Комбинированное применение белков cry1da и cry1fa для вырабатывания резистентности к насекомым

Комбинированное применение белков cry1da и cry1fa для вырабатывания резистентности к насекомым

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предшествующий уровень техники

Человек выращивает кукурузу для употребления в пищу и для энергетических целей. Человек также выращивает множество других культур, включая сою и хлопок. Насекомые поедают и повреждают растения, и тем самым наносят ущерб деятельности человека. Для борьбы с насекомыми-вредителями ежегодно тратятся миллиарды долларов, и еще миллиарды уходят на возмещение ущерба, наносимого этими вредителями. Инсектициды, синтезированные методами органической химии, являются главным инструментом, используемым для борьбы с насекомыми-вредителями, но в некоторых регионах, в борьбе с насекомыми-вредителями важную роль играют биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, происходящие от Bacillus thuringiensis (Bt). Возможность культивировать резистентные к насекомым растения посредством трансформации этих растений генами инсектицидных белков Bt явилась революцией в современном сельском хозяйстве и доказала важность и ценность инсектицидных белков и их генов.

Некоторые белки Bt были использованы для создания резистентных к насекомым трансгенных растений, которые успешно прошли испытания, и в настоящее время их производят в промышленном масштабе. Такими белками являются Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F и Cry3Bb, вводимые в кукурузу, Cry1Ac и Cry2Ab, вводимые в хлопчатник, и Cry3A, вводимый в картофель.

Коммерчески доступные продукты, экспрессирующие эти белки, экспрессируют только один из этих белков, за исключением случаев, когда желательно получить комбинированный инсектицидный спектр из 2 белков (например, в кукурузе, Cry1Ab и Cry3Bb объединены для вырабатывания резистентности к чешуекрылым вредителям и корневым личинкам, соответственно), или случаев, когда независимое действие этих белков делает их ценным инструментом для замедления развития резистентности к инсектицидам у восприимчивых популяций насекомых (например, Cry1Ac и Cry2Ab в хлопчатнике объединяют в целях вырабатывания у растений резистентности к табачной листовертке).

То есть, некоторые сорта резистентных к насекомым трансгенных растений, которые быстро и повсеместно адаптируются к этой технологии, также имеют тот недостаток, что популяции вредителей вырабатывают резистентность к инсектицидным белкам, продуцируемым этими растениями. Было предложено несколько стратегий для сохранения ценных признаков резистентности к Bt-насекомым, где указанные стратегии включают использование в высоких доз белков в комбинации с сохранением площадей «убежищ» нетрансгенных растений, и чередования или совместного использования различных токсинов (McGaughey et al.(1998), «Bt-Resistance Management» Nature Biotechnol. 16: 144-146).

Необходимо, чтобы белки, отобранные для использования в IRM-кластерах, обладали независимым инсектицидным действием, при котором резистентность, вырабатываемая к одному белку, не распространялась на другой белок (то есть, не наблюдалась перекрестная резистентность к белкам). Так, например, если популяция насекомых, выбранных на резистентность к «белку А», является восприимчивой к «белку В», то можно сделать вывод, что в данном случае перекрестная резистентность отсутствует, и комбинация «белок А и белок В» будет эффективной для замедления вырабатывания резистентности к одному белку А.

В случае отсутствия популяции резистентных насекомых, оценка может быть сделана исходя из других характеристик, которые, как предполагается, относятся к механизму действия и возможной перекрестной резистентности. Было высказано предположение, что применение опосредуемого рецептором связывания при идентификации инсектицидных белков, очевидно, не будет приводить к вырабатыванию перекрестной резистентности. (van Mellaert et al. 1999). Ключевым прогностическим фактором отсутствия перекрестной резистентности, появляющейся при таком подходе, является то, что инсектицидные белки не конкурируют за связывание с рецепторами у восприимчивых видов насекомых.

В случае, когда два токсина Bt конкурируют за связывание с одним и тем же рецептором, и если этот рецептор мутирует у насекомого так, что один из токсинов больше не связывается с этим рецептором, а поэтому не обладает инсектицидным действием против насекомого, то такое насекомое может приобретать резистентность ко второму токсину (который конкурентно связывается с тем же рецептором). То есть, можно сказать, что такое насекомое будет обладать перекрестной резистентностью к обоим токсинам Bt. Однако, если два токсина связываются с двумя различными рецепторами, то это означает, что такое насекомое не обладает одновременной резистентностью к этим двум токсинам.

Cry1Fa может быть использован для борьбы с чешуекрылыми вредителями многих видов, включая Европейского кукурузного пилильщика (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) и совку травяную (FAW; Spodoptera frugiperda), и обладает активностью против свекловичного пилильщика (SCB; Diatraea saccharalis). Белок Cry1Fa, продуцирующийся в растениях кукурузы, содержащих модификацию TC1507, ответственен за вырабатывание признака резистентности к насекомым, и этот белок применяется в ведущих областях промышленности для борьбы с совкой травяной (FAW). Cry1Fa также используется в продуктах Herculex^®, SmartStax™ и WideStrike™.

Возможность проводить исследование на связывание с рецептором (конкурентное или гомологичное) с использованием белка Cry1Fa имеет определенные ограничения, поскольку при применении большинства методов мечения белков для детектирования в анализах на связывание с рецептором происходит инактивация инсектицидной активности белка Cry1Fa.

Дополнительные токсины Cry перечислены на web-сайте офиса Комитета по номенклатуре B.t. (Crickmore et al; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). См. Приложение А в данной заявке. В настоящее время известно примерно 60 основных групп токсинов «Cry» (Cry1-Cry59), и кроме того, существуют другие токсины, такие как токсины Cyt и токсины VIP и т.п. Многие токсины из каждой пронумерованной группы имеют подгруппы, обозначенные прописными буквами, а подгруппы, обозначенные прописными буквами, в свою очередь, подразделяются на подгруппы (суб-подгруппы), обозначенные строчными буквами (например, Cry1 имеет подгруппу A-L, а Cry1A имеет подгруппу a-i).

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение частично основано на неожиданном обнаружении того факта, что популяция травяной совки (Spodoptera frugiperda; FAW), отобранная на резистентность к инсектицидной активности белка Cry1Fa, не является резистентной к инсектицидной активности белка Cry1Ca. Для специалиста в данной области очевидно, что преимущество такого открытия состоит в том, что растения, экспрессирующие эти два инсектицидных белка или их инсектицидные части, могут быть использованы для замедления или предупреждения развития резистентности к любому из этих отдельно взятых инсектицидных белков.

Настоящее изобретение также подтверждено обнаружением того факта, что Cry1Fa и Cry1Da не конкурируют друг с другом за связывание с кишечными рецепторами совки травяной (FAW).

Настоящее изобретение также относится, в частности, к трехкомпонентным кластерам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, где токсины Cry1Fa и Cry1Da представляет собой базовую пару. Одна из предпочтительных пирамид включает по меньшей мере два белка, не обладающих перекрестной резистентностью к двум вредителям - к FAW и к ECB (Европейскому кукурузному пилильщику; Ostrinia nubilalis); Cry1Fa плюс Cry1Da плюс один или несколько анти-ECB токсинов, таких как Cry1Ab. В некоторых предпочтительных вариантах пирамиды, выбранные токсины обладают тремя различными механизмами действия против FAW. Этими предпочтительными пирамидными комбинациями с «тремя механизмами действия» являются Cry1Fa плюс Cry1D плюс другой токсин/ген, выбранный из группы, состоящей из Vip3Ab, Cry1C, Cry1Be и Cry1E. Растения (и посевные площади, засеянные такими растениями), которые продуцируют эти три токсина, входят в объем настоящего изобретения. Могут быть также добавлены дополнительные токсины/гены, но эти конкретные трехкомпонентные кластеры, в соответствии с настоящим изобретением, будут, как неожиданно было обнаружено, преимущественно действовать против FAW по трем механизмам. Это поможет снизить или вообще избежать потребности в площадях-«убежищах» нетрансгенных культур. В общих чертах, настоящее изобретение также относится к применению трех инсектицидных белков (в некоторых предпочтительных вариантах, белков Cry), которые не конкурируют друг с другом против одного вредителя-мишени.

Таким образом, Cry1Da может быть использован в виде комбинации из 3 генов для кукурузы и других растений (например, хлопчатника и сои). Ген Cry1Da может быть введен, например, в продукт Cry1Fa, такой как Herculex^®, Smarts tax™ и Wides Strike™. В соответствии с этим, использование Cry1Da может иметь важное значение для снижения давления отбора на другие промышленные белки.

Краткое описание графического материала

Фигура 1: Повреждение (средний % повреждения листьев + ср.кв.ош.) сегментов листьев кукурузы, пораженных FAW (синие столбцы) или rFAW (пурпурные столбцы). Все обрабатываемые образцы, перед которым стоят числа «5163», представляют собой сегменты от растений, трансформированных конструкцией, содержащей Cry1Da. Растения, в которых не была детектирована экспрессия Cry1Da, были разделены на группы, указанные в левой крайней части графика. Растения, в которых детектировалась экспрессия Cry1Da, были разделены на группы, указанные в центральной части графика. Нетрансгенный (то есть, негативный) контроль указан в крайней правой части графика и обозначен «B104», «Hill» и «Isoline». Коммерчески доступная инбредная линия, содержащая Cry1Fa, представлена первым обработанным образцом, указанным справа (обозначен «Herculex I») и является тем же самым генетическим фоном, как и нетрансгенный контроль, обозначенный «Isoline».

Фигура 2: Конкурирование за связывание BBMV Spodoptera frugiperda с белком, содержащим коровый токсин Cry1Fa, коровый токсин Cry1Da и ¹²⁵I-меченный коровый токсин Cry1Da.

Подробное описание изобретения

Как сообщается в настоящей заявке, токсин Cry1Da, продуцируемый в трансгенной кукурузе (и в других растениях например, в хлопчатнике и сое), обнаруживает высокую эффективность в борьбе против совки травяной (FAW; Spodoptera frugiperda), у которой вырабатывается резистентность к активности Cry1Fa. Таким образом, настоящее изобретение частично основано на неожиданном обнаружении того факта, что совка травяная, резистентная к действию Cry1Fa, является восприимчивой (то есть, не обладает перекрестной резистентностью) к действию Cry1Da.

Настоящее изобретение также частично основано на неожиданном обнаружении того факта, что токсин Cry1Da является эффективным для защиты растений (таких как растения кукурузы) от поражения Cry1Fa-резистентной совки травяной. Обсуждение этого вредителя приводится, например, в публикации Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 no. 49, 19029-19030.

Настоящее изобретение включает применение токсина Cry1Da для защиты кукурузы и других экономически ценных видов растений от поражения вредителями и снижения урожайности, вызываемого поеданием этих растений совкой травяной или популяциями совки травяной, у которых вырабатывается резистентность к Cry1Fa.

Настоящее изобретение также относится к кластеру IRM, используемому для предупреждения или замедления развития резистентности совки травяной к Cry1Fa и/или Cry1Da.

Настоящее изобретение также относится к композициям, используемым для борьбы с чешуекрылыми вредителями, в клетках которых продуцируется белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, и белок, содержащий коровый токсин Cry1Da.

Настоящее изобретение также относится к хозяину, трансформированному так, чтобы он продуцировал белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, и белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, где указанным хозяином является клетка микроорганизма или растения. Рассматриваемый полинуклеотид Cry1Fa и рассматриваемый полинуклеотид Cry1Da предпочтительно присутствуют в генетической конструкции под контролем промотора, не являющегося промотором Bacillus thuringiensis (функционально присоединены к этому промотору/содержат этот промотор). Рассматриваемые полинуклеотиды могут содержать обычно встречающиеся в этом растении кодоны, способствующие повышению уровня экспрессии в растении.

Настоящее изобретение также относится к способу борьбы с чешуекрылыми вредителями, включающему контактирование указанных вредителей или среды их обитания с эффективным количеством композиции, содержащей белок, включающий коровый токсин Cry1Fa, а также белок, включающий коровый токсин Cry1Da.

В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к растению кукурузы, включающему экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, и экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, и к семенам такого растения.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к растению кукурузы, где экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, и экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, были введены в указанные растения кукурузы и в семена таких растений путем интрогрессии.

Рецепторы насекомых. Как описано в примерах, исследование на конкурентное связывание с рецептором, проводимое с использованием радиоактивно меченного белка корового токсина Cry1Da, показало, что этот белок корового токсина Cry1Fa не конкурирует за высокоаффинное связывание с сайтом, присутствующим в тканях насекомого FAW, с которым связывается Cry1Da. Эти результаты показали, что комбинация белков Cry1Fa и Cry1Da представляет собой эффективное средство для ослабления вырабатывания резистентности у популяции FAW к Cry1Fa (и аналогично, для ослабления вырабатывания резистентности к Cry1Da), а также для повышения уровня резистентности растений кукурузы, экспрессирующих оба эти белка, к указанному вредителю.

Таким образом, частично на основе данных, описанных выше, и данных, представленных в литературе, можно сделать вывод, что совместное продуцирование (в виде кластера) белков Cry1Da и Cry1Fa может быть применено для получения высокой дозы IRM-кластера, используемого для борьбы с FAW. В эту комбинацию могут быть добавлены и другие белки для расширения спектра уничтожаемых насекомых-вредителей. Так, например, для кукурузы, добавление Cry1Ab позволит создать IRM-пирамиду, используемую для борьбы с европейским кукурузным пилильщиком.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к применению одного или двух белков Cry1Fa и Cry1Da в комбинации с другим третьим токсином/геном, и к применению этого трехкомпонентного кластера для ослабления вырабатывания резистентности у FAW к любому из этих токсинов. Таким образом, в другом своем варианте, настоящее изобретение относится к применению одного, двух или трех (или более) из этих белков в сельскохозяйственных регионах, где FAW может развиваться в резистентные популяции. В соответствии с этим, настоящее изобретение также частично относится к «трехкомпонентным кластерам» или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, где токсины Cry1Fa и Cry1Da представляют собой базовую пару. Одна из предпочтительных пирамид включает по меньшей мере два белка, не обладающих перекрестной резистентностью к двум вредителям - к FAW и к ECB (Европейскому кукурузному пилильщику; Ostrinia nubilalis); Cry1Fa плюс Cry1Da плюс один или несколько анти-ECB токсинов, таких как Cry1Ab (см. заявку США 20080311096), поскольку Cry1F обладает активностью против обоих насекомых. Другими токсинами против ЕСВ являются Cry1Be (см. заявку США рег. №61/284290, поданную 16 декабря, 2009), Cry1I (см. заявку США рег. №61/284278, поданную 16 декабря, 2009), Cry2Aa (см. заявку США рег .№61/284278, поданную 16 декабря 2009) и DIG-3 (см. заявку США 201000269223). В некоторых предпочтительных вариантах «пирамиды», выбранные токсины обладают тремя различными механизмами действия против FAW. Такими предпочтительными пирамидными комбинациями с «тремя механизмами действия» являются Cry1Fa плюс Cry1D плюс другой токсин/ген, выбранный из группы, состоящей из Vip3Ab, Cry1C (см. заявку США рег. №61/284281, поданную 16 декабря, 2009), Cry1Be и Cry1E (см. заявку США рег. №61/284278, поданную 16 декабря 2009). Растения (и посевные площади, засеянные такими растениями), которые продуцируют эти три токсина, входят в объем настоящего изобретения. Могут быть также добавлены дополнительные токсины/гены, и эти конкретные трехкомпонентные кластеры, в соответствии с настоящим изобретением, будут, как неожиданно было обнаружено, преимущественно действовать против FAW по трем механизмам. Это поможет снизить или избежать потребности в площадях-«убежищах» нетрансгенных культур. Таким образом, в настоящем изобретении рассматривается поле, засеянное культурами на площади свыше 10 акров.

Таким образом, Cry1Da может быть использован в виде комбинации из 3 генов для кукурузы, которая в настоящее время находится на стадии Исследования I процесса вырабатывания новых признаков. Cry1Fa присутствует в продуктах Herculex^®, Smartstax™ и WidesStrike™. В соответствии с этим, использование Cry1Da может иметь важное значение для снижения давления отбора на другие промышленные белки.

Другие токсины, например, Vip3, перечислены в Приложении A. Эти номера GENBANK могут быть также использованы для идентификации последовательностей любых описанных и упомянутых здесь генов и белков.

В патенте США No. 5188960 и в патенте США No. 5827514 описаны белки, которые содержат коровый токсин Cry1Fa, и которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. В патенте США № 6218188 описаны оптимизированные для растения последовательности ДНК, кодирующие белки, которые содержат коровый токсин Cry1Fa, и которые могут быть использованы в настоящем изобретении.

Комбинации токсинов, описанных в настоящем изобретении, могут быть использованы для борьбы с чешуекрылыми вредителями. Взрослые чешуекрылые, например, бабочки и моли, питаются, главным образом, нектаром и играют значительную роль в опылении. Почти все личинки чешуекрылых, то есть, гусеницы, поедают растения, и многие из них являются опасными вредителями. Гусеницы живут на листьях или поедают внутреннюю часть листьев, либо они повреждают корни или стебли растения, что приводит к истощению питательных веществ у растения, и в большинстве случаев, к разрушению основной физической структуры растения. Кроме того, гусеницы повреждают плоды, ткани и хранящееся зерно и муку, в результате чего продукты либо вообще становятся непригодными для продажи, либо их коммерческая ценность значительно снижается. Используемый здесь термин «чешуекрылые вредители» также относится к различным стадиям жизненного цикла вредителя, включая стадии развития личинок.

Некоторые химерные токсины согласно изобретению содержат полноразмерную часть N-концевого корового токсина Bt, и в определенном положении, расположенном за частью корового токсина, этот белок переходит в гетерологичную последовательность протоксина. N-концевая, инсектицидно активная часть токсина Bt называется «коровым токсином». Переход от корового сегмента токсина в гетерологичный сегмент протоксина может происходить приблизительно в области стыка токсин/протоксин, или альтернативно, часть нативного протоксина (простирающаяся за пределы коровой части токсина) может сохраняться, причем, переход в гетерологичную часть протоксина может происходить ниже.

Одним из примеров может служить один химерный токсин согласно изобретению, который представляет собой полноразмерную часть корового токсина Cry1Fa (аминокислоты 1-601) и гетерологичный протоксин (аминокислоты от положения 602 до С-конца). В одном предпочтительном варианте изобретения, часть химерного токсина, содержащая протоксин, происходит от токсина белка Cry1Ab. Вторым примером может служить второй химерный токсин согласно изобретению, который представляет собой часть полноразмерного корового токсина Cry1Da (аминокислоты 1-619) и гетерологичный протоксин (аминокислоты от положения 620 до С-конца). В предпочтительном варианте изобретения, часть химерного токсина, содержащая протоксин, происходит от токсина белка Cry1Ab.

Для специалистов в данной области очевидно, что токсины Bt, даже токсины, принадлежащие к определенному классу, такому как Cry1F, могут до некоторой степени варьироваться по своей длине и точной локализации перехода от части корового токсина в часть протоксина. Обычно, токсины Cry1Da и Cry1Fa имеют длину примерно от 1150 до 1200 аминокислот. Переход от части корового токсина в часть протоксина обычно происходит на участке между частями, составляющими примерно от 50% и примерно до 60% от всей длины токсина. Химерный токсин согласно изобретению включает полноразмерную область этой N-концевой части корового токсина. Таким образом, химерный токсин содержит по меньшей мере примерно 50% полноразмерного белка Cry1Fa токсина Bt или по меньшей мере примерно 50% полноразмерного белка токсина Bt Cry1Da. Этот белок имеет длину, обычно составляющую по меньшей мере примерно 590 аминокислот. Что касается части протоксина, то полноразмерная область части протоксина Cry1Ab простирается от конца части корового токсина до С-конца молекулы.

Гены и токсины. Гены и токсины, используемые в настоящем изобретении, включают не только описанные здесь полноразмерные последовательности, но также и фрагменты этих последовательностей, варианты, мутанты и гибридные белки, которые сохраняют характерную пестицидную активность токсинов, конкретно описанных в настоящей заявке. Используемые здесь термины «варианты» или «модификации» генов означают нуклеотидные последовательности, которые кодируют те же самые токсины или токсины, эквивалентные токсинам, обладающим пестицидной активностью. Используемый здесь термин «эквивалентные токсины» означает токсины, обладающие такой же или, по существу, такой же биологической активностью против вредителей-мишеней, как и заявленные токсины.

Используемые здесь пределы идентичности составляют приблизительно 95% (Cry1Fa и Cry1Da), 78% (Cry1F и Cry1D) и 45% (Cry1) в соответствии с «изменениями номенклатуры для пестицидных кристаллических белков Bacillus thuringiensis» («Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins», N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813). Такие пределы могут быть также применены только для коровых токсинов (для токсинов Cry1F и Cry1D).

Для специалистов в данной области очевидно, что гены, кодирующие активные токсины, могут быть идентифицированы и получены несколькими способами. Специфические гены или части генов, описанные в настоящей заявке, могут быть получены из изолятов, депонированных в депозитариях культур. Эти гены или их части или варианты могут быть также сконструированы путем синтеза, например, на синтезаторе генов. Варианты генов могут быть легко сконструированы стандартными методами получения точковых мутаций. Кроме того, фрагменты этих генов могут быть получены с использованием коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз в соответствии со стандартными процедурами. Так, например, для систематического отщепления нуклеотидов от концов этих генов могут быть использованы ферменты, такие как Bal31, либо может быть применен сайт-направленный мутагенез. Гены, кодирующие активные фрагменты, могут быть также получены с использованием различных рестриктирующих ферментов. Для непосредственного получения активных фрагментов этих белков-токсинов могут быть использованы протеазы.

Фрагменты и эквиваленты, которые сохраняют пестицидную активность описанных здесь токсинов, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, вследствие избыточности генетического кода, ряд различных последовательностей ДНК может кодировать описанные здесь аминокислотные последовательности. Специалист в данной области может легко получить такие альтернативные последовательности ДНК, кодирующие те же самые или, по существу, те же самые токсины. Такие варианты последовательностей ДНК входят в объем настоящего изобретения. Используемый здесь термин «по существу, те же самые» последовательности означает последовательности, которые имеют аминокислотные замены, делеции, добавления или инсерции, которые фактически не оказывают влияния на пестицидную активность. В это определение также входят фрагменты генов, кодирующих белки, сохраняющие пестицидную активность.

Другим методом идентификации генов, кодирующих токсины и части генов, используемых в настоящем изобретении, является применение олигонуклеотидных зондов. Такими зондами являются детектируемые нуклеотидные последовательности. Такие последовательности могут быть детектированы с помощью соответствующей метки, либо они могут быть изначально сделаны флуоресцентными, как описано в Международной заявке No. WO93/16094. Как хорошо известно специалистам, если молекула-зонд и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются посредством образования прочной связи между двумя молекулами, то разумно предположить, что такой зонд и образец будут обладать значительной гомологией. Гибридизацию, предпочтительно, проводят в жестких условиях с применением методов, хорошо известных специалистам, например, описанных Keller, G. Н., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Ниже приводятся некоторые примеры комбинаций концентраций соли и температур (в порядке возрастания жесткости): 2 х SSPE или SSC при комнатной температуре; 1 х SSPE или SSC при 42°C; 0,1 х SSPE или SSC при 42°C; 0,1 х SSPE или SSC при 65°C. Детектирование зонда представляет собой известный метод, применяемый для того, чтобы определить, происходит гибридизация или нет. Такой анализ с использованием зонда представляет собой быстрый метод идентификации токсин-кодирующих генов согласно изобретению. Нуклеотидные сегменты, используемые в качестве зондов согласно изобретению, могут быть синтезированы на синтезаторе ДНК в соответствии со стандартными процедурами. Эти нуклеотидные последовательности могут быть также использованы в качестве ПЦР-праймеров для амплификации генов согласно изобретению.

Варианты токсинов. Некоторые токсины согласно изобретению конкретно описаны в настоящей заявке. Поскольку эти токсины приводятся здесь просто в качестве примеров токсинов согласно изобретению, то следует отметить, что настоящее изобретение включает варианты токсинов или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), обладающие такой же пестицидной активностью, как и представленный здесь токсин, или аналогичной активностью. Эквивалентные токсины имеют аминокислотную последовательность, гомологичную аминокислотной последовательности представленного здесь токсина. Такая гомология аминокислотных последовательностей обычно составляет более чем 75%, предпочтительно, более чем 90%, а наиболее предпочтительно, более чем 95%. Гомология аминокислотных последовательностей является наивысшей в критических областях токсина, ответственных за биологическую активность или определяющих трехмерную конфигурацию, которая, в конечном счете, ответственна за биологическую активность. В соответствии с этим, некоторые аминокислотные замены являются допустимыми и могут присутствовать в тех областях, которые не играют важной роли в сообщении активности, или являются консервативными аминокислотными заменами, которые не влияют на трехмерную конфигурацию молекулы. Так, например, аминокислоты могут быть подразделены на следующие классы: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислотные. Таким образом, при консервативных заменах, аминокислоту одного класса заменяют другой аминокислотой того же типа, и такая замена входит в объем настоящего изобретения, при условии, что она, фактически, не будет влиять на биологическую активность соединения. Ниже представлен список примеров аминокислот, принадлежащих к каждому классу.

Таблица 1
Класс аминокислот	Примеры аминокислот
Неполярные	Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
Незаряженные полярные	Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
Кислотные	Asp, Glu
Основные	Lys, Arg, His

В некоторых случаях могут быть также сделаны неконсервативные замены. Важным фактором является то, что такие замены не должны значительно снижать биологическую активность токсина.

Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины согласно изобретению, могут быть введены микробным или растительным хозяевам широкого ряда. Экспрессия гена токсина приводит, прямо или опосоредованно, к продуцированию пестицида внутри клеток и его сохранению в этих клетках. Для получения штамма Bt, экспрессирующего оба токсина согласно изобретению, может быть применен конъюгативный и рекомбинантный перенос. Другие организмы-хозяева могут быть также трансформированы одним или обоими генами токсинов, используемыми для достижения синергического эффекта. С использованием подходящих микробов-хозяев, например, Pseudomonas, эти микробы могут быть внесены в места обитания вредителей, где они могут размножаться и поедать эти микробы. Это будет приводить к уничтожению вредителей. Альтернативно, микроб, содержащий ген токсина, может быть обработан в условиях, способствующих пролонгированию активности токсина и стабилизации клетки. Обработанная клетка, которая сохраняет токсическую активность, может быть затем внесена в среду обитания вредителей-мишеней.

Если ген токсина Bt вводят микробу-хозяину посредством подходящего вектора, и если указанный хозяин вносят в среду обитания в живом виде, то важно, чтобы были использованы определенные микробы-хозяева. При этом, выбирают такие микроорганизмы-хозяева, которые, как известно, занимают определенную «фитосферу» (филлоплан, филлосферу, ризосферу и/или ризоплан) одного или нескольких представляющих интерес культур. Эти микроорганизмы выбирают так, чтобы они обладали способностью успешно конкурировать в конкретных условиях (в культуре и в другой среде обитания насекомых) с микроорганизмами дикого типа, обеспечивали стабильное сохранение и экспрессию генов, кодирующих полипептид-пестицид, и желательно, обеспечивали лучшую защиту пестицида от разрушения и инактивации в условиях окружающей среды.

Известно, что большое число микроорганизмов обитает на филлоплане (на поверхности листьев растений) и/или на ризосфере (в почве, окружающей корни растений) ценных сельскохозяйственных культур широкого ряда. Такими микроорганизмами являются бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют такие микроорганизмы, как бактерии, например, бактерии рода Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes; грибы, а в частности, дрожжи, например, дрожжи рода Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды бактерий фитосфер, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii; и дрожжей-фитосфер, таких как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.

Для введения гена Bt, кодирующего токсин, микроорганизму-хозяину в условиях, обеспечивающих стабильное сохранение гена и стабильную экспрессию гена, могут быть применены методы широкого ряда. Такие методы хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в патенте США No. 5135867, который вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Обработка клеток. Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, экспрессирующие токсины Bt, могут быть обработаны в целях пролонгирования активности токсина и стабилизации клеток. Образующаяся пестицидная микрокапсула содержит токсин или токсины Bt в клеточной структуре, которая стабилизирует и защищает токсин в случае, когда эту микрокапсулу вносят в среду обитания вредителя-мишени. Подходящими клетками-хозяевами могут быть прокариоты или эукариоты, и такими клетками обычно являются, но не ограничиваются ими, клетки, которые не продуцируют вещества, являющиеся токсичными для высших организмов, таких как млекопитающие. Однако, могут быть также использованы и микроорганизмы, которые продуцируют вещества, токсичные для высших организмов, но, при этом, эти токсические вещества являются нестабильными, или уровень их введения является достаточно низким, что исключает возможность какого-либо токсического воздействия на млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев, особый интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы.

Обрабатываемые клетки обычно являются интактными и, по существу, находятся в пролиферативной форме, а не в форме спор, хотя, в некоторых случаях могут использоваться и споры.

Обработка микробных клеток, например, микробов, содержащих ген или гены токсина Bt, может быть осуществлена химическими и/или физическими методами, или комбинацией химических и физических методов, при условии, что такой метод не будет оказывать негативного влияния на свойства токсина и не будет приводить к снижению способности клеток защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галогенирующие агенты, а в частности, галогены с атомными номерами 17-80. Более конкретно, может быть использован йод в мягких реакционных условиях в течение определенного периода времени, достаточного для достижения желаемых результатов. Другими подходящими методами являются обработка альдегидами, такими как глутаральдегид; противоинфекционными агентами, такими как хлорид зефирана и хлорид цетилпиридиния; спиртами, такими как изопропиловый спирт и этанол; различными гистологическими фиксаторами, такими как йод Люголя, фиксатор Боуина; различные кислоты и фиксатор Хелли (см: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); или комбинацией физического метода (нагревания) и химических агентов, которые сохраняют и пролонгируют активность токсина, продуцируемого в клетках, введенных в среду обитания хозяина. Примерами физических методов являются коротковолновое излучение, такое как гамма-излучение и рентгеновское излучение, замораживание, УФ-облучение, лиофилизация и т.п. Методы обработки микробных клеток описаны в патентах США №№ 4695455 и 4695462, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Эти клетки обычно имеют повышенную структурную стабильность, что приводит к увеличению резистентности к условиям окружающей среды. Если пестицид присутствует в форме предшественника, то способ обработки клеток должен быть выбран так, чтобы он не приводил к ингибированию процессинга предшественника с образованием зрелой формы пестицида под действием патогена вредителя-мишени. Так, например, формальдегид будет обеспечивать перекрестное сшивание с белками, и тем самым ингибировать процессинг предшественника полипептидного пестицида. Способ обработки должен сохранять по меньшей мере значительную степень биологической доступности или биологической активности токсина.

Свойствами, представляющими особый интерес для продуцирования при выборе клетки-хозяина, являются простота введения гена или генов Bt хозяину, доступность экспрессионных систем, эффективность экспрессии, стабильность пестицида в хозяине и наличие дополнительных генетических признаков. Представляющими интерес технологическими свойствами пестицидных микрокапсул являются их защитная способность в отношении пестицида, например, толщина клеточных стенок, пигментация и внутриклеточная упаковка или способность образовывать тельца включения; выживаемость в водной среде; отсутствие токсичности для млекопитающих; привлекательность с точки зрения поедания вредителями; простота утилизации; фиксация без повреждения токсина и т.п. Другими рассматриваемыми свойствами являются простота приготовления препарата и его транспортировки, материальные затраты, стабильность при хранении и т.п.

Культивирование клеток. Клетки-хозяева, содержащие инсектицидный ген или гены B.t., могут быть выращены в любой подходящей питательной среде, в которой ДНК-конструкция будет обеспечивать селективное преимущество, то есть, обеспечивать селективную сред