Событие 416 aad-12, родственные линии трансгенной сои и их событиеспецифичная идентификация

Событие 416 aad-12, родственные линии трансгенной сои и их событиеспецифичная идентификация

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Ген aad-12 (первоначально выделенный из Delftia acidovorans) кодирует белок арилоксиалканоатдиоксигеназы (AAD-12). Этот признак сообщает устойчивость к 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте, например, к гербицидам на основе пиридилоксиацетата. Ген aad-12 в качестве гена, сообщающего растениям устойчивость к гербицидам, был впервые описан в публикации заявки WO 2007/053482.

Экспрессия гетерологичных или чужеродных генов в растениях зависит от места введения чужеродного гена в хромосому. Это может быть связано, например, со структурой хроматина (например, гетерохроматина) или с близостью расположения элементов, регулирующих транскрипцию (например, энхансеров), от сайта интеграции (Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988). Один и тот же ген в трансгенном растении (или другом организме) одинакового типа может характеризоваться большой изменчивостью уровня экспрессии по сравнению с другими генами. Кроме того, могут иметь место различия в пространственных или временных паттернах экспрессии. Например, различия в относительной экспрессии трансгена в разных тканях растения могут не соответствовать паттернам, ожидаемым от регулирующих транскрипцию элементов в конструкции введенного гена.

Таким образом, часто приходится создавать и исследовать большое число событий, чтобы идентифицировать событие, экспрессирующее введенный для определенной цели ген на удовлетворительном уровне. Для достижения коммерческих целей обычно продуцируют сотни и тысячи разных событий, чтобы обнаружить единственное событие, характеризующееся требуемыми уровнями и паттернами экспрессии трансгена. Событие, характеризующееся требуемыми уровнями и/или паттернами экспрессии трансгена, имеет важное значение для интрогрессии трансгена в другие генетические среды путем полового ауткроссинга стандартными методами селекции. Потомство таких гибридов сохраняет характеристики экспрессии трансгена первичного трансформанта. Такой метод используют для достижения надежной экспрессии гена в ряде сортов, хорошо адаптированных к местным условиям выращивания.

Заявка на патент США 20090130071 относится к событию сои MON87701 и способам детекции. Заявки на патент США 20090036308 и 20080051288 относятся к событию сои 3560.4.3.5 и способам детекции. Заявка на патент США 20080312082 относится к событию сои DP-305423-1 и способам детекции. Заявка на патент США 20060282915 относится к событию сои MON89788 и способам детекции.

Соя AAD-12, обладающая специфическим событием по настоящему изобретению, ранее не была описана в научной литературе.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к сое AAD-12 (Glycine max) с событием, определяемым как DAS-68416-4, семена которой депонированы в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-10442, и к потомству указанной сои. Другими объектами настоящего изобретения являются растения-потомки, соя, семена и/или регенерируемые части растений, семян и потомков сои с событием DAS-68416-4, а также к пищевым или кормовым продуктам, полученным из указанной сои. Настоящее изобретение также относится к частям растений сои с событием DAS-68416-4, которые включают, не ограничиваясь ими, пыльцу, семяпочку, цветки, побеги, корни и листья, а также ядра вегетативных клеток, клетки пыльцы и яйцеклетки. Настоящее изобретение далее относится к растениям сои, обладающим устойчивостью к феноксиауксиновым и/или арилоксиалканоатным гербицидам (при нанесении указанных гербицидов поверх растений сои, в близлежащую почву или на произрастающие рядом сорняки), к новым генетическим композициям сои с событием DAS-68416-4 и аспектам агрономической продуктивности растений сои, содержащих событие DAS-68416-4.

Настоящее изобретение частично относится к селекции растений и к растениям, устойчивым к гербицидам. Настоящее изобретение относится к новому событию трансформации aad-12 в растениях сои, включающих полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, введенную в определенный сайт генома клетки сои.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное событие/полинуклеотидная последовательность могут быть объединены с другими признаками, включающими, например, другие гены устойчивости к гербицидам и/или инсектицидные белки. Однако настоящее изобретение относится к растениям, содержащим одно событие, рассмотренное в настоящем описании изобретения. В конкретном варианте осуществления изобретения один или несколько признаков устойчивости к гербицидам объединены с событием сои DAS-68416-4 с целью борьбы с разными сорняками, устойчивыми к гербицидам (например, с сорняками, устойчивыми к глифосату).

Кроме того, настоящее изобретение относится к тестам, предназначенным для детекции в образце (например, сои) события по настоящему изобретению. Указанные тесты могут быть выполнены на основе последовательности ДНК рекомбинантной конструкции, введенной в геном сои, и на основе геномных последовательностей, фланкирующих инсерционный сайт. В объем настоящего изобретения также входят наборы и условия для выполнения указанных тестов.

Таким образом, настоящее изобретение частично относится к клонированию и анализу последовательностей ДНК всей вставки AAD-12 и ее краевых областей (в линиях трансгенной сои). Указанные последовательности являются уникальными. На основании указанной вставки и краевых последовательностей были созданы событиеспецифичные затравки. Анализ методом ПЦР показал, что указанные события могут быть идентифицированы в результате анализа ампликонов ПЦР, созданных с использованием наборов событиеспецифичных затравок. Таким образом, указанные и другие методы могут быть использованы для идентификации линий сои, включающих событие по настоящему изобретению.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показана плазмидная карта pDAB4468.

На фиг.2 показана схема геномной ДНК события сои, в которой DAS-68416-4 расщеплен ферментами EcoRV или PvuII и использован для создания соответствующих библиотек GENOMEWALKER™, которые были использованы в качестве матриц для амплификации последовательностей ДНК-мишени.

На фиг.3 показаны положения затравок для подтверждения всей последовательности события DAS-68416-4 сои от 5'- до 3'-концевых краевых областей.

На фиг.4 показаны положения затравок для подтверждения всей последовательности события DAS-68416-4 сои от 5'- до 3'-концевых краевых областей.

На фиг.5 показаны положения затравок для подтверждения последовательности инсерционного сайта события DAS-68416-4 сои AAD-12.

На фиг.6 показаны уровни экспрессии на протяжении жизненного цикла растения.

Краткое описание таблиц

В таблице 1 представлена нумерация остатков в SEQ ID NO:1 вставки и фланкирующих последовательностей для события DAS-68416-4.

В таблице 2 показаны положение и длина зондов, использованных при выполнении анализа методом саузерн-блоттинга.

В таблице 3 представлены прогнозированные и полученные гидбридизирующие фрагменты при выполнении анализа методом саузерн-блоттинга.

В таблице 4 показаны условия скрининга в геноме события DAS-68416-4 сои для амплификации фланкирующих краевых областей.

В таблице 5 показаны условия амплификации стандартным методом ПЦР краевых областей и событиеспецифичных последовательностей в событии DAS-68416-4 сои.

В таблице 6 приведено описание затравок для ампликонов 1-4 вставки Т-цепи.

В таблице 7 показана смесь ПЦР для амплификации стандартным методом ПЦР краевых областей и событиеспецифичных последовательностей в событии DAS-68416-4 сои.

В таблице 8 представлен краткий обзор уровней белка AAD-12 в тканях, полученных из сои с событием DAS-68416-4, выращенной в США и Канаде в 2008 г.

В таблице 9 показаны положение и длина зондов, использованных при выполнении анализа методом саузерн-блоттинга.

В таблице 10 показаны прогнозированные и полученные гибридизирующие фрагменты при выполнении анализа методом саузерн-блоттинга.

В таблице 11 показаны агрономические параметры, оценка которых была произведена в эксперименте 1.

В таблице 12 показаны результаты анализа агрономических характеристик, выполненного в эксперименте 1.

В таблице 13 представлены данные, собранные в результате исследований агрономических признаков и урожайности, выполненных в 2009 г.

В таблице 14 представлен краткий обзор результатов исследования агрономических характеристик на разных участках, выполненного в 2009 г.

В таблице 15 показан анализ заболеваемости и повреждения насекомыми в эксперименте 1.

В таблице 16 представлены стрессоры, вызывающие заболевания и повреждения насекомыми, которые имели место в испытаниях сои с событием DAS-68416-4 и стандартной сои.

В таблице 17 показано прорастание семян сои с событием DAS-68416-4 в теплых и холодных условиях.

В таблице 18 представлен краткий обзор анализа общих показателей, клетчатки и минералов в стеблях сои.

В таблице 19 представлен краткий обзор анализа общих показателей и клетчатки в зерне сои.

В таблице 20 представлен краткий обзор анализа минералов в зерне сои.

В таблице 21 представлен краткий обзор анализа аминокислот в зерне сои.

В таблице 22 представлен краткий обзор анализа жирных кислот в зерне сои.

В таблице 23 представлен краткий обзор анализа витаминов в зерне сои.

В таблице 24 представлен краткий обзор анализа изофлавонов в зерне сои.

В таблице 25 представлен краткий обзор анализа вредных веществ в зерне сои.

В таблице 26 приведена информация об участке и обработке при выполнении довсходовых испытаний устойчивости к гербициду 2,4-D.

В таблице 27 показана устойчивость сои DAS-68416-4 к довсходовому внесению гербицида 2,4-D.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO:1 представляет собой вставку и фланкирующие последовательности для сои с событием DAS-68416-4 по настоящему изобретению.

SEQ ID NO:2-28 представляют собой затравки, рассмотренные в настоящем описании изобретения.

SEQ ID NO:29 и 30 представляют собой маркеры SNP BARC-019093-03299 и BARC-044607-08736 фланкирующих последовательностей, рассмотренные в настоящем описании изобретения.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение частично относится к селекции растений и к растениям, устойчивым к гербицидам. Это изобретение относится к новым событиям трансформации растений сои (сои), которые включают полинуклеотидные последовательности aad-12 по настоящему изобретению, введенные в определенный сайт генома клетки сои. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанная полинуклеотидная последовательность может быть объединена с другими признаками (такими как, другие гены устойчивости к гербицидам и/или гены, кодирующие инсектицидные белки. Однако настоящее изобретение относится к растениям, включающим одно событие, рассмотренное в настоящем описании.

Кроме того, настоящее изобретение относится к тестам, предназначенным для детекции в образце события по настоящему изобретению. Объектами настоящего изобретения являются способы создания и/или продуцирования любых молекул диагностических нуклеиновых кислот, рассмотренных или предложенных в настоящем описании, в частности, молекул нуклеиновых кислот, полностью или частично созданных на основе фланкирующих последовательностей по настоящему изобретению.

В частности, настоящее изобретение частично относится к трансгенной сое, содержащей событие DAS-68416-4, линиям растений, включающим указанные события, клонированию и анализу последовательностей ДНК указанной вставки и/или ее краевых областей. Линии растений по настоящему изобретению могут быть обнаружены с помощью последовательностей, рассмотренных и предложенных в настоящем описании изобретения.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к линиям сои, устойчивой к гербицидам, и их идентификации. Настоящее изобретение частично относится к детекции события по настоящему изобретению с целью определения наличия представляющего интерес события в потомстве, полученном в результате скрещивания. Кроме того, в объем настоящего изобретения входит способ детекции события, соответствующий правилам, требующим предпродажной сертификации и маркировки продуктов, полученных из рекомбинантных сельскохозяйственных культур. Событие по настоящему изобретению можно детектировать любым хорошо известным методом детекции нуклеиновой кислоты, таким как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или гибридизация ДНК с использованием зондов нуклеиновой кислоты. Событиеспецифичный анализ методом ПЦР описан, например, в публикации Windels et al., Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462 (1999). Указанный метод включает идентификацию события 40-3-2 сои, устойчивой к глифосату, с использованием набора затравок, заполняющих место соединения между вставкой и фланкирующей ДНК. В частности, одна затравка включала последовательность из вставки, и вторая затравка включала последовательность из фланкирующей ДНК.

Соя была модифицирована путем введения гена aad-12, выделенного из Delftia acifovorans, который кодирует белок арилоксиалканоатдиоксигеназы (AAD-12). Указанный признак сообщает устойчивость к гербицидам на основе 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и пиридилоксиацетата и может быть использован в качестве селектируемого маркера в процессе трансформации и селекции растений.

В частности, в настоящем изобретении описано событие pDAB4468-0416 сои AAD-12, его отбор и исследование в отношении устойчивости и экспрессии во всем растении и на молекулярных уровнях в разных поколениях.

Синтетический ген (aad-12) по настоящему изобретению, выделенный из Delftia acidovorans, кодирует фермент, способный деактивировать несколько гербицидов, содержащих арилоксиалканоатную часть, включая феноксиауксин (например, 2,4-D, МСРА), а также пиридилоксиауксины (например, флуроксипир, триклопир). Ген aad-12 был введен при помощи промоторов atUbi10 в линию сои Maverick при помощи методов с использованием Agrobacterium tumefaciens. Трансгенные растения Т0 самоопылялись на протяжении 4-6 поколений. Ген aad-12 был параллельно введен в элитные сорта сои. Все трансгенные события исследовали на протяжении 4-5 поколений в полевом питомнике с контролируемыми условиями выращивания и в лаборатории.

Оба конца вставки события pDAB4468-0416 секвенировали и исследовали. Были разработаны событиеспецифичные анализы. Было произведено картирование данного события в геноме сои (хромосома 4 сои); маркеры SNP фланкирующих последовательностей представлены в настоящем описании изобретения как SEQ ID NO:29 и 30. Это событие было введено в другие элитные сорта. Указанное событие сообщает устойчивость к 2,4-D и глюфозинату.

При помощи промотора atUbi10 методами на основе Agtobacterium tumefaciens было создано более 100 событий сои AAD-12 Т1 Maverick. Событие pDAB4468-0416 было отобрано в результате селекции одной линии дифференцировки на протяжении пяти самоопылявшихся поколений и нескольких обратно скрещивающихся поколений. Это событие было морфологически нормальным, и выдерживало воздействие гербицида 2,4-D, используемого в количестве до 2240 г эквивалента кислоты/га для опрыскивания сои на стадии V3 в каждом самоопылявшемся поколении. Указанное событие было наследовано в виде одного доминантного гена, и характеризовалось нормальным менделеевским расщеплением в самоопылявшихся поколениях, а также в поколениях с обратным скрещиванием.

Было установлено, что событие pDAB4468-0416 характеризуется наличием одной вставки в полную транскрипционную единицу растения (PTU). В остове вектора не была обнаружена последовательность гена устойчивости к антибиотикам, и на протяжении нескольких поколений в гомозиготном и гемизиготном состоянии гена aad-12 не было обнаружено сайленсинга гена. Ген aad-12 был экспрессирован на ожидаемых уровнях, соответствующих уровням устойчивости к 2,4-D. Указанное событие устойчиво экспрессировало ген aad-12 на протяжении нескольких поколений и в линиях сиблингов в данном поколении.

Как указано в приведенном выше разделе ”Уровень техники”, введение и интеграция трансгена в геном растения предполагает некоторые случайные события (отсюда название “событие” для данной экспрессируемой инсерции). То есть, в результате применения многих методов трансформации, таких как трансформация, с помощью бактерий Agrobacterium, ”генное ружье” и точечная трансформация, невозможно предсказать, в какое положение в геноме будет введен трансген. Таким образом, идентификация фланкирующей геномной ДНК растения с обеих сторон вставки может иметь важное значение для идентификации растения, имеющего данное инсерционное событие. Например, можно создать затравки для ПЦР, образующие ампликон ПЦР в области соединения вставки с геномом хозяина. Указанный ампликон ПЦР может быть использован для идентификации уникального или отличающегося типа инсерционного события.

Так как ”события” первоначально являются случайными событиями, то в качестве части настоящего изобретения по меньшей мере 2500 семян линии сои, включающей событие, были депонированы, став достоянием общественности без каких-либо ограничений (за исключением патентных прав), в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС), 10802 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Указанный депозит был зарегистрирован в качестве депозита АТСС № РТА-10442. 25 флаконов с семенами Glycine max (событие pDAB4468-0416 сои AAD-12) были депонированы от имени компании Dow AgroScience LLC 22 октября 2009 г. Депозит был проверен 2 ноября 2009 г, и на указанную дату семена были жизнеспособными. Этот депозит был сделан, и будет храниться в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования семян для целей патентной процедуры. Этот депозит будет храниться без каких-либо ограничений в депозитарии АТСС, который является общедоступным депозитарием, в течение 30 лет или в течение пяти лет после самого последнего запроса или в течение эффективного времени действия патента в зависимости от того, какой из указанных периодов времени является наиболее продолжительным, и будет заменен, если станет нежизнеспособным в течение указанного срока.

Депонированные семена являются частью настоящего изобретения. Из указанных семян могут быть выращены растения сои, и такие растения также являются частью настоящего изобретения. Настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК, содержащимся в указанных растениях сои, которые пригодны для детекции указанных растений и их потомства. Методы детекции и наборы по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации любого одного, двух или даже всех трех указанных событий в зависимости от конечной цели исследования.

Определения терминов и примеры, приведенные в настоящем описании, помогут описать, и осуществить настоящее изобретение специалистами в данной области. За исключением особо оговоренных случаев термины имеют общепринятые значения, известные специалистам в соответствующей области. Использована номенклатура оснований ДНК, приведенная в 37 статье Свода федеральных правил, §1.822.

В использованном здесь значении термин ”потомство” означает потомство любого поколения родительского растения, содержащего событие DAS-68416-4 сои AAD-12.

Трансгенное ”событие” получают путем трансформации растительных клеток гетерологичной ДНК, то есть конструкцией нуклеиновой кислоты, включающей представляющий интерес трансген, регенерации популяции растений, полученной в результате инсерции указанного трансгена в геном растения, и отбора конкретного растения, характеризующегося наличием инсерции в определенном положении в геноме. Термин ”событие” относится к первичному трансформанту и потомству указанного трансформанта, включающему гетерологичную ДНК. Термин ”событие” также относится к потомству, полученному в результате ауткроссинга трансформанта с другим сортом, включающим геномную/трансгенную ДНК. Даже после повторного обратного скрещивания с родительской формой, с которой гибрид скрещивается вновь, введенная трансгенная ДНК и фланкирующая геномная ДНК (геномная/трансгенная ДНК) из трансформированной родительской формы присутствует в потомстве гибрида в том же положении в хромосоме. Термин ”событие” также относится к ДНК первичного трансформанта и его потомства, включающего введенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность рядом с введенной ДНК, которые должны быть переданы потомству, включая представляющий интерес трансген, в результате скрещивания одной родительской формы, включающей введенную ДНК (например, первичный трансформант и потомство, полученное в результате самоопыления), с родительской формой, не содержащей введенную ДНК.

“Соединительная последовательность” заполняет участок, на котором ДНК, введенная в геном, связывается с ДНК нативного генома сои, фланкирующей участок инсерции, при этом для диагностики события достаточно идентифицировать или детектировать одну или несколько соединительных последовательностей в генетическом материале растения. К таким последовательностям относятся последовательности ДНК, заполняющие места вставки событий сои по настоящему изобретению, и фланкирующие ДНК одинаковой длины. В настоящем описании приведены конкретные примеры таких диагностических последовательностей; однако, другие последовательности, которые перекрывают места соединения инсерций или места соединения инсерций и геномной последовательности, также являются диагностическими, и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение относится к идентификации таких фланкирующих, соединительных и вставочных последовательностей. В объем настоящего изобретения входят соответствующие затравки и ампликоны ПЦР. В соответствии с настоящим изобретением для детекции или идентификации промышленных сортов трансгенной сои или линий, выделенных из линий трансгенной сои, являющихся частной собственностью, могут быть использованы методы ПЦР с применением ампликонов, расположенных рядом с введенной ДНК и ее краевыми последовательностями.

В процессе введения вставки в геном растительных клеток могут произойти некоторые делеции или другие изменения вставки и/или геномных фланкирующих последовательностей. Таким образом, соответствующий сегмент последовательности плазмиды может включать некоторые незначительные изменения. То же самое верно для фланкирующих последовательностей по настоящему изобретению. Так, в объем настоящего изобретения входит растение, включающее полинуклеотид, характеризующийся некоторой степенью идентичности с фланкирующими и/или вставочными последовательностями. Последовательность по настоящему изобретению может быть полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% и более предпочтительно по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична последовательности, приведенной или рассмотренной в настоящем описании. Гибридизация и условия гибридизации по настоящему изобретению также могут быть использованы для определения таких растений и полинуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению. Фланкирующие последовательности и вставочная последовательность могут быть подтверждены со ссылкой на депонированные семена.

Полные последовательности всех указанных вставок наряду с частями соответствующих фланкирующих последовательностей представлены в настоящем описании изобретения в виде SEQ ID NO:1. Координаты вставочной и фланкирующих последовательностей данного события, относящегося к SEQ ID NO:1 (всего 10212 пар оснований), приведены ниже в таблице 1. Этот вопрос более подробно рассмотрен в примере 3.

Таблица 1Нумерация остатков вставочной и фланкирующих последовательностей события DAS-68416-4 в SEQ ID NO:1
	5'-концевая фланкирующая последовательность	Вставка	3'-концевая фланкирующая последователь-ность
Номера остатков (SEQ ID NO:1)	1-2730	2731-9121	9122-10212
Длина (п.о.)	2730 п.о.	6391 п.о.	1091 п.о.

Указанные последовательности (в частности, фланкирующие последовательности) являются уникальными. На основании указанной вставочной и краевых последовательностей были созданы событиеспецифичные затравки. Анализ методом ПЦР показал, что указанные линии сои могут быть идентифицированы в разных генотипах сои путем анализа ампликонов ПЦР, созданных при помощи наборов событиеспецифичных затравок. Таким образом, для идентификации указанных линий сои могут быть использованы вышеуказанные и другие родственные методы. Последовательности, идентифицированные указанными методами, являются уникальными.

Методы детекции по настоящему изобретению особенно полезны в сочетании с селекцией растений для определения потомства растений, включающего это событие, которое было получено после скрещивания родительского растения, включающего представляющее интерес событие, с другой линией растений с целью сообщения указанному потомству одного или нескольких дополнительных признаков. Указанные методы ПЦР позволяют эффективно разрабатывать программы селекции сои и контролировать качество, в частности, промышленных семян трансгенной сои. В настоящее время также могут быть созданы, и использованы наборы для детекции методом ПЦР указанных линий трансгенной сои. Указанные методы также позволяют регистрировать, и хранить продукты.

Кроме того, фланкирующие/геномные последовательности сои могут быть использованы для специфической идентификации положения каждой вставки в геноме. Такая информация может быть использована для создания систем молекулярных маркеров, специфичных к каждому событию. Указанные последовательности могут быть использованы для ускоренной селекции и получения данных о сцеплении генов.

Информация о фланкирующих последовательностях может быть далее использована для изучения и исследования процессов интеграции трансгенов, определения сайтов для интеграции трансгенов в геноме, сортировки событий, определения устойчивости трансгенов и их фланкирующих последовательностей и экспрессии генов (особенно в отношении сайленсинга генов, паттернов метилирования трансгенов, влияния положения и возможных элементов, определяющих экспрессию, таких как MAR [области присоединения матрицы] и тому подобных).

В свете настоящего описания должно быть ясно, что в объем настоящего изобретения входят семена, депонированные в АТСС под номером РТА-10442. Настоящее изобретение также относится к растению сои, устойчивому к гербицидам, выращенному из семени, депонированного в АТСС под номером доступа РТА-10442. Настоящее изобретение далее относится к частям указанного растения, таким как листья, образцы тканей, семена, произведенные указанным растением, пыльца и тому подобные.

Настоящее изобретение далее относится к потомству растений, выращенных из депонированных семян, предпочтительно к растению сои, устойчивому к гербицидам, геном которого включает обнаруживаемую последовательность, соединяющую геномную ДНК дикого типа и вставочную ДНК по настоящему изобретению. В использованном здесь значении термин ”соя” означает Glycine max, и в определение данного термина входят все сорта, которые могут быть получены в результате селекции растения сои.

Настоящее изобретение далее относится к способам получения гибридов при использовании растения по настоящему изобретению в качестве по меньшей мере одной родительской формы. Например, настоящее изобретение относится к гибридному растению F₁, имеющему в качестве одной или обеих родительских форм любые растения по настоящему изобретению. Кроме того, в объем настоящего изобретения входит семя, произведенное такими гибридами F₁ по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способу получения семени гибрида F₁ путем скрещивания указанного растения с другим (например, инбредной родительской линией) растением и получения гибридного семени. Настоящее изобретение относится к указанному растению, которое является материнской или отцовской родительской формой. Характеристики полученных растений могут быть улучшены в результате тщательного отбора родительских растений.

Растение сои, устойчивой к гербицидам, может быть получено в результате первоначального скрещивания первого родительского растения сои, выращенного из семени любой линии по настоящему изобретению, и второго родительского растения сои, что позволяет получить множество растений первого потомства; отбора растения первого потомства, устойчивого к гербицидам (или содержащего по меньшей мере одно из событий по настоящему изобретению); самоопыления растения первого потомства, что позволяет получить множество растений второго потомства; и отбора из растений второго потомства одного растения, устойчивого к гербициду (или содержащего по меньшей мере одно из событий по настоящему изобретению). Указанные стадии могут далее включать обратное скрещивание растения первого потомства или растения второго потомства со вторым родительским растением сои или третьим родительским растением сои. Затем могут быть посеяны семена сои по настоящему изобретению или их потомство.

Следует также отметить, что могут быть скрещены два разных трансгенных растения с целью получения потомства, содержащего два независимо добавленных экзогенных гена. В результате самоопыления соответствующего потомства могут быть получены растения, которые являются гомозиготными для обоих добавленных экзогенных генов. В объем настоящего изобретения также входит обратное скрещивание родительского растения и ауткроссинг с нетрансгенным растением в качестве вегетативного размножения. В данной области известны другие методы селекции, обычно используемые для сообщения растениям разных признаков и получения сельскохозяйственных культур. Селекцию методом обратного скрещивания используют для переноса генов с целью создания наследственного и хорошо наследуемого признака в требуемом гомозиготном культиваре или инбредной линии, являющейся родительской формой, с которой гибрид скрещивается вновь. Источник передаваемого признака именуется родителем-донором. Предполагается, что полученное растение должно иметь признаки родительской формы, с которой гибрид скрещивается вновь (то есть культивара) и требуемый признак, перенесенный от родителя-донора. После первичного скрещивания отбирают растения, обладающие фенотипом родителя-донора, и повторно скрещивают (обратное скрещивание) с родительской формой, с которой гибрид скрещивается вновь. Предполагается, что полученная родительская форма должна иметь признаки родительской формы, с которой гибрид скрещивается вновь (например, культивара) и требуемый признак, перенесенный от родителя-донора.

Молекулы ДНК по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров при осуществлении метода селекции с использованием маркеров (МАВ). Молекулы ДНК по настоящему изобретению (такие как маркеры AFLP, маркеры RFLP, маркеры RAPD, SNP и SSR) могут быть использованы в методах, позволяющих идентифицировать генетически связанные агрономически полезные признаки, известные в данной области. Признак устойчивости к гербицидам может быть прослежен в потомстве гибрида растения сои по настоящему изобретению (или в его потомстве и в любом другом культиваре или сорте сои) с помощью методов МАВ. Молекулы ДНК являются маркерами данного признака, и методы МАВ, хорошо известные в данной области, могут быть использованы для отслеживания признака устойчивости к гербицидам в растениях сои, если по меньшей мере одна линия сои по настоящему изобретению или ее потомство было родителем или предком. Способы по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации любого сорта сои, имеющего событие по настоящему изобретению.

Способы по настоящему изобретению включают получение растения сои, устойчивого к гербицидам, путем селекции растения по настоящему изобретению. В частности, указанные способы могут включать скрещивание двух растений по настоящему изобретению или одного растения по настоящему изобретению и любого другого растения. Предпочтительные способы далее включают отбор потомства указанного гибрида путем исследования потомства в отношении наличия события, обнаруживаемого методами по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение может быть использовано для отслеживания события по настоящему изобретению на протяжении нескольких циклов селекции растений, включающих другие требуемые признаки, в частности, агрономические признаки, анализируемые в разных примерах, приведенных в настоящем описании изобретения. Растения, включающие событие по настоящему изобретению и требуемый признак, например, могут быть обнаружены, идентифицированы, отобраны, и быстро использованы в последующих циклах селекции. Событие по настоящему изобретению/признак могут быть также объединены в процессе селекции, и отслежены в соответствии с настоящим изобретением наряду с признаком устойчивости к воздействию насекомых и/или другими признаками устойчивости к гербицидам. Один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к растению, включающему событие по настоящему изобретению, объединенное с геном, кодирующим устойчивость к гербициду дикамба.

Таким образом, настоящее изобретение может быть, например, объединено с признаками, кодирующими устойчивость к глифосату (например, устойчивые растительные и бактериальные гены EPSPS, GOX, GAT), устойчивость к глюфозинату (например, Pat, bar), устойчивость к гербициду, ингибирующему ацетолактат-синтазу (ALS) (например, имидазолиноны [такие как имазетапир], сульфонилмочевины, триазолопиримидинсульфонанилид, пиримидинилтиобензоат и другие химические вещества [Csrl, SurA и т.д.]), устойчивость к бромоксинилу (например, Bxn), устойчивость к ингибиторам фермента HPPD (4-гидроксифенилпируват-диоксигеназа), устойчивость к ингибиторам фитоендезатуразы (PDS), устойчивость к гербицидам, ингибирующим фотосистему II (например, psbA), устойчивость к гербицидам, ингибирующим фотосистему I, устойчивость к гербицидам, ингибирующим протопорфириногеноксидазу IX (РРО) (например, РРО-1), устойчивость к гербицидам на основе фенилмочевины (например, CYP76B1), ферменты, расщепляющие гербицид дикамба (см., например, заявку на патент США 20030135879), и другими, которые могут быть использованы отдельно или в разных комбинациях, обеспечивая эффективное уничтожение или предотвращение распространения сорняков и/или устойчивость к любому гербициду вышеуказанных классов.

Что касается дополнительных гербицидов, то в качестве некоторых дополнительных предпочтительных ингибиторов ALS (известных также как AHAS) можно указать триазолопиримидинсульфонанилиды (такие как клоранзулам-метил, диклозулам, флоразулам, флуметзулам, метозулам и пеноксзулам), пиримидинилтиобензоаты (такие как биспирибак и пиритиобак) и флукарбазон. Некоторые предпочтительные ингибиторы HPPD включают мезотрион, изоксафлутол и сулкотрион. Некоторые предпочтительные ингибиторы РРО включают флумиклорак, флумиоксазин, флуфенпир, пирафлуфен, флутиацет, бутафенацил, карфентразон, сулфентразон и простые дифениловые эфиры (такие как ацифлуорфен, фомесафен, лактофен и окстифлуорфен).

Кроме того, AAD-12 отдельно или в сочетании с одним или несколькими дополнительными признаками НТС может быть объединен с одним или несколькими дополнительными первичными признаками (такими как, например, устойчивость к воздействию насекомых, устойчивость к грибам, устойчивость к стрессу и т.д.) или вторичными признаками (такими как, например, более высокая урожайность, лучший профиль выхода масла, лучшее качество клетчатки и т.д.). Таким образом, настоящее изобретение может быть использовано для создания полного агрономического набора улучшенных качеств культуры с возможностью гибкой и экономически эффективной борьбы с целым рядом сельскохозяйственных вредителей.

Фермент AAD-12 по настоящему изобретению делает возможной экспрессию трансгена, определяющую устойчивость к комбинациям гербицидов, которые уничтожают почти все широколистные и травянистые сорняки. AAD-12 может быть великолепным признаком устойчивости культуры к гербициду (HTC), объединяемым с