.

На фигуре 12 представлены белковые последовательности одиннадцати независимых RT-ПЦР клонов, амплифицированных из РНК спленоцитов мышей, несущих последовательности генов тяжелой цепи мыши в модифицированном эндогенном локусе мышиной тяжелой цепи, лишенной последовательностей областей CH1 IgG1 и шарнира. B1=SEQ ID NO:19; B2=SEQ ID NO:21; B3=SEQ ID NO:23; B5=SEQ ID NO:25; D2=SEQ ID NO:27; D5=SEQ ID NO:29; D6=SEQ ID NO:31; E2=SEQ ID NO:33; E8=SEQ ID NO:35; E10=SEQ ID NO:37; F6=SEQ ID NO:39. Строчные буквы оснований указывают на основания, не относящиеся к зародышевой линии, которые являются результатом или мутации и/или добавления некодирующих нуклеотидов во время рекомбинации. Точки представляют искусственные пропуски в последовательности для точного выравнивания каркаса (FR) и определяющих комплементарность областей (CDR), которые обозначены над последовательностями. Для каждого клона показаны первые девять аминокислот из области CH2 эндогенной константной области IgG1 (CH2).

На фигуре 13 представлены белковые последовательности семи независимых RT-ПЦР клонов, амплифицированных из РНК спленоцитов мышей, несущих последовательности генов тяжелой цепи человека в модифицированном локусе мышиной эндогенной тяжелой цепи, лишенной последовательности области CH1 IgG1. A8=SEQ ID NO:51; C2=SEQ ID NO:53; D9=SEQ ID NO:55; C4=SEQ ID NO:57; H8=SEQ ID NO:59; A5=SEQ ID NO:61; A2=SEQ ID NO:63. Строчные буквы оснований указывают на основания, не относящиеся к зародышевой линии, которые являются результатом или мутации и/или добавления некодирующих нуклеотидов во время рекомбинации. Точки представляют искусственные пропуски в последовательности для точного выравнивания каркаса (FR) и определяющих комплементарность областей (CDR), которые обозначены над последовательностями. Для каждого клона показаны первые семь аминокислот из тринадцати аминокислот шарнирной области эндогенной константной области IgG1 (HINGE).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагаются генетически модифицированные клетки, не принадлежащие человеку эмбрионы, животные, не являющиеся человеком, и способы и композиции для их создания и применения, где животные генетически модифицированы для потери последовательности функционального CH1 в иммуноглобулине G (IgG), необязательно модифицированы для потери функциональной шарнирной области IgG в модифицированном IgG, и где клетки, эмбрионы и животные содержат последовательность функционального CH1 IgM. В некоторых аспектах мыши содержат замену одного или нескольких, или всех, эндогенных генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши одним или несколькими генными сегментами вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых аспектах все эндогенные генные сегменты V, D и J мыши замещены одним или несколькими генными сегментами V человека, одним или несколькими генными сегментами D человека, и одним или несколькими генными сегментами J человека.

В одном из аспектов предлагается генетически модифицированная мышь, где генетическая модификация включает модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей константную область IgG, где модификация приводит к потере функции домена CH1 константной области IgG. В одном из вариантов осуществления модификация, связанная с потерей функции, представляет собой делецию нуклеотидной последовательности, кодирующей домен CH1, или делецию внутри нуклеотидной последовательности, кодирующей домен CH1.

В одном из вариантов осуществления IgG выбран из IgG1, IgG2a, IgG2b и их сочетания. В одном из вариантов осуществления IgG представляет собой IgG1. В одном из вариантов осуществления IgG представляет собой IgG1, IgG2a и IgG2b.

В одном из вариантов осуществления модификация дополнительно включает делецию нуклеотидной последовательности шарнирной области IgG, который содержит модификацию CH1.

В одном из вариантов осуществления генетически модифицированная мышь выбрана из линии 129, линии C57BL/6 и помеси 129×C57BL/6. В конкретном варианте осуществления мышь является на 50% 129 и 50% C57BL/6.

В одном из вариантов осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой линию 129, выбранную из группы, состоящей из 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (см., например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836). В одном из вариантов осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой линию C57BL, в конкретном варианте осуществления выбранную из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/Ola. В конкретном варианте осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой помесь вышеуказанной линии 129 и вышеуказанной линии C57BL/6. В другом конкретном варианте осуществления мышь представляет собой помесь вышеуказанных линий 129, или помесь вышеуказанных линий BL/6. В конкретном варианте осуществления линия 129 помеси представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac).

В одном из вариантов осуществления мышь содержит один или несколько нереаранжированных эндогенных генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши (mVR), функционально связанных с модифицированной последовательностью константной области IgG. В одном из вариантов осуществления один или несколько генных сегментов mVR представляют собой семейство генов VH мыши, выбранное из VH1, VH3, VH5, VH7, VH14 и их сочетания. В одном из вариантов осуществления один или несколько генных сегментов mVR выбраны из mVH 1-26, 1-42, 1-50, 1-58, 1-72, 3-6, 5-6, 7-1, 14-2 и их сочетания.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит реаранжированный ген, который кодирует FR1, FR2 и FR3 в тяжелой цепи IgG, в которой отсутствует функциональная область CH1, где каждый из FR1, FR2 и FR3 независимо идентичны, по меньшей мере, на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% FR1, FR2 и FR3, полученным из последовательности зародышевой линии mVH, выбранной из семейства генов VH1, VH3, VH5, VH7 и VH14. В одном из вариантов осуществления последовательность зародышевой линии mVH выбрана из 1-26, 1-42, 1-50, 1-58, 1-72, 3-6, 5-6, 7-1 и 14-2 последовательностей.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит CDR3, полученную из генного сегмента DH, выбранного из DH 1-1, 2-14, 3-1, 3-2, 3-3, 4-1 и их сочетания. В одном из вариантов осуществления мышиная CDR3 содержит последовательность, кодируемую JH, который представляет собой JH1, JH2, JH3 или JH4.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит реаранжированную последовательность антитела, кодирующую CDR3, которая получена реаранжировкой DH 1-1, 2-14, 3-1, 3-2, 3-3, 4-1 и JH1, JH2, JH3 или JH4.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит реаранжированный ген, который кодирует FR4 в тяжелой цепи IgG, в которой отсутствует функциональная область CH1, где FR4 является идентичным, по меньшей мере, на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% FR4, который кодируется реаранжировкой DH 1-1, 2-14, 3-1, 3-2, 3-3 или 4-1 с JH1, JH2, JH3 или JH4.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит нереаранжированный генный сегмент вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (hVR) в эндогенном локусе вариабельной области тяжелой цепи мыши. В одном из вариантов осуществления мышь содержит нереаранжированный генный сегмент hVR, функционально связанный с модифицированной последовательностью константной области IgG в эндогенном локусе вариабельной области тяжелой цепи мыши. В одном из вариантов осуществления генные сегменты hVR принадлежат к семейству генов человека VH, выбранному из VH1, VH3, VH4 и их сочетания. В одном из вариантов осуществления один или несколько генных сегментов hVR выбраны из 1-2, 1-8, 1-18, 1-46, 1-69, 3-21, 3-72 и 4-59. В конкретном варианте осуществления один или несколько генных сегментов hVR выбраны из 1-8, 1-18 и 1-69.

В одном из вариантов осуществления все или по существу все генные сегменты V тяжелой цепи мыши замещены одним или несколькими генными сегментами V тяжелой цепи человека. В одном из вариантов осуществления все генные сегменты V и D тяжелой цепи мыши замещены одним или несколькими генными сегментами V и D тяжелой цепи человека. В одном из вариантов осуществления генные сегменты V, D и J тяжелой цепи мыши замещены одним или несколькими генными сегментами V тяжелой цепи человека, одним или несколькими генными сегментами D тяжелой цепи человека и одним или несколькими генными сегментами J тяжелой цепи человека. В этих вариантах осуществления генные сегменты V и/или D и/или J тяжелой цепи человека находятся в эндогенном локусе тяжелой цепи мыши и функционально связаны с геном(ами) константной области мыши или модифицированным геном(ами) константной области мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует последовательности FR1, FR2 и FR3 тяжелой цепи IgG, в которой отсутствует функциональная область CH1, которые, по меньшей мере, на 80% идентичны FR1, FR2 и FR3 из нуклеотидной последовательности зародышевой линии человека из генного сегмента 1-8, 1-18 или 1-69 вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека; где FR1+FR2+FR3 последовательность модифицированной мыши оптимально выравнена с упомянутой последовательностью зародышевой линии человека безотносительно к последовательностям CDR мыши и человека (т.е., оптимальное выравнивание FR, без обсуждения идентичности аминокислот любых сравниваемых CDR в сравнении). В конкретных вариантах осуществления FR1, FR2 и FR3 идентичны приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с последовательностью FR1+FR2+FR3 генного сегмента вариабельной области тяжелой цепи зародышевой линии человека, который представляет собой генный сегмент 1-8, 1-18 или 1-69.

В одном из вариантов осуществления мышь дополнительно содержит FR4, который является идентичным, по меньшей мере, на 80% FR4, образованному реаранжировкой D6-19/J6 человека, реаранжировкой D6-7/J4, реаранжировкой D4-4/J4, реаранжировкой D6-6/J2, реаранжировкой D3-16/J6, реаранжировкой D6-6/J4 и реаранжировкой D1-7/J4. В конкретных вариантах осуществления FR4 является идентичным приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% FR4, образованному вышеуказанной реаранжировкой D/J.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую FR1, чья аминокислотная последовательность отличается не более чем на 1, не более чем на 2, не более чем на 3, не более чем на 4 или не более чем на 5 аминокислот от FR1, который кодируется врожденной последовательностью генного сегмента вариабельной области тяжелой цепи человека, выбранной из V1-8, V1-18 и V1-69. В конкретном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая FR1, представляет собой реаранжированную последовательность, функционально связанную с последовательностью, кодирующей константную область IgG, в которой отсутствует последовательность функционального CH1.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую FR2, чья аминокислотная последовательность отличается не более чем на 1, не более чем на 2, не более чем на 3, не более чем на 4 или не более чем на 5 аминокислот от FR2, который кодируется врожденной последовательностью генного сегмента вариабельной области тяжелой цепи человека, выбранной из V1-8, V1-18 и V1-69. В конкретном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая FR2, представляет собой реаранжированную последовательность, функционально связанную с последовательностью, кодирующей константную область IgG, в которой отсутствует последовательность функционального CH1.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую FR3, чья аминокислотная последовательность отличается не более чем на 1, не более чем на 2, не более чем на 3, не более чем на 4, не более чем на 5, не более чем на 6, не более чем на 7, не более чем на 8, не более чем на 9, не более чем на 10 или не более чем на 11 аминокислот от FR3, который кодируется врожденной последовательностью генного сегмента вариабельной области тяжелой цепи человека, выбранной из V1-8, V1-18 и V1-69. В конкретном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая FR3, представляет собой реаранжированную последовательность, функционально связанную с последовательностью, кодирующей константную область IgG, в которой отсутствует последовательность функционального CH1.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую FR4, чья аминокислотная последовательность отличается не более чем на 1, не более чем на 2, не более чем на 3 аминокислоты от FR4, который кодируется реаранжировкой D6-19/J6, D6-7/J4, D4-4/J4, D6-6/J2, D3-16/J6, D6-6/J4 и D1-7/J4 человека. В конкретном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая FR4, представляет собой реаранжированную последовательность, функционально связанную с последовательностью, кодирующей константную область IgG, в которой отсутствует последовательность функционального CH1.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, полученную из генного сегмента области D тяжелой цепи человека (hDH). В одном из вариантов осуществления hDH выбрана из D1-7, D3-16, D4-4, D6-6, D6-7 и D6-19.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, полученную из генного сегмента соединительного пептида тяжелой цепи (JH) человека. В конкретном варианте осуществления JH выбран из J2, J4 и J6.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит CDR3 тяжелой цепи, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, полученной из реаранжировки DH и JH человека. В конкретном варианте осуществления CDR3 получена из реаранжировки D1-7/J4, D3-16/J6, D4-4/J4, D6-6/J2, D6-6/J4, D6-7/J4 или D6-19/J6.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит замену эндогенного генного сегмента mVR генным сегментом hVR. В конкретном варианте осуществления замена эндогенного генного сегмента mVR генным сегментом hVR представляет собой тот же аллель, что и модифицированная константная область тяжелой цепи. В другом конкретном варианте осуществления замена генного сегмента mVR генным сегментом hVR представляет собой аллель, отличный от аллеля модифицированной константной области тяжелой цепи.

В одном из вариантов осуществления 90-100% генных сегментов mVR замещены, по меньшей мере, одним генным сегментом hVR. В конкретном варианте осуществления все или по существу все эндогенные генные сегменты mVR замещены, по меньшей мере, одним генным сегментом hVR. В одном из вариантов осуществления замена происходит при участии, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 39 или, по меньшей мере, 80 или 81 генного сегмента hVR. В одном из вариантов осуществления замена происходит при участии, по меньшей мере, 12 генных сегментов функциональной hVR, по меньшей мере, 25 генных сегментов функциональной hVR или, по меньшей мере, 43 генных сегментов функциональной hVR.

В одном из вариантов осуществления генетически модифицированная мышь содержит трансген, который состоит, по меньшей мере, из одного нереаранжированного генного сегмента hVR, по меньшей мере, из одного нереаранжированного сегмента D человека, по меньшей мере, из одного нереаранжированного сегмента J человека и, по меньшей мере, из одной константной последовательности тяжелой цепи человека. В одном из вариантов осуществления эндогенные локусы вариабельной области тяжелой цепи мыши и вариабельной области легкой цепи каппа функционально выключены. В конкретном варианте осуществления мышь способна к транс-переключению для выработки химерного антитела человек/мышь, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи человека, примыкающий к последовательности IgG мыши, в которой отсутствует функциональный домен CH1 и, необязательно, отсутствует шарнирная область IgG, в котором нет функционального домена CH1. В конкретном варианте осуществления трансген дополнительно содержит последовательность IgG, в которой отсутствует домен CH1, и необязательно содержит IgM с функциональным доменом CH1. В дополнительном конкретном варианте осуществления в последовательности IgG отсутствует шарнирная область.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит первый аллель вариабельной области тяжелой цепи и второй аллель вариабельной области тяжелой цепи, где первый аллель и второй аллель принадлежат одной и той же линии мыши. В одном из вариантов осуществления первый аллель относится к первой линии мыши и второй аллель относится ко второй линии мыши. В одном из вариантов осуществления один аллель из первого и второго аллелей содержит замену mVR, по меньшей мере, одной hVR. В другом варианте осуществления оба аллеля содержат замену mVR, по меньшей мере, одной hVR.

В одном из аспектов предлагается генетически модифицированная мышь, где мышь экспрессирует IgM, содержащий домен CH1, и мышь экспрессирует IgG, у которого отсутствует функциональный домен CH1, или которая экспрессирует IgG, у которого отсутствуют как функциональный домен CH1, так и функциональная шарнирная область.

В одном из вариантов осуществления IgG представляет собой IgG1.

В одном из вариантов осуществления мышь экспрессирует четыре IgG, а именно: модифицированный IgG1 и IgG3, IgG2a и IgG2b дикого типа. В другом варианте осуществления мышь экспрессирует не более чем два IgG, а именно: модифицированный IgG1 и IgG3 дикого типа. В конкретном варианте осуществления мышь экспрессирует изотипы тяжелой цепи, а именно: IgM дикого типа, IgD дикого типа, IgG3 дикого типа, модифицированный IgG1, IgG2a дикого типа, IgG2b дикого типа, IgA дикого типа и IgE дикого типа. В другом конкретном варианте осуществления мышь экспрессирует изотипы тяжелой цепи, а именно: IgM дикого типа, IgD дикого типа, IgG3 дикого типа, модифицированный IgG1, IgA дикого типа и IgE дикого типа. В различных вариантах осуществления модификация IgG1 включает делецию домена CH1 и, необязательно, делецию шарнирной области.

В одном из вариантов осуществления мышь относится к линии, выбранной из 129, C56BL/6 и смешанной 129×C57BL/6.

В одном из аспектов предлагается мышь, которая экспрессирует тяжелую цепь антитела, где антитело, имеющее только тяжелую цепь, состоит по существу из димерной тяжелой цепи, где в тяжелой цепи отсутствует функциональный домен CH1 или отсутствуют функциональный домен CH1 и функциональная шарнирная область; тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи млекопитающего, который включает последовательность, не идентичную вариабельному домену тяжелой цепи млекопитающего, который кодируется геном вариабельной области зародышевой линии, и тяжелая цепь содержит домен CH2 человека или мыши и домен CH3 человека или мыши; где мышь экспрессирует IgM дикого типа человека или мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит функциональный генетический локус легкой цепи иммуноглобулина.

В одном из вариантов осуществления вариабельный домен тяжелой цепи млекопитающего представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человека или мыши.

В одном из вариантов осуществления антитело, имеющее только тяжелую цепь, состоит, в основном, из димерной тяжелой цепи, в которой отсутствуют функциональный домен CH1 и функциональная шарнирная область, где тяжелая цепь включает человеческий вариабельный домен, который содержит, по меньшей мере, одну соматическую мутацию, и включает домен CH2 и домен CH3. В конкретном варианте осуществления домен CH2 и домен CH3 независимо выбраны из доменов мыши и человека. В конкретном варианте осуществления домены CH2 и CH3 являются человеческими; в другом варианте осуществления домены CH2 и CH3 являются мышиными.

В одном из аспектов предлагается антитело, имеющее только тяжелую цепь, где антитело, имеющее только тяжелую цепь, содержит тяжелую цепь, включающую не-верблюжий вариабельный домен и константную область тяжелой цепи, в которой отсутствует домен CH1.

В одном из вариантов осуществления у антитела, имеющего только тяжелую цепь, дополнительно отсутствует шарнирная область.

В одном из вариантов осуществления антитело, имеющее только тяжелую цепь, содержит константную область, которая состоит по существу из шарнирной области, домена CH2 и домена CH3. В другом варианте осуществления антитело, имеющее только тяжелую цепь, содержит константную область, которая состоит по существу из домена CH2 и домена CH3.

В одном из вариантов осуществления не-верблюжий вариабельный домен представляет собой соматически мутированный вариабельный домен тяжелой цепи человека или мыши, полученный из нуклеотидной последовательности, кодирующей IgM или IgG, в B-клетке мыши или генетически модифицированной мыши, несущей генный сегмент вариабельной области тяжелой цепи человека. В конкретном варианте осуществления мышь содержит гуманизированный генный сегмент вариабельной области тяжелой цепи. В другом варианте осуществления мышь содержит замену эндогенного локуса генного сегмента вариабельной области тяжелой цепи мыши, по меньшей мере, одним генным сегментом вариабельной области человека. В другом варианте осуществления мышь содержит замену эндогенного локуса тяжелой цепи мыши, по меньшей мере, одним генным сегментом вариабельной области человека, по меньшей мере, одним генным сегментом D человека и, по меньшей мере, одним генным сегментом J человека. В конкретном варианте осуществления эндогенный локус вариабельной области иммуноглобулина мыши полностью или по существу полностью замещен локусом вариабельной области иммуноглобулина человека, содержащим множество генных сегментов V, D и J человека.

В одном из вариантов осуществления не-верблюжий вариабельный домен представляет собой вариабельный домен человека или мыши. В другом варианте осуществления не-верблюжий вариабельный домен представляет собой вариабельный домен человека или мыши, который содержит одну или несколько камелизирующих модификаций. В конкретном варианте осуществления камелизирующая модификация выбрана из L11S, V37F, G44E, L45C, L45R и W47G (нумерация по Kabat). В конкретном варианте осуществления камелизирующая модификация выбрана из V37F, G44E и L45C. В конкретном варианте осуществления вариабельный домен тяжелой цепи включает определяющую комплементарность область 3 (CDR3), которая содержит два цистеина.

В одном из вариантов осуществления антитело, имеющее только тяжелую цепь, содержит димер первой тяжелой цепи, включающей первый вариабельный домен тяжелой цепи, и второй тяжелой цепи, включающей второй вариабельный домен тяжелой цепи, где в каждой из первой и второй тяжелых цепей отсутствует домен CH1 (или отсутствует домен CH1 и шарнирная область). В одном из вариантов осуществления человеческий вариабельный домен первой тяжелой цепи димера связывает первый эпитоп, и человеческий вариабельный домен второй тяжелой цепи димера связывает второй эпитоп, где первый и второй эпитопы не являются идентичными. В конкретном варианте осуществления вариабельные домены тяжелых цепей первой и второй тяжелых цепей содержат вариабельные домены тяжелых цепей человека и/или области FR тяжелой цепи человека, как описано в настоящем документе.

В одном из аспектов предлагается генетически модифицированная не принадлежащая человеку клетка, где генетическая модификация включает делецию домена CH1 IgG, и клетка экспрессирует функциональный IgM. В конкретном варианте осуществления клетка содержит ген IgM, включающий последовательность, кодирующую домен CH1.

В одном из вариантов осуществления клетка выбрана из не принадлежащих человеку эмбриональной стволовой (ES) клетки, плюрипотентной клетки и тотипотентной клетки. В конкретном варианте осуществления не принадлежащая человеку ES клетка выбрана из ES клетки мыши и ES клетки крысы.

В одном из аспектов предлагается генетически модифицированный, не принадлежащий человеку эмбрион, где генетическая модификация включает модификацию, описанную в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация включает делецию домена CH1 IgG, и не принадлежащий человеку эмбрион экспрессирует функциональный IgM. В конкретном варианте осуществления не принадлежащий человеку эмбрион содержит ген IgM, включающий домен CH1.

В одном из вариантов осуществления не принадлежащий человеку эмбрион представляет собой эмбрион мыши или эмбрион крысы.

В одном из аспектов предлагается не принадлежащий человеку эмбрион, содержащий донорскую клетку, где донорская клетка генетически модифицирована, и где генетическая модификация представляет собой модификацию, описанную в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация включает делецию домена CH1 IgG, и клетка содержит ген IgM, включающий домен CH1.

В одном из вариантов осуществления не принадлежащий человеку эмбрион представляет собой эмбрион мыши или эмбрион крысы, и донорская клетка представляет собой ES клетку мыши или ES клетку крысы, соответственно.

В одном из аспектов предлагается конструкция ДНК, где конструкция ДНК содержит (a) мышиное гомологичное плечо, гомологичное первой последовательности 5' и непосредственно примыкающее к началу области CH1 IgG; (b) маркер или кассету для отбора по устойчивости к лекарственному средству; и (c) гомологичное плечо, гомологичное второй последовательности 3' и непосредственно примыкающее к концу области CH1 IgG, или, альтернативно, гомологичное плечо, гомологичное второй последовательности 3' и непосредственно примыкающее к концу шарнирной области IgG.

В одном из аспектов предлагается способ получения антитела, в котором отсутствует домен CH1, включающий: (a) иммунизацию не являющегося человеком животного, как описано в настоящем документе, у которого отсутствует функциональный домен CH1 в IgG или отсутствует функциональный домен CH1 и отсутствует функциональная шарнирная область в IgG, где мышь экспрессирует IgM, который содержит функциональный домен CH1; (b) содержание не являющегося человеком животного в условиях, достаточных для выработки антитела; (c) идентификацию антитела, выработанного мышью, в котором отсутствует функциональный домен CH1 или в котором отсутствует функциональная шарнирная область; и (d) выделение из мыши антитела, клетки, которая вырабатывает антитело, или нуклеотидной последовательности, которая кодирует последовательность антитела.

В одном из вариантов осуществления не являющееся человеком животное содержит генетический локус функциональной легкой цепи иммуноглобулина.

В одном из аспектов предлагается способ для гуманизации мышиного антитела, имеющего только тяжелую цепь, включающий иммунизацию посредством интересующего антигена генетически модифицированной мыши, вырабатывающей антитела, имеющие только тяжелую цепь; возможность для мыши нарастить иммунный ответ; идентификацию у мыши мышиной области VH, которая кодируется в B-клетке мыши, где B-клетка специфически связывает интересующий антиген, и гуманизацию области VH.

В одном из вариантов осуществления генетически модифицированная мышь, которая вырабатывает антитела, имеющие только тяжелую цепь, представляет собой мышь, описанную в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления мышь содержит, по меньшей мере, один генный сегмент mVR, функционально связанный с константным локусом тяжелой цепи, мышь содержит интактный ген IgM и ген IgG, в котором отсутствует домен CH1 или отсутствуют домен CH1 и шарнирный домен. В одном из вариантов осуществления ген IgG представляет собой ген IgG1. В одном из вариантов осуществления ген IgG выбран из IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3 и их сочетания.

В одном из вариантов осуществления способ дополнительно содержит клонирование нуклеотидной последовательности, кодирующей гуманизированную область VH к нуклеотидной последовательности константной области иммуноглобулина человека.

В одном из вариантов осуществления генный сегмент мыши mVR относится к генному семейству VH мыши, выбранному из VH1 и VH14, и гуманизация включает замену каркасной области мыши из VH1 или VH14 каркасной областью из гена человека VH1. В одном из вариантов осуществления ген человека VH1 выбран из 1-2, 1-3, 1-8, 1-17, 1-18, 1-24, 1-45, 1-46, 1-58 и 1-69. В конкретных вариантах осуществления ген mVR представляет собой ген 1-58, и ген человека представляет собой ген 1-18; ген mVR представляет собой ген 1-26, и ген человека представляет собой ген 1-2; ген mVR представляет собой ген 1-50, и ген человека представляет собой ген 1-46; ген mVR представляет собой ген 1-17, и ген человека представляет собой ген 1-2; ген mVR представляет собой ген 1-42, и ген человека представляет собой ген 1-2; ген mVR представляет собой ген 14-1, и ген человека представляет собой ген 1-2; или mVR представляет собой ген 14-2, и ген человека представляет собой ген 1-2.

В одном из вариантов осуществления генный сегмент mVR представляет собой ген мыши VH, выбранный из генов VH4, VH5, VH6, VH7, VH10, VH11 и VH13, и гуманизация включает замену каркасной области мыши каркасной областью из гена человека VH3. В одном из вариантов осуществления ген человека VH3 выбран из 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-35, 3-38, 3-43, 3-48, 3-49, 3-53, 3-64, 3-66, 3-72, 3-73 и 3-74. В конкретном варианте осуществления ген mVR представляет собой ген 7-1, и ген человека представляет собой ген 3-72; ген mVR представляет собой ген 3-6, и ген человека представляет собой ген 4-59; ген mVR представляет собой ген 5-6, и ген человека представляет собой ген 3-21.

В одном из вариантов осуществления генный сегмент mVR относится к генному семейству VH мыши, выбранному из VH3 и VH12, и гуманизация включает замену каркасной области мыши каркасной областью из гена человека VH4. В одном из вариантов осуществления ген человека VH4 выбран из 4-4, 4-28, 4-31, 4-34, 4-39, 4-59 и 4-61.

В одном из вариантов осуществления генный сегмент mVR относится к генному семейству VH4 мыши, и гуманизация включает замену каркасной области мыши каркасной областью из гена человека VH6. В одном из вариантов осуществления ген человека VH6 представляет собой 6-1.

В одном из вариантов осуществления генный сегмент mVR относится к генному семейству VH9 мыши, и гуманизация включает замену каркасной области мыши VH9 каркасной областью из гена VH человека из семейства человека VH7. В одном из вариантов осуществления ген VH человека выбран из 7-4-1 и 7-81.

В одном из вариантов осуществления гуманизация дополнительно содержит создание одной или нескольких консервативных или неконсервативных замен, одной или нескольких делеций и/или одной или нескольких вставок в CDR мыши таким образом, что CDR мыши более соответствует CDR человека.

В одном из вариантов осуществления гуманизация дополнительно включает создание одной или нескольких консервативных или неконсервативных замен, одной или нескольких делеций и/или одной или нескольких вставок в каркасную область человека таким образом, что каркасная область человека более соответствует каркасной области мыши.

В одном из аспектов предлагается генетически модифицированная мышь, которая содержит функциональный ген легкой цепи иммуноглобулина, где мышь